FANCJ在HEK293T细胞中的表达 、纯化及活性检测

袁濮玉; 刘松柏; 撖荣; 杜佳慧; 储小玲; 吴洁; 杨凡; 苏倩; 邱桥成; 薛胜利

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目的构建包含FANCJ野生型(wt)及其突变体N196S蛋白的真核表达载体,并对纯化的野生型蛋白及突变体蛋白进行活性检测.方法从HEK293T中提取RNA,并反转录为cDNA,使用带有3xFlag标签序列的特异性引物通过PCR方法扩增出人FANCJ编码区全长,并克隆到plvx-EF1-MCS-PGK-PURO载体上;突变体N196S利用NEBaseChangerTM引物设计工具,并利用NEB公司的点突变构建试剂盒Q5?Site-Directed Mutagenesis Kit技术进行操作.重组的FANCJ及突变体N196S表达质粒通过脂质体polyJet转染到HEK293T细胞中进行表达.使用免疫沉淀及竞争洗脱的方法纯化FANCJ及N196S突变体蛋白.利用荧光标记DNA底物的方法检测FANCJ及N196S突变体蛋白的DNA解旋酶活性.结果 FANCJw t基因及N196S突变体全长编码序列成功构建到plvx-EF1-MCS-PGK-PURO载体上,蛋白质印迹法(Western blot)及PAGE胶银染方法成功检测到了FANCJwt及N196S突变体蛋白的表达、纯化,荧光标记Oligo DNA底物方法发现FANCJwt与N196S突变体蛋白DNA解旋酶活性存在差异.结论成功构建了FANCJwt及N196S突变体真核表达载体,通过生化实验发现FANCJ及N196S突变体蛋白存在差异的DNA解旋酶活性.

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来源
《重庆医学》 |2018年第36期|4584-4587|共4页
作者
袁濮玉; 刘松柏; 撖荣; 杜佳慧; 储小玲; 吴洁; 杨凡; 苏倩; 邱桥成; 薛胜利;
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作者单位

苏州卫生职业技术学院苏州检验医学生物技术重点实验室 215009;

苏州卫生职业技术学院苏州检验医学生物技术重点实验室 215009;

苏州大学附属第一医院血液科;

苏州 215006;

苏州卫生职业技术学院苏州检验医学生物技术重点实验室 215009;

苏州大学附属第一医院血液科;

苏州 215006;

苏州卫生职业技术学院苏州检验医学生物技术重点实验室 215009;

苏州卫生职业技术学院苏州检验医学生物技术重点实验室 215009;

苏州卫生职业技术学院苏州检验医学生物技术重点实验室 215009;

苏州大学附属第一医院血液科;

苏州 215006;

苏州大学附属第一医院血液科;

苏州 215006;

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原文格式 PDF
正文语种 chi
中图分类酶的分离与提纯;
关键词
FANCJ; 突变体; 蛋白纯化; 活性检测;

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