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哇巴因对血管内皮细胞ECV304细胞凋亡及胞内游离钙离子和活性氧浓度的影响

         
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目的 研究哇巴因(毒毛花苷G)对人脐静脉血管内皮细胞ECV304凋亡的诱导作用,并探讨其可能的作用机制.方法 哇巴因0.01,0.05,0.1,0.5,1和10μmol·L-1与ECV304细胞作用24,48和72 h,MTT法检测细胞存活率,Hoechst33342/碘化丙锭双荧光染色法和流式细胞仪检测细胞凋亡百分率,激光共聚焦显微镜观察细胞内游离Ca2+浓度([Ca2+]i)和活性氧(ROS)浓度,逆转录PCR和Western印迹法检测胱天蛋白酶3 mRNA和蛋白表达.结果 哇巴因在0.01～10μmol·L-1浓度范围内与ECV304细胞分别作用24,48和72 h,对细胞存活的抑制率明显增加,且呈浓度和时间依赖性,24,48和72 h浓度-效应相关系数分别为0.984,0.994和0.997(P<0.05);哇巴因作用24,48和72 h的IC50值分别为0.624,0.184和0.041 μmol·L-1,时间-效应相关系数为0.974(P<0.05).哇巴因0.1 μmol·L-1与ECV304细胞作用24 h,细胞凋亡百分率由正常对照组的(4.2±0.5)%升高到(26.0±3.2)%,作用48 h,细胞凋亡率由(4.7±0.5)%升高到(36.5±5.3)%,差异有统计学意义(n=3,P<0.01);同时细胞出现染色质凝集.哇巴因0.01,0.1和0.5 μmol·L-1分别与ECV304细胞作用12,24和36 h,[Ca2+];和ROS浓度呈浓度和时间依赖性增加,在哇巴因0.5 μmol·L-1时[Ca2+];和ROS浓度的时间.效应相关系数分别为0.912和0.924,作用36 h时[Ca2+];和ROS浓度的浓度-效应相关系数分别为0.889和0.907(P<0.05).逆转录PCR和western印迹法分析显示,哇巴因0.1和0.5μmol·L-1作用ECV304细胞24 h后,胱天蛋白酶3 mRNA表达增加,差异有统计学意义(P<0.05);哇巴因0.01,0.1和0.5μmol·L-1作用ECV304细胞24 h,胱天蛋白酶3蛋白表达明显增加,差异有统计学意义(P<0.05).结论 哇巴因可诱导人脐静脉血管内皮细胞ECV304凋亡,其机制可能与增加[Ca2+]i和ROS浓度及胱天蛋白酶3表达有关.

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