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猪传染性胸膜肺炎放线杆菌ApxIC基因缺失突变株的构建

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第一部分 文献综述

1.1 猪传染性胸膜肺炎放线杆菌的病原学

1.2 猪传染性胸膜肺炎的流行病学及危害

1.3 胸膜肺炎放线杆菌毒素研究进展

1.4 猪传染性胸膜肺炎疫苗的研究进展

1.5 APP突变株构建方法的研究进展

1.6 正负双向筛选原理

1.7 研究的目的与意义

第二部分 实验研究

材料与方法

1 材料

2 方法

3 结果

4 讨论

5 结论

参考文献

致谢

附录Ⅰ

附录Ⅱ

附录Ⅲ

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摘要

猪传染性胸膜肺炎(PCP)是由胸膜肺炎放线杆菌(APP)引起的高度接触性呼吸道传染病，该病对我国的养猪业造成巨大的经济损失。目前疫苗免疫接种是预防和控制该病的主要措施之一，而生产上使用的全菌灭活疫苗和亚单位疫苗并不能降低其发病率，对异源血清型菌的感染也不能提供完全的交叉保护。APP的自然感染能够诱导动物机体产生抗异源血清型的保护，因此弱毒活疫苗研究是APP疫苗研究的重要研究方向。本试验进行了猪传染性胸膜肺炎放线杆菌ApxⅠC基因缺失减毒株的构建研究。
　　 APP正负筛选表达盒构建从APP5、枯草芽孢杆菌和质粒pEGFP-N1中分别PCR扩增omlA基因启动子(omlaP)、果聚糖蔗糖酶基因(sacB)和卡那霉素抗性基因(Kanr)，其基因大小分别为266bp、1422bp、795bp。试验分别将扩增到的omlaP、sacB和Kanr基因片段TA克隆至pMD19-T中，经PCR、酶切和测序鉴定正确后，按omlaP、sacB、Kanr的排列顺序酶切连接到载体pBluescriptⅡSK+的XhoⅠ与KpnⅠ酶切位点之间，构建成载体pBS-OSK，该载体上的omlaP、sacB、Kanr三个插入片段共同组成了正负筛选表达盒。经过卡那霉素抗性实验，表明含有pBS-OSK质粒的大肠杆菌具有Kan抗性；蔗糖敏感性实验表明含有pBS-OSK载体的大肠杆菌对蔗糖敏感。本试验表明成功构建了以卡那霉素抗性基因(Kanr)和枯草芽胞杆菌的果聚蔗糖酶基因(sacB)的正负双向筛选系统。
　　 重组转移载体pBOSK△IC的构建以APP5K17株基因组为模板，PCR扩增包括ApxⅠC基因上游2895bp和下游1434bp序列作为重组转移载体的左、右同源臂，将扩增到的片段TA克隆至pMD19-T，经PCR、酶切和测序鉴定正确后，酶切连接到载体pBS-OSK的SacⅠ、SaⅡ位点之间，经PCR和酶切鉴定正确，试验成功构建了缺失457bp的ApxⅠC基因的APP5K17株重组转移载体pBOSK△IC。
　　 2、APPApxⅠC基因缺失突变株的构建
　　 试验以电转化方法将重组转移质粒pBOSK△IC转化到APP血清5型k17株亲本菌，在TSB中培养3h后将细菌均匀涂布在含卡那霉素TSA平板培养18h，从平板上筛选具有卡那霉素抗性的菌落，再将具有卡那霉素抗性菌落接种到10％蔗糖的TSA平板鉴定对蔗糖的敏感性，在证实菌落Kan抗性、蔗糖敏感的菌做PCR鉴定。随机挑选一株鉴定正确的菌落接种于无卡那霉素的TSB培养基培养过夜，以促进第二次同源重组，把培养物稀释后涂布含10％蔗糖不含卡那霉素的TSA琼脂平板，将筛选的蔗糖抗性菌落转印到TSA-10％Sucrose-Kan平板，筛选对卡那霉素敏感、蔗糖抗性的菌落做PCR鉴定，最终筛选到一株鉴定正确的AxpIC基因缺失突变株(K17△IC)。遗传稳定性试验证实突变株在体外连续传10代基因能够稳定遗传。溶血活性试验证实突变株体外培养不表现溶血活性；细胞毒性试验证实突变株的细胞毒减弱：缺失株的LD50为1.12×109，亲本株LD50为6.09×107。这些表明构建的基因缺失减毒株毒力明显降低，为进一步以此突变株作为基因工程弱毒活疫苗株的研究奠定了一定的基础。

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