一种来源于瘤胃细菌产琥珀酸丝状杆菌β-葡聚糖酶基因的优化、表达及其应用

技术领域

本发明属于生物基因工程及酶工程领域。特别是涉及一种来源于瘤胃细菌产琥珀酸丝状杆菌β-葡聚糖酶基因的优化、表达及其应用。 

背景技术

我国是一个人口大国，也是一个农业大国。在以畜牧业为主的农业大国里，人畜争粮的矛盾十分突出，饲料原料资源的严重匮乏阻碍了畜牧业的发展。要保持我国畜牧业的持续发展，必须首先解决好饲料问题。对于单胃动物而言，解决人畜争粮问题的途径是开发利用非常规饲料，即降低玉米在饲粮配方中的比例而增加麸皮、大麦等饲料原料的比重。对于反刍家畜来说，充分利用农区大量农作物秸秆资源则有助于解决这一问题。但是，麦类和农作物秸秆中均含较高比例的非淀粉多糖（NSP，non-starch polysaccharides），如β-葡聚糖、阿拉伯木聚糖等，因此妨碍其消化吸收，造成畜禽动物饲料利用率降低、生长受阻以及排泄粘粪、污染环境等。麦类饲料从营养组成上，其潜在的营养价值较高，有些营养成分甚至高于玉米，但含量较高的水溶性NSP限制了其在畜禽饲料中的广泛应用。

β-葡聚糖是植物细胞壁的多糖成分。由于β-葡聚糖会包裹一些营养物质，使消化酶不能接触底物，从而降低饲料的营养价值。同时，某些β-葡聚糖如β-1,3-1,4-葡聚糖具有水溶性，可以使饲料在动物肠道中具有很大的黏性，给动物的生长和生产带来负面影响。饲料中添加β-葡聚糖酶可有效降解β-葡聚糖的抗营养作用。

目前，用于工业和畜牧业的β-葡聚糖酶一般来自于可培养环境微生物的固体培养物，较典型的有芽孢杆菌属、木霉属以及青霉属等。普遍认为，可培养微生物只占自然界微生物的1％，那么剩余的99％的不可培养的微生物中蕴藏着大量的β-葡聚糖酶资源，其中很可能存在高活力、更适宜动物消化道的β-葡聚糖酶。这为寻找和筛选新的β-葡聚糖酶类提供了一条新的途径。

反刍动物瘤胃被认为是目前转化NSP效率最高的生物反应器。瘤胃中栖居了大量的细菌、真菌和原虫，其中细菌和真菌是降解纤维质的主体生物。目前，针对瘤胃纤维降解微生物资源以及基因资源的发掘研究工作正在逐渐成为酶学领域的研究热点。

产琥珀酸丝状杆菌（Fibrobacter succinogenes）是反刍家畜瘤胃中降解植物细胞壁的主要微生物之一。从该细菌中先后分离出数种降解纤维素和半纤维素的酶类。由产琥珀酸丝状杆菌产生的β-1,3-1,4-葡聚糖酶（E.C.3.2.1.73，简称β-葡聚糖酶）被认为是比活力最高的。然而由于产琥珀酸丝状杆菌属于厌氧细菌，培养条件苛刻，因此其在工业上还未得到应用。

基因工程技术是目前大量获得目的蛋白的常用方法。常用的表达系统有大肠杆菌表达系统、酵母菌表达系统等。吕文平等（2004）从地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis）基因组DNA中获得了β-1,3-1,4-葡聚糖酶基因，在大肠杆菌中表达后，酶活力为67.34 U/mL，其活力是出发菌的60倍（吕文平，许梓荣，杜文理，李卫芬，孙建义. 地衣芽孢杆菌β-1,3-1,4-葡聚糖酶基因的克隆和表达. 农业生物技术学报，2004，12（4）：446-449）。李永仙等（2009）则对来源于淀粉液化芽孢杆菌Bacillus amyloliquefaciens BS5582的β-1,3-1,4-葡聚糖酶基因进行了表达，通过培养条件的优化，该基因在大肠杆菌中表达的最高活力为1883.3 U/mL（李永仙，谢焱，朱林江，张一心，顾国贤，李崎. 淀粉液化芽孢杆菌β-1,3-1,4-葡聚糖酶基因的克隆及表达. 生物工程学报，2009，25(4): 542-548）。毕赤酵母表达系统因其培养条件简单、表达水平高、分泌表达、遗传稳定等特点，被用于多种蛋白质的表达。樊英等（2007）利用表达载体pPIC9k在毕赤酵母GS115表达了地衣芽孢杆菌β-1,3-1,4-葡聚糖酶，酶活力最高达333.7U/mL，比活力为1334.8 U/mg（樊英. 地衣芽袍杆菌来源β-1,3-1,4-葡聚糖酶基因克隆、改造及其表达. 2007，中国农业科学院学位论文）。

Shyur等（2000）最早利用基因工程技术在大肠杆菌BL21（DE3）中表达产琥珀酸丝状杆菌β-1,3-1,4-葡聚糖酶基因，通过去除C端部分氨基酸以提高β-1,3-1,4-葡聚糖酶的热稳定性（专利号：US7037696 B1）。Wen等（2005）则尝试在大肠杆菌和毕赤酵母X-33中表达产琥珀酸丝状杆菌β-1,3-1,4-葡聚糖酶基因，在毕赤酵母中该基因的表达水平为1940 U/mL，要高于大肠杆菌中的表达水平（Wen Tuan-Nan, Chen Jui-Lin, Lee Shu-Hua, Yang Ning-Sun, and Shyur Lie-Fen. A truncated Fibrobacter succinogenes 1,3-1,4-β-D-glucanase with improved enzymatic activity and thermotolerance. Biochemistry. 2005, 44(25), 9197-9205）。在国内利用基因工程技术表达产琥珀酸丝状杆菌β-1,3-1,4-葡聚糖酶基因的文献和专利还未见报道。

开展NSP水解酶基因资源的发掘与利用对于畜牧业开发非常规饲料资源和农作物秸秆的高效利用，缓解粮食短缺危机及环境污染危机具有重要意义；同时对于生物质能源开发缓解能源危机也具有深远意义；另外，开展相关研究对于纺织、食品、酿酒、医药、造纸等工业领域的发展也具有积极的推动作用。

发明内容

本发明的目的是提供一种人工合成编码的产琥珀酸丝状杆菌β-1,3-1,4-葡聚糖酶GLUm（简称β-葡聚糖酶GLUm）优化的核苷酸序列。

本发明的另一目的是提供包含上述优化的产琥珀酸丝状杆菌β-葡聚糖酶基因的重组载体。

本发明的另一目的是提供包含上述优化的产琥珀酸丝状杆菌β-葡聚糖酶基因的重组毕赤酵母菌株。

本发明的另一目的是提供制备上述优化的产琥珀酸丝状杆菌β-葡聚糖酶的方法，该方法包括以下步骤：

（1）采用全基因合成方法获得SEQ ID No. 3所示核苷酸序列；

（2）构建含有SEQ ID No. 3所示核苷酸序列的表达载体pPIC9K-GLUm；

（3）将重组载体pPIC9K-GLUm转化宿主细胞GS115，获得重组菌株；以及

（4）纯化所表达的β-葡聚糖酶。

所述宿主细胞为毕赤酵母GS115。

本发明的另一目的是上述优化的产琥珀酸丝状杆菌β-葡聚糖酶用于非治疗目的降解β-葡聚糖的应用。

本发明的有益效果：本发明提供了产琥珀酸丝状杆菌β-葡聚糖酶，其氨基酸序列如SEQ ID No.1所示，该酶蛋白由349个氨基酸组成，理论等电点PI为6.67，分子量为37737.75道尔顿。本发明涉及的产琥珀酸丝状杆菌β-葡聚糖酶，其原始核苷酸序列如序列表SEQ ID No.2所示，命名为GLU。为提高产琥珀酸丝状杆菌β-葡聚糖酶的表达水平，本发明根据毕赤酵母密码子的利用效率、密码子的简并性以及基因的GC含量等对该基因的密码子进行了优化。本发明涉及的产琥珀酸丝状杆菌β-葡聚糖酶，其优化后的核苷酸序列如序列表SEQ ID No.3所示，命名为GLUm。经检测，产琥珀酸丝状杆菌β-葡聚糖酶基因GLU在50 mL试管中表达的活力达到33.4 U/mL，经密码子优化后的β-葡聚糖酶基因GLUm在试管中表达的活力达到41.8 U/mL，较优化前酶活力至少提高25.1%，远高于预估的技术水平及效果。

GLUm在10 L发酵罐中诱导培养96 h时的活力为6424 U/mL，培养物经干燥后达到123.6 g/L，活力达到51976 U/g干培养物，与现有技术记载的水平相比有明显提高。

本发明还提供了一种纯化所表达的葡聚糖酶GLUm的方法。酶学性质研究表明：纯化后重组产琥珀酸丝状杆菌β-葡聚糖酶的最适反应温度为37℃，最适反应pH为5.0，比活力为10397 U/mg。重组产琥珀酸丝状杆菌β-葡聚糖酶在pH5.0、温度在20~37℃时最为稳定。底物特异性研究表明：重组产琥珀酸丝状杆菌β-葡聚糖酶可水解地衣多糖和大麦葡聚糖，活力分别为1352 U/mL和9583 U/mL；不降解桦木木聚糖、燕麦木聚糖和羧甲基纤维素钠。

在胰蛋白酶和胃蛋白酶共同作用60 min时，仍保留50.5%的酶活力，这是大大高于现有技术资料所记载的参数水平。 

附图说明

下面结合附图对本发明作进一步的说明。

图1产琥珀酸丝状杆菌β-葡聚糖酶基因优化前后表达的酶活力；

图2平板刚果红法鉴定重组产琥珀酸丝状杆菌β-葡聚糖酶活力；

图3重组毕赤酵母培养上清的SDS-PAGE电泳图谱；

图4 重组产琥珀酸丝状杆菌β-葡聚糖酶在10L发酵罐中酶活力变化曲线；

图5 重组毕赤酵母在10L发酵罐中菌体湿重和干重的变化曲线；

图6 葡聚糖凝胶层析蛋白质洗脱曲线；

图7 重组产琥珀酸丝状杆菌β-葡聚糖酶的最适反应温度；

图8 重组产琥珀酸丝状杆菌β-葡聚糖酶的最适反应pH值；

图9 重组产琥珀酸丝状杆菌β-葡聚糖酶的温度稳定性；

图10 重组产琥珀酸丝状杆菌β-葡聚糖酶的pH稳定性；

图11 重组产琥珀酸丝状杆菌β-葡聚糖酶的底物特异性；

图12 重组产琥珀酸丝状杆菌β-葡聚糖酶对胃蛋白酶和胰蛋白酶的耐受性。

具体实施方式

以下实施例中未作具体说明的分子生物学方法均参照《分子克隆实验指南》（第三版）中所列的具体方法进行，或者按照产品说明书进行。

实施例1、产琥珀酸丝状杆菌β-葡聚糖酶基因的优化与合成。

在GenBank中检索出产琥珀酸丝状杆菌β-葡聚糖酶基因序列（登录号：M33676）。选取产琥珀酸丝状杆菌β-葡聚糖酶成熟肽编码区，根据毕赤酵母密码子的利用效率、密码子的简并性、基因的GC含量，对该编码区进行密码子优化。Java Codon Adaptation Tool (JCat)软件分析优化后的核苷酸序列相对优化度（CAI）由0.088提高到0.976，GC含量由68.57%下降到49.06%。利用RNAStructure 5.3软件对优化前后的最低自由能进行分析，最低自由能由-240.1 KJ/mol下降到-255.8 KJ/mol。

优化后的序列送交上海生工生物工程有限公司进行合成，DNA测序确认合成的序列为1050 bp。

实施例2、包含产琥珀酸丝状杆菌β-葡聚糖酶基因的毕赤酵母工程菌的构建。

优化后的产琥珀酸丝状杆菌β-葡聚糖酶基因和毕赤酵母表达载体pPIC9K（购自美国Invitrogen公司）用EcoR I和Not I双酶切，酶切产物采用DNA纯化试剂盒（天根生化科技（北京）有限公司）进行回收纯化。纯化的目的基因和表达载体采用T4 DNA连接酶进行连接，转化大肠杆菌DH5α，经菌落PCR和限制性内切酶鉴定获得重组表达载体pPIC9K-GLUm。采用SacI分别对pPIC9K-GLU和pPIC9K-GLUm线性化，电击转化毕赤酵母GS115感受态细胞（购自美国Invitrogen公司）。将转化后的菌液涂布在MD平板上，于28～30℃培养48 h。

挑选生长正常的菌落进行甲醇利用表型鉴定。对甲醇利用表形正确的克隆通过遗传霉素G418筛选获得含高拷贝目的基因的重组酵母工程菌。

实施例3、产琥珀酸丝状杆菌β-葡聚糖酶GLU和GLUm活力比较。

从抗4 mg/mL遗传霉素G418的克隆中随机挑选15个，分别在50 mL试管中接种于5 mL BMGY培养基中，28～30℃振荡培养24 h，加入甲醇至终点浓度为0.5％诱导培养48 h。培养结束后收集培养上清用于测定酶活力。

优化前后产琥珀酸丝状杆菌β-葡聚糖酶活力如图1所示，优化前产琥珀酸丝状杆菌β-葡聚糖酶基因GLU表达的酶活力为33.4 U/mL，优化后β-葡聚糖酶基因GLUm表达的酶活力为41.8 U/mL，比优化前提高25.1%。

实施例4、重组产琥珀酸丝状杆菌β-葡聚糖酶的活性测定。

采用DNS法测定β-葡聚糖酶活力。取适当稀释的酶液200 μL，0.8%的大麦葡聚糖（Sigma）400 μL，于37℃反应5 min，立即加入1 mL DNS，振荡混匀后于95℃水浴5min显色。自来水冷却后加入3.4 mL去离子水，振荡混匀后于540 nm处测定吸光度。

同时，设置对照样品，即取适当稀释的酶液200 μL，DNS 1 mL，0.8%的大麦葡聚糖400 μL，于37℃反应5 min后于95℃水浴5min显色。自来水冷却后加入3.4 mL去离子水，振荡混匀后于540 nm处测定吸光度。

1个酶活力单位（U）定义为：在pH5.0、37℃条件下，每分钟水解产生1 μmol葡萄糖所需要的酶量。

实施例5、产琥珀酸丝状杆菌β-葡聚糖酶GLUm重组菌株的高效表达。

（1）种子液的准备

取 -80℃冷冻保存液1 mL，室温解冻后接种至盛有100 mL YPD培养基的500 mL三角瓶中，于28～30℃，150～300 rpm，振荡培养24～48h。

（2） 发酵罐和培养基的灭菌

按照说明书分别对空气管道和发酵罐（10L）进行灭菌。配制6L FM22培养基（42.9 g KH₂PO₄，5.0 g (NH₄)₂SO₄，1.0 g CaSO₄·2H₂O，14.3 g K₂SO₄，11.7 g MgSO₄·7H₂O，40.0 g 甘油，2 mL消泡剂，加水溶解定容至1 L），灭菌后用KOH调节pH到4.5～5.0后加入过滤除菌的PMT4溶液（2.0 g CuSO₄·5H₂O，0.08 g NaI，3.0 g MnSO₄·H₂O，0.2 g Na₂ MoO₄·2H₂O，0.02 g H₃BO₃，0.5 g CaSO₄·2H₂O，0.5 g CoCl₂，7.0 g ZnCl₂，22.0 g FeSO₄·7H₂O，0.2 g biotin，1 mL 浓硫酸，加水溶解定容至1 L）6 mL。

（3）菌体生长阶段

用30%的NH₄OH将培养基调至pH4.5~5.0；按照10％的比例加入种子液，控制溶氧（DO）在 35%左右，搅拌转速500 ～800 rpm，通气量5～10 L/min，培养温度28~30℃，罐压0.03~0.06 MPa，培养20 h，以耗尽甘油。

（4）添加甘油生长阶段

流加50％的甘油4h，流速为15 mL/L·h，控制DO在30~35%之间。培养温度28～30℃，罐压0.03~0.06MPa，pH4.5~5.0。

（5）诱导阶段

甲醇流加的初始速度为3.5～5 mL/L·h，48 h后逐渐增大到11-12 mL/L·h，持续72h。发酵搅拌速度为600~800 rpm, 培养温度为28～30℃, 培养基pH4.5~5.0，60%>OD>35%，通气量为>9 L/min。

在发酵过程中每12 h取样测定酶活力、菌体湿重和干重。同时取0、36 h和96 h的样品平板刚果红法定性判断β-葡聚糖酶的活力。另外，取诱导培养后的0、12、24、36、48、72、84和96 h时的样品进行SDS-PAGE电泳。

平板刚果红法定性判断β-葡聚糖酶活力的结果见图2，在诱导0 h时无β-葡聚糖酶活性，36 h时的透明圈小于96 h时的透明圈，表明96 h时的活力高于36 h时。

不同时间点样品的SDS-PAGE结果见图3所示，随着诱导时间的延长培养上清中分子量介于44.3～29 KD有一条明显的蛋白质条带，与本发明中β-葡聚糖酶的理论分子量接近。

发酵过程中β-葡聚糖酶的活性如图4所示，在发酵第96 h时发酵液中的酶活力为6424 U/mL。发酵过程中菌体湿重和干重随时间的变化曲线如图5所示，在发酵第96 h时菌体湿重和干重达到最大值，为274.6 g/L和123.6 g/L，活力达到51976 U/g干培养物。

实施例6、重组产琥珀酸丝状杆菌β-葡聚糖酶的纯化。

取适量充分膨胀的G-75葡聚糖凝胶填装100 cm层析柱，经磷酸钠-柠檬酸缓冲溶液（pH5.0）平衡后用加入1 mL样品，打开流出口，使样品缓慢的渗入凝胶床内，然后连接好恒流泵和部分收集器，保持流速恒定，每管收集1 min，收集洗脱样品测定在280 nm处吸光度，直至恒定不变关闭仪器结束纯化。根据OD280值将处于同一吸收峰的样品进行合并，并测定合并样品的酶活力。

结果如图6所示，重组产琥珀酸丝状杆菌β-葡聚糖酶酶活力集中在第60～80管。纯化后的β-葡聚糖酶比活力达到10397 U/mg。

实施例7、重组产琥珀酸丝状杆菌β-葡聚糖酶的酶学性质。

（1）最适反应温度及最适反应pH值

最适反应温度：取适量纯化后酶液，分别在20℃、30℃、37℃、40℃、50℃、60℃、70℃、80℃、90℃、100℃条件下测定酶活。

最适反应pH值：取适量纯化后酶液，分别在pH为2.2、3.0、4.0、5.0、5.6、6.0、6.5、7.0、8.0、9.0、10.0、10.6时在最适温度条件下测定酶活。

结果如图7和图8所示，该重组β-葡聚糖酶的最适反应温度为37℃，最适反应pH为5.0。

（2）温度稳定性及pH值的稳定性

温度稳定性：取适量纯化后酶液，分别在20℃、30℃、37℃、40℃、50℃、60℃、70℃、80℃、90℃、100℃条件下保持30 min，以未处理的酶液为对照，在相应温度及pH值条件下测定其剩余酶活力。

pH值稳定性：取适量纯化后酶液，分别在pH为2.2、3.0、4.0、5.0、5.6、6.0、6.5、7.0、8.0、9.0、10.0、10.6下保持30 min，在最适温度及pH值条件下测定其剩余酶活力。

结果如图9和图10所示，该重组β-葡聚糖酶在pH5.0、温度在20~37℃时最为稳定。（3）底物特异性

取适量纯化后酶液，分别以大麦β-葡聚糖，地衣多糖，羧甲基纤维素钠，燕麦木聚糖和桦木木聚糖为底物在最适温度及pH值条件下测定酶活。

结果见图11，该重组β-葡聚糖酶可水解地衣多糖和大麦葡聚糖，活力分别为1352 U/mL和9583 U/mL；不降解燕麦木聚糖、桦木木聚糖和羧甲基纤维素钠。

实施例8、重组产琥珀酸丝状杆菌β-葡聚糖酶对胃蛋白酶和胰蛋白酶的耐受性。

取适量酶液，分别加入适量胃蛋白酶（用pH为4.0的缓冲液配制，每1 mL含胃蛋白酶活力2500 U）和胰蛋白酶（用pH为6.0的缓冲液配制，每1 mL含胰蛋白酶活力40 U）（模拟家禽消化道内环境），在37℃分别保温0 min、10 min、30 min、60 min、120 min，测定残余酶活。

结果如图12所示，该重组β-葡聚糖酶在胰蛋白酶和胃蛋白酶共同作用60 min时，仍保留50.5%的酶活力。 

序列表

<110>  新疆农业大学

<120>  一种来源于瘤胃细菌产琥珀酸丝状杆菌β-葡聚糖酶基因的优化、表达及其应用

<160>  3    

<170>  PatentIn version 3.5

<210>  1

<211>  349

<212>  PRT

<213>  产琥珀酸丝状杆菌（Fibrobacter succinogenes）

<400>  1

Met Asn Ile Lys Lys Thr Ala Val Lys Ser Ala Leu Ala Val Ala Ala

1               5                   10                  15     

Ala Ala Ala Ala Leu Thr Thr Asn Val Ser Ala Lys Asp Phe Ser Gly

            20                  25                  30         

Ala Glu Leu Tyr Thr Leu Glu Glu Val Gln Tyr Gly Lys Phe Glu Ala

        35                  40                  45             

Arg Met Lys Met Ala Ala Ala Ser Gly Thr Val Ser Ser Met Phe Leu

    50                  55                  60                 

Tyr Gln Asn Gly Ser Glu Ile Ala Asp Gly Arg Pro Trp Val Glu Val

65                  70                  75                  80 

Asp Ile Glu Val Leu Gly Lys Asn Pro Gly Ser Phe Gln Ser Asn Ile

                85                  90                  95     

Ile Thr Gly Lys Ala Gly Ala Gln Lys Thr Ser Glu Lys His His Ala

            100                 105                 110        

Val Ser Pro Ala Ala Asp Gln Ala Phe His Thr Tyr Gly Leu Glu Trp

        115                 120                 125            

Thr Pro Asn Tyr Val Arg Trp Thr Val Asp Gly Gln Glu Val Arg Lys

    130                 135                 140                

Thr Glu Gly Gly Gln Val Ser Asn Leu Thr Gly Thr Gln Gly Leu Arg

145                 150                 155                 160

Phe Asn Leu Trp Ser Ser Glu Ser Ala Ala Trp Val Gly Gln Phe Asp

                165                 170                 175    

Glu Ser Lys Leu Pro Leu Phe Gln Phe Ile Asn Trp Val Lys Val Tyr

            180                 185                 190        

Lys Tyr Thr Pro Gly Gln Gly Glu Gly Gly Ser Asp Phe Thr Leu Asp

        195                 200                 205            

Trp Thr Asp Asn Phe Asp Thr Phe Asp Gly Ser Arg Trp Gly Lys Gly

    210                 215                 220                

Asp Trp Thr Phe Asp Gly Asn Arg Val Asp Leu Thr Asp Lys Asn Ile

225                 230                 235                 240

Tyr Ser Arg Asp Gly Met Leu Ile Leu Ala Leu Thr Arg Lys Gly Gln

                245                 250                 255    

Glu Ser Phe Asn Gly Gln Val Pro Arg Asp Asp Glu Pro Ala Pro Gln

            260                 265                 270        

Ser Ser Ser Ser Ala Pro Ala Ser Ser Ser Ser Val Pro Ala Ser Ser

        275                 280                 285            

Ser Ser Val Pro Ala Ser Ser Ser Ser Ala Phe Val Pro Pro Ser Ser

    290                 295                 300                

Ser Ser Ala Thr Asn Ala Ile His Gly Met Arg Thr Thr Pro Ala Val

305                 310                 315                 320

Ala Lys Glu His Arg Asn Leu Val Asn Ala Lys Gly Ala Lys Val Asn

                325                 330                 335    

Pro Asn Gly His Lys Arg Tyr Arg Val Asn Phe Glu His

            340                 345                

<210>  2

<211>  1050

<212>  DNA

<213>  产琥珀酸丝状杆菌（Fibrobacter succinogenes）

<400>  2

atgaacatca agaaaactgc agtcaagagc gctctcgccg tagcagccgc agcagcagcc    60

ctcaccacca atgttagcgc aaaggatttt agcggtgccg aactctacac gttagaagaa   120

gttcagtacg gtaagtttga agcccgtatg aagatggcag ccgcatcggg aacagtcagt   180

tccatgttcc tctaccagaa tggttccgaa atcgccgatg gaaggccctg ggtagaagtg   240

gatattgaag ttctcggcaa gaatccgggc agtttccagt ccaacatcat taccggtaag   300

gccggcgcac aaaagactag cgaaaagcac catgctgtta gccccgccgc cgatcaggct   360

ttccacacct acggtctcga atggactccg aattacgtcc gctggactgt tgacggtcag   420

gaagtccgca agacggaagg tggccaggtt tccaacttga caggtacaca gggactccgt   480

tttaaccttt ggtcgtctga gagtgcggct tgggttggcc agttcgatga atcaaagctt   540

ccgcttttcc agttcatcaa ctgggtcaag gtttataagt atacgccggg ccagggcgaa   600

ggcggcagcg actttacgct tgactggacc gacaattttg acacgtttga tggctcccgc   660

tggggcaagg gtgactggac atttgacggt aaccgtgtcg acctcaccga caagaacatc   720

tactccagag atggcatgtt gatcctcgcc ctcacccgca aaggtcagga aagcttcaac      780

ggccaggttc cgagagatga cgaacctgct ccgcaatctt ctagcagcgc tccggcatct      840

tctagcagtg ttccggcaag ctcctctagc gtccctgcct cctcgagcag cgcatttgtt       900

ccgccgagct cctcgagcgc cacaaacgca atccacggaa tgcgcacaac tccggcagtt    960

gcaaaggaac accgcaatct cgtgaacgcc aagggtgcca aggtgaaccc gaatggccac   1020

aagcgttatc gcgtgaactt tgaacactaa                                  1050

<210>  3

<211>  1050

<212>  DNA

<213>  人工序列

<220>

<223>根据毕赤酵母对密码子的偏好性而设计，以用作表达β-葡聚糖酶的核苷酸序列。

<400>  3

atgaacatca agaagactgc tgttaagtct gctttggctg ttgctgctgc tgctgctgct    60

ttgactacta acgtttctgc taaggacttc tctggtgctg aattgtacac tttggaagaa    120

gttcaatacg gtaagttcga agctagaatg aagatggctg ctgcttctgg tactgtttct    180

tctatgttct tgtaccaaaa cggttctgaa atcgctgacg gtagaccatg ggttgaagtt    240

gacatcgaag ttttgggtaa gaacccaggt tctttccaat ctaacatcat cactggtaag    300

gctggtgctc aaaagacttc tgaaaagcac cacgctgttt ctccagctgc tgaccaagct   360

ttccacactt acggtttgga atggactcca aactacgtta gatggactgt tgacggtcaa    420

gaagttagaa agactgaagg tggtcaagtt tctaacttga ctggtactca aggtttgaga    480

ttcaacttgt ggtcttctga atctgctgct tgggttggtc aattcgacga atctaagttg      540

ccattgttcc aattcatcaa ctgggttaag gtttacaagt acactccagg tcaaggtgaa     600

ggtggttctg acttcacttt ggactggact gacaacttcg acactttcga cggttctaga     660

tggggtaagg gtgactggac tttcgacggt aacagagttg acttgactga caagaacatc   720

tactctagag acggtatgtt gatcttggct ttgactagaa agggtcaaga atctttcaac      780

ggtcaagttc caagagacga cgaaccagct ccacaatctt cttcttctgc tccagcttct      840

tcttcttctg ttccagcttc ttcttcttct gttccagctt cttcttcttc tgctttcgtt             900

ccaccatctt cttcttctgc tactaacgct atccacggta tgagaactac tccagctgtt        960

gctaaggaac acagaaactt ggttaacgct aagggtgcta aggttaaccc aaacggtcac     1020

aagagataca gagttaactt cgaacactaa                                 1050