分泌抗血管生成抗体支架和可溶性受体的细胞系及其用途

相关申请

本申请要求2010年12月2日提交的U.S.S.N. 61/419,138的优先权，所述申请通过引用以其整体结合到本文中。

发明领域

本发明总的来说涉及包封细胞疗法(encapsulated cell therapy)领域。

发明背景

可以通过向患者供应由活细胞产生的一种或多种生物活性分子或通过从患者中除去由活细胞代谢的有害因子来医治或减轻许多临床病况、缺陷和疾病状态。在许多情况下，这些分子可恢复或抵偿器官或组织功能的损害或损失。因此，许多研究人员试图通过移植提供分泌产物或影响代谢功能的完整器官、器官组织和/或细胞，来重构器官或组织功能。然而，虽然这类移植可提供显著益处，但是在其应用中受到限制，因为对于移植是合适且是可得到的器官数目相对较少。此外，移植患者一般必须受免疫抑制以避免移植物的免疫排斥，免疫排斥引起移植物功能丧失和移植组织或细胞最终坏死。同样地，在许多情况下，移植必须长期保持功能，甚至是患者有生之年。保持患者处于免疫抑制状态持续相当的时间既是不希望的又是昂贵的。

在一个实例中，其中仍需要其它有效疗法的是危及视力的眼部病症。在治疗这类疾病中的一个主要问题是因存在血-视网膜屏障而无法将治疗剂递送至眼部，以及以治疗有效浓度将其保持在眼部。

许多生长因子在眼部疾病的治疗中已显示出希望。例如，已表明在各种动物模型中，BDNF和CNTF减缓视网膜神经节细胞的变性并减少光感受器的退化。参见例如Genetic Technology News，第13卷，第1期(1993年1月)。另外，已表明神经生长因子在视神经切开术后提高视网膜神经节细胞存活，并且还表明在缺血后促进视网膜神经元恢复。参见例如Siliprandi等，Invest. Ophthalmol. & Vis. Sci., 34, 第3232-3245页(1993)。最近，设计出基于抗体支架(antibody scaffold)的生物制剂，并用于眼病症，包括例如完全抗体(例如贝伐单抗)和抗体支架Fab片段(例如雷珠单抗(Ranibizumab))和免疫球蛋白Fc (例如阿柏西普(Aflibercept))。

移植程序的一个可取的替代方式是植入物理屏障(physical barrier)内的细胞或组织，所述物理屏障允许营养物、代谢物和分泌产物扩散，但将阻断免疫排斥的细胞和分子效应物。已研究了保护产生所选产物的组织或细胞免于免疫系统的各种装置。参见例如美国专利号5,158,881、WO92/03327、WO91/00119和WO93/00128，所述每个专利均通过引用以其整体结合到本文中。这些装置包括例如血管外扩散室(extravascular diffusion chamber)、血管内扩散室、血管内超滤室和微囊化细胞植入。参见Scharp, D. W.等, World J. Surg., 8, 第221-9页(1984)。参见例如Lim等, Science 210: 908-910 (1980)；Sun, A. M., Methods in Enzymology 137: 575-579 (1988)；WO 93/03901和美国专利号5,002,661。这类装置的使用可减少保持患者处于免疫抑制状态的需要。然而，对于提供长期移植物功能，这些方法无一是令人满意的。

因此，需要在延长的时间将合适量的所需物质递送(或提供其它所需代谢功能)至眼或身体其它部位的方法，所需物质例如神经营养因子、抗血管生成因子、抗炎因子、酶、激素或其它因子。

发明概述

本文提供编码包括抗体-支架、可溶性血管内皮生长因子(VEGF)受体和/或血小板衍生生长因子(PDGF)受体在内的抗血管生成蛋白的分离核酸，其中所述核酸包含选自以下的序列或由选自以下的序列组成：SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO: 19、SEQ ID NO: 21、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:29和SEQ ID NO:31。本发明还提供编码包含选自以下的氨基酸序列或由选自以下的氨基酸序列组成的多肽的核酸分子：SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO: 20、SEQ ID NO: 22、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:30和SEQ ID NO:32。

还提供编码具有与SEQ ID NO: 2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30或32的任一个有至少95%同一性的序列的多肽的核酸分子。或者，所述核酸分子可为这类核酸分子的互补序列。本文所用术语“核酸分子”欲包括DNA分子(例如cDNA或基因组DNA)、RNA分子(例如mRNA)、使用核苷酸类似物产生的DNA或RNA的类似物及其衍生物、片段和同源物。核酸分子可以是单链的或双链的，但优选是双链DNA。

本文所用“分离的”核酸分子是与存在于核酸来源的其它核酸分子分离的核酸分子。优选“分离的”核酸不含位于该核酸来源于其中的生物基因组DNA的该核酸侧翼的序列(即位于该核酸5'和3'端的序列)。例如，在不同的实施方案中，本发明的核酸分子可含有小于约5 kb、4 kb、3 kb、2 kb、1 kb、0.5 kb或0.1 kb的核苷酸序列，所述核苷酸序列位于所述核酸来源于其中的细胞基因组DNA的该核酸分子的侧翼。此外，“分离的”核酸分子，例如cDNA分子，当通过重组技术产生时，可基本上不含其它细胞物质或培养基，或者当化学合成时，基本上不含化学前体或其它化学物质。例如，本领域技术人员应认识到，“分离的”核酸可以是最初来自噬菌体展示筛选的完全合成的分子。因此，在这种情况下，“分离的”核酸可以是基本上不含其它细胞物质、培养基、化学前体、化学物质等的合成分子。

可采用标准分子生物技术和本文提供的序列信息来制备本发明的核酸分子(例如具有选自以下核苷酸序列的核酸分子：SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO: 3、SEQ ID NO: 5、SEQ ID NO: 7、SEQ ID NO: 9、SEQ ID NO: 11、SEQ ID NO: 13、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO: 19、SEQ ID NO: 21、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:29和SEQ ID NO:31；编码具有选自以下序列的多肽的核酸分子：SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO: 16、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO: 20、SEQ ID NO: 22、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:30和SEQ ID NO:32或这些核苷酸序列任一个的互补序列)。使用这些核酸序列的全部或部分，可采用标准杂交和克隆技术分离杂交探针或可溶性VEGF受体或PDGF受体分子(例如描述于Sambrook等(主编)，Molecular Cloning: A Laboratory Manual 第2版，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NY，1989；以及Ausubel等(主编)，Current Protocols in Molecular Biology，John Wiley & Sons，New York，NY，1993)。

可按照标准PCR扩增和装配技术，使用cDNA、mRNA或基因组DNA作为模板和合适的寡核苷酸引物，来扩增本发明的任何核酸。可将如此扩增的核酸克隆至合适的载体中，并通过DNA序列分析进行表征。此外，可通过标准合成技术，例如使用自动化DNA合成仪，来制备对应于抗血管生成抗体支架或可溶性VEGFR或PDGFR核苷酸序列的寡核苷酸。

本文所用术语“寡核苷酸”是指一系列连接的核苷酸残基，所述寡核苷酸具有足够数目的核苷酸碱基用于PCR反应。短的寡核苷酸序列可以基因组或cDNA序列为基础，或者由基因组或cDNA序列设计，并且用来扩增、证实或揭示特定细胞或组织中相同、相似或互补DNA或RNA的存在情况。寡核苷酸包含长度为约10 nt、50 nt或100 nt，优选长度约15 nt-30 nt的核酸序列的部分。在一个实施方案中，包含长度小于100 nt的核酸分子的寡核苷酸还可包含SEQ ID NO: 1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29或31或其互补序列的至少6个连续核苷酸。寡核苷酸可以是化学合成的，并且可用作探针。

在其它实施方案中，本发明的分离核酸分子包含是SEQ ID NO: 1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29或31所示核苷酸序列的互补序列的核酸分子。与这些核苷酸序列互补的核酸分子是这样的核酸分子：与其可氢键结合的核苷酸序列充分互补且几乎没有错配或没有错配，从而形成稳定的双链体。

本文所用术语“互补”是指核酸分子的核苷酸单元之间的Watson-Crick或Hoogsteen碱基配对，而术语“结合”意指两个多肽或化合物或相关多肽或化合物或其组合之间的物理或化学相互作用。结合包括离子、非离子、范德瓦尔斯、疏水相互作用等。物理相互作用可以是直接或间接的。间接相互作用可通过另一种多肽或化合物的作用产生或由另一种多肽或化合物的作用所致。直接结合是指相互作用不通过另一种多肽或化合物的作用而产生或者不因另一种多肽或化合物的作用所致而产生，而取而代之的是没有其它显著的化学中间体。

此外，本发明的核酸分子可只包含SEQ ID NO: 1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、2、29或31的核酸序列的一部分，例如可用作探针或引物的片段或编码本发明的抗血管生成抗体支架或可溶性VEGF受体或PDGF受体的任一种的生物活性部分的片段。本文提供的片段分别定义为至少6个(连续)核酸或至少4个(连续)氨基酸的序列，该长度分别在核酸的情况下足以允许特异性杂交或在氨基酸的情况下足以允许表位的特异性识别，并且比全长序列至多少一些部分。片段可来源于所选核酸或氨基酸序列的任何连续部分。衍生物是直接地或通过修饰或部分取代由天然化合物形成的核酸序列或氨基酸序列。类似物是具有类似(但又不同于)天然化合物的结构却在某些组分或侧链方面不同的核酸序列或氨基酸序列。类似物可以是合成的或来自不同的进化起源，并且与野生型相比，可具有类似或相反的代谢活性。同源物是来源于不同物种的特定基因的核酸序列或氨基酸序列。

如果衍生物或类似物含有修饰的核酸或氨基酸，则衍生物和类似物可以是全长的或非全长的。本发明的核酸或蛋白质的衍生物或类似物包括但不限于以下分子：包含在相同大小的核酸或氨基酸序列内或当与其中通过本领域已知计算机同源性程序进行比对的比对序列比较时，与本发明的核酸或蛋白质基本同源、在不同实施方案达至少约30%、50%、70%、80%或95%同一性(优选50-95%同一性)的区域，或者其编码核酸能够与编码上述蛋白质的序列的互补序列在严格、中等严格或低严格条件下杂交。参见例如Ausubel等，Current Protocols in Molecular Biology，John Wiley & Sons，New York，NY，1993和下文。

本发明还包括因遗传密码的简并性所致而不同于SEQ ID NO: 1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29或31所示核苷酸序列、但因此编码与由SEQ ID NO: 1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29或31所示核苷酸序列所编码的相同的抗血管生成抗体支架或可溶性VEGFR或PDGFR蛋白的核酸分子。

在另一个实施方案中，本发明的分离核酸分子的长度为至少6个核苷酸，并在严格条件下与包含SEQ ID NO: 1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29或31的核苷酸序列的核酸分子杂交。在另一个实施方案中，核酸的长度为至少10、25、50、100、250、500、1000、1500、2000个或更多个核苷酸。在另一个实施方案中，本发明的分离核酸分子与编码区例如SEQ ID NO: 1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29或31杂交。

本文所用术语“在严格条件下杂交”旨在描述彼此至少60%同源的核苷酸序列通常彼此保持杂交的杂交和洗涤条件。此外，本文所用短语“严格杂交条件”是指探针、引物或寡核苷酸将与其靶序列但不与其它序列杂交的条件。严格条件是序列依赖性的，在不同环境下将不同。与较短的序列相比，较长的序列在较高温度下特异性地杂交。一般来讲，选择在规定离子强度和pH下低于特定序列热熔点(Tm)约5℃的严格条件。Tm是与靶序列互补的探针的50%与靶序列杂交达到平衡时的温度(在规定的离子强度、pH和核酸浓度下)。由于靶序列一般过量存在，因此在Tm下，在平衡下50%的探针被占据。严格条件通常是以下条件：其中在pH 7.0-8.3下，盐浓度小于约1.0 M钠离子、通常约0.01-1.0 M钠离子(或其它盐)，且对于短的探针、引物或寡核苷酸(例如10 nt-50 nt)，温度为至少约30℃，而对较长的探针、引物和寡核苷酸，温度为至少约60℃。严格条件还可通过加入去稳定剂(例如甲酰胺)实现。

严格条件是本领域技术人员已知的，可见于Ausubel等(主编), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N.Y. (1989), 6.3.1-6.3.6。优选所述条件使得彼此至少约65%、70%、75%、85%、90%、95%、98%或99%同源的序列通常保持彼此杂交。严格杂交条件的非限制性实例是在65℃下在包含6X SSC、50 mM Tris-HCl (pH 7.5)、1 mM EDTA、0.02% PVP、0.02%菲可(Ficoll)、0.02% BSA和500 mg/ml变性鲑精DNA的高盐缓冲液中杂交，接着在50℃下在0.2X SSC、0.01% BSA一次或多次洗涤。中等严格杂交条件的非限制性实例是在55℃下在6X SSC、5X Denhardt溶液、0.5% SDS和100 mg/ml变性鲑精DNA中杂交，接着在37℃下在1X SSC、0.1% SDS中一次或多次洗涤。可采用的其它中等严格条件是本领域众所周知的。参见例如Ausubel等(主编), 1993, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, NY和Kriegler, 1990, Gene Transfer and Expression, A Laboratory Manual, Stockton Press, NY。低严格性杂交条件的非限制性实例是在40℃下在35%甲酰胺、5X SSC、50 mM Tris-HCl (pH 7.5)、5 mM EDTA、0.02% PVP、0.02%菲可、0.2% BSA、100 mg/ml变性鲑精DNA、10% (wt/vol)硫酸葡聚糖中杂交，接着在50℃下在2X SSC、25 mM Tris-HCl (pH 7.4)、5 mM EDTA和0.1% SDS中一次或多次洗涤。可采用的其它低严格性条件是本领域众所周知的(例如物种间杂交所用的条件)。参见例如Ausubel等(主编), 1993, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, NY和Kriegler, 1990, Gene Transfer and Expression, A Laboratory Manual, Stockton Press, NY；Shilo和Weinberg, 1981, Proc Natl Acad Sci USA 78: 6789-6792。

还提供本文所述的任何核酸分子编码的多肽。例如，这些多肽可以是抗血管生成抗体支架和/或可溶性VEGF受体或PDGF受体。在一些实施方案中，本文所述抗血管生成抗体支架和/或可溶性VEGF受体或PDGF受体(例如优先)与VEGF结合。这些抗血管生成抗体支架和/或可溶性VEGF受体与VEGF的结合或与PDGF受体联合与PDGF的结合抑制内皮细胞增殖和血管通透性。

本发明还包括与具有SEQ ID NO: 2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30或32的氨基酸序列的多肽有至少80%同一性的分离多肽。或者，分离多肽与具有SEQ ID NO: 2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30或32的氨基酸序列的多肽的片段(即至少6个连续氨基酸)为至少80%同源。此外，本发明还包括与具有SEQ ID NO: 2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30或32的氨基酸序列的多肽的衍生物、类似物或同源物至少80%同源的分离多肽。同样地，本发明还提供与具有SEQ ID NO: 2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30或32的氨基酸序列的多肽的等位基因变体有至少80%同一性的分离多肽。本领域技术人员应认识到，这类多肽应由能够与SEQ ID NO:1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29或31的核酸分子在严格条件下杂交的核酸分子编码。

本文所用术语“蛋白质”和“多肽”旨在可互换的。本发明的新多肽包括抗血管生成抗体支架和可溶性VEGF受体或PDGF受体多肽，其序列以SEQ ID NO: 2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30或32提供。本发明还包括突变或变异多肽或其功能性片段，所述多肽残基的任一个可自SEQ ID NO: 2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30或32所示相应残基改变而来，同时仍编码保持其抗血管生成抗体支架和/或可溶性VEGF受体或PDGF受体活性和生理功能的多肽。在突变或变异蛋白质中，多达20%或以上的残基可被如此改变。

总的来说，保持抗血管生成或可溶性VEGFR样或PDGFR样功能的抗血管生成抗体支架或可溶性VEGF受体或PDGF受体变体包括其中序列中特定位置上的残基被其它氨基酸取代的任何变体，并且还包括亲代蛋白质的两个残基之间插入一个或多个额外残基的可能性以及自亲代序列缺失一个或多个残基的可能性。本发明包括任何氨基酸取代、插入或缺失。在有利的情况下，取代是保守取代。

本领域技术人员应认识到，本发明还涉及分离的抗血管生成抗体支架和可溶性VEGFR或PDGFR多肽及其生物活性部分或其衍生物、片段、类似物或同源物。可采用标准蛋白质纯化技术，通过合适的纯化方案，从细胞或组织来源中分离本文所述抗血管生成抗体支架和可溶性VEGFR或PDGFR构建体。在另一个实施方案中，本发明的抗血管生成抗体支架和可溶性VEGFR或PDGFR多肽通过重组DNA技术产生。作为重组表达的备选方法，可采用标准肽合成技术，以化学方法合成抗血管生成抗体支架或可溶性VEGFR或PDGFR蛋白或多肽。

“分离的”或“纯化的”多肽或其生物活性部分基本上不含抗血管生成抗体支架或可溶性VEGFR或PDGFR多肽来源于其中的细胞或组织来源的细胞物质或其它污染性蛋白质或多肽，或者基本上不含化学合成时的化学前体或其它化学物质。用语“基本上不含细胞物质”包括抗血管生成抗体支架或可溶性VEGFR或PDGFR多肽的制备物，其中将多肽与其分离或重组产生于其中的细胞的细胞组分分离。例如，用语“基本上不含细胞物质”包括抗血管生成抗体支架或VEGFR或PDGFR多肽的制备物，所述制备物具有小于约30% (以干重计)的非抗血管生成抗体支架或非VEGFR或PDGFR蛋白(本文亦称为“污染性蛋白质”)，更优选小于约20%的非抗血管生成抗体支架或非VEGFR或非PDGFR蛋白，还更优选小于约10%的非抗血管生成抗体支架或非VEGFR或非PDGFR蛋白，最优选小于约5%非抗血管生成抗体支架或非VEGFR非PDGFR蛋白。如果抗血管生成抗体支架或VEGFR或PDGFR多肽或其生物活性部分是重组产生的，则还优选基本上不含培养基，即培养基占蛋白质制备物体积的小于约20%，更优选小于约10%，最优选小于约5%。

同样地，用语“基本上不含化学前体或其它化学物质”包括抗血管生成抗体支架或可溶性VEGFR或PDGFR多肽的制备物，其中将多肽与参与多肽合成的化学前体或其它化学物质分离。例如，用语“基本上不含化学前体或其它化学物质”包括抗血管生成抗体支架或可溶性VEGFR或PDGFR多肽的制备物，其具有小于约30% (以干重计)的化学前体或非抗血管生成抗体支架或非VEGFR或非PDGFR化学物质，更优选小于约20%化学前体或非抗血管生成抗体支架或非VEGFR或非PDGFR化学物质，还更优选小于约10%化学前体或非抗血管生成抗体支架或非VEGFR或非PDGFR化学物质，最优选小于约5%化学前体或非抗血管生成抗体支架或非VEGFR非PDGFR化学物质。

本发明的抗血管生成抗体支架或可溶性VEGFR或PDGFR多肽构建体的生物活性部分包括这样的肽，其包含与抗血管生成抗体支架或可溶性VEGFR或PDGFR多肽的氨基酸序列充分同源或来源于抗血管生成抗体支架或可溶性VEGFR或PDGFR多肽的氨基酸序列的氨基酸序列，例如，与本文所述全长抗血管生成抗体支架或可溶性VEGFR或PDGFR构建体相比包括较少氨基酸并显示本发明的抗血管生成抗体支架或可溶性VEGFR或PDGFR多肽的至少一种活性的SEQ ID NO: 2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30或32所示的氨基酸序列。通常，生物活性部分包含具有抗血管生成抗体支架或可溶性VEGFR或PDGFR多肽的至少一种活性的结构域或基序。

为了确定2个氨基酸序列或2个核酸的百分比同源性，将序列进行比对以用于最佳比较目的(例如可将空位引入第一氨基酸或核酸序列的序列中用于与第二氨基酸或核酸序列进行最佳比对)。然后比较相应氨基酸位置或核苷酸位置上的氨基酸残基或核苷酸。如果第一序列的位置被与第二序列相应位置的相同氨基酸残基或核苷酸占据，则该分子在该位置上是同源的(即本文所用的氨基酸或核酸“同源性”等同于氨基酸或核酸“同一性”)。

核酸序列同源性可作为2个序列间的同一性程度来确定。同源性可应用本领域已知计算机程序确定，例如GCG程序包所提供的GAP软件。参见Needleman和Wunsch 1970 J Mol Biol 48: 443-453。术语“序列同一性”是指在特定比较区内在逐个残基的基础上2个多核苷酸或多肽序列是相同的程度。术语“序列同一性百分比”如下计算：通过比较在该比较区内的2个最优比对序列，确定在2个序列中出现相同核酸碱基(例如A、T、C、G、U或I，在核酸的情况下)的位置数以得到匹配位置数，将该匹配位置数除以该比较区的位置总数(即窗口大小)，将结果乘以100，得到序列同一性百分比。本文所用术语“基本同一性”表示多核苷酸序列的特性，其中多核苷酸包含在比较区内与参比序列相比具有至少80%序列同一性、优选至少85%同一性、常常90-95%序列同一性、更通常至少99%序列同一性的序列。

本发明还提供抗血管生成抗体支架或可溶性VEGF或PDGFR受体嵌合或融合蛋白。本发明的抗血管生成抗体支架或可溶性VEGFR或PDGFR嵌合或融合蛋白可通过标准重组DNA技术产生。例如，按照常规技术，例如通过利用用于连接的平端或交错端、提供合适末端的限制性内切酶消化、适当时补平黏端、避免不需要的连接的碱性磷酸酶处理和酶促连接，将编码不同多肽序列的DNA片段符合读框地连接起来。在另一个实施方案中，可通过常规技术包括自动化DNA合成仪合成融合基因。或者，基因片段的PCR扩增可使用在两个连续的基因片段间产生互补突出端的锚定引物进行，所述基因片段可随后退火并再扩增以产生嵌合基因序列(参见例如Ausubel等(主编) Current Protocols in Molecular Biology，John Wiley & Sons，1992)。此外，许多已编码某一融合部分(例如GST多肽)的表达载体是市售可获得的。

本发明还提供含有本发明的任何核酸分子的载体。具体地讲，本发明还涉及载体、优选表达载体，其含有编码本发明的抗血管生成抗体支架或可溶性VEGFR或PDGFR多肽或其衍生物、片段、类似物或同源物的核酸。本文所用术语“载体”是指能够将另一个核酸转运到其与之连接的核酸分子上。载体的一种类型是“质粒”，其是指其中可连接额外DNA区段的环状双链DNA环。载体的另一种类型是病毒载体，其中额外的DNA区段可连接至病毒基因组。某些载体能够在其所导入的宿主细胞中自主复制(例如具有细菌复制起点和附加型哺乳动物载体的细菌载体)。其它载体(例如非附加型哺乳动物载体)在导入宿主细胞时整合到宿主细胞基因组中，从而与宿主基因组一起复制。此外，某些载体能够指导与之有效连接的基因的表达。这类载体在本文称为“表达载体”。一般来讲，重组DNA技术中应用的表达载体常常呈质粒的形式。在本说明书中，“质粒”和“载体”可互换使用，因为质粒是最常用的载体形式。然而，本发明欲包括提供等同功能的表达载体的这类其它形式，例如病毒载体(例如复制缺陷型反转录病毒、腺病毒、腺伴随病毒和基于转座子的重组系统)。

本发明的重组表达载体包含呈适于在宿主细胞中表达核酸的形式的本发明的任何核酸，这意味着重组表达载体包括根据待用于表达的宿主细胞选择的与待表达的核酸序列有效连接的一个或多个调节序列。在重组表达载体内，“有效连接”欲指以允许核苷酸序列表达的方式与一个或多个调节序列连接的目标核苷酸序列(例如在体外转录/翻译系统中或当载体导入宿主细胞时在宿主细胞中)。

术语“调节序列”欲包括启动子、增强子和其它表达控制元件(例如多腺苷酸化信号)。这类调节序列描述于例如Goeddel；Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, Calif. (1990)。调节序列包括在许多宿主细胞类型中指导核苷酸序列组成型表达的调节序列和只在某些宿主细胞中指导核苷酸序列表达的调节序列(例如组织特异性调节序列)。本领域技术人员应了解，表达载体的设计可取决于诸如待转化的宿主细胞的选择、所需蛋白质的表达水平等因素。可将本发明的表达载体导入宿主细胞，从而产生蛋白质或肽，包括本文所述核酸编码的融合蛋白或肽(例如抗血管生成抗体支架、可溶性VEGFR或PDGFR多肽、抗血管生成抗体支架的突变体形式、可溶性VEGFR或PDGFR多肽的突变体形式、融合蛋白等)。

可设计本发明的重组表达载体用于在原核或真核细胞中表达本发明的抗血管生成抗体支架或可溶性VEGFR或PDGFR构建体。用于原核和真核细胞两者中的其它合适表达系统是本领域已知的(参见例如Sambrook等，Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 第2版，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y.，1989，第16和17章)。

另外，本发明还提供含有这类载体(或本文所述任何核酸分子)的宿主细胞或细胞系。本文所用术语“宿主细胞”和“重组宿主细胞”在本文可互换使用。要了解这类术语不仅仅指特定的主题细胞，而且还指这类细胞的子代或潜在子代。因为某些修饰因突变或环境影响所致可出现在随后的子代中，事实上，这类子代可能并不与亲代细胞相同，但仍包括在本文所用的该术语的范围内。

宿主细胞可以是任何原核或真核细胞。以非限制性实例为例，宿主细胞可以是ARPE-19细胞。然而，其它合适的宿主细胞是本领域技术人员已知的。

可通过常规转化或转染技术，将载体DNA导入原核或真核细胞中。本文所述术语“转化”和“转染”欲指用于将外源核酸(例如DNA)导入宿主细胞的各种公认技术，包括磷酸钙或氯化钙共沉淀、DEAE-葡聚糖介导的转染、脂转染或电穿孔。转化或转染宿主细胞的合适方法可见于Sambrook等(Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 第2版, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989)和其它实验室指南。

对于哺乳动物细胞的稳定转染，要了解，根据所用的表达载体和转染技术，仅一小部分细胞可将外源DNA整合至其基因组。为了鉴定和选择这些整合子(integrant)，一般将编码选择标记(例如抗生素抗性)的基因与目标基因一起导入宿主细胞中。各种选择标记包括赋予药物(例如G418、潮霉素、甲氨蝶呤和/或杀稻瘟素)抗性的选择标记。可将位于与编码抗血管生成抗体支架或可溶性VEGF或PDGF受体构建体的相同载体上的编码选择标记的核酸导入宿主细胞，或者可引入各自的载体中。用导入的核酸稳定转染的细胞可通过药物选择来鉴定(例如掺入选择标记基因的细胞将存活，而其它细胞则死亡)。

可使用本发明的宿主细胞，例如培养中的原核或真核宿主细胞，以产生(即表达)本文所述的任何抗血管生成抗体支架或可溶性VEGFR或PDGFR多肽构建体。因此，本发明还提供使用本发明的宿主细胞产生这些抗血管生成抗体支架或可溶性VEGFR或PDGFR多肽的方法。在一个实施方案中，所述方法包括将本发明的宿主细胞(已向其中导入编码抗血管生成抗体支架或可溶性VEGFR或PDGFR的重组表达载体)在合适的培养基中培养，使得产生抗血管生成抗体支架或可溶性VEGFR或PDGFR多肽。在另一个实施方案中，所述方法还包括从培养基或宿主细胞中分离抗血管生成抗体支架或可溶性VEGFR或PDGFR。

同样地，本发明还提供经遗传工程改造以产生治疗量的抗血管生成抗体支架或可溶性VEGF受体或PDGF受体的ARPE-19细胞的细胞系，其中抗血管生成抗体支架或可溶性VEGF受体或PDGF受体由选自以下的核酸序列编码：SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO: 19、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:29和SEQ ID NO:31。同样地，本发明还提供经遗传工程改造以产生包含选自以下氨基酸序列的抗血管生成抗体支架或可溶性VEGF或PDGF受体的ARPE-19细胞的细胞系：SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:30和SEQ ID NO:32。

优选治疗量为至少1 pg-1000 μg/天/6mm装置。本领域技术人员应认识到，治疗量可以是落入该范围(包括性的)的任何量。此外，本发明的细胞系和装置能够表达该治疗量持续至少三周的一段时间。在一些实施方案中，治疗量为至少100-10,000 ng/天。在一个非限制性的实施方案中，该量为至少4 μg/天。

本文还描述了可植入细胞培养装置，所述装置含有本发明的一个或多个细胞系(即经遗传工程改造以产生治疗量的本文所述抗血管生成抗体支架和/或可溶性VEGF受体或PDGFR受体的任一种的ARPE-19细胞)和围绕核心(core)的半透膜，其中所述膜允许其中的抗血管生成抗体支架或可溶性VEGF受体或PDGF受体扩散通过。术语“囊(capsule)”和“装置”在本文可互换使用，是指含有经遗传工程改造的细胞和细胞系(例如ARPE-19细胞或细胞系)的任何生物人工器官。

在一些实施方案中，核心另外含有配置在半透膜内的基质。以非限制性实例为例，基质可包括水凝胶或胞外基质组分。例如，水凝胶可含有与多价离子交联的藻酸盐。在其它实施方案中，基质包括大量单丝，其中单丝被捻成纱或被织成网或被捻成呈无纺线的纱，且其中细胞或组织分布在上面。本领域技术人员应认识到，丝状细胞支持性基质可由选自以下的生物相容性材料制造：丙烯酸类、聚酯、聚乙烯、聚丙烯、聚乙腈、聚对苯二甲酸乙二醇酯、尼龙、聚酰胺、聚氨酯、聚丁酯(polybutester)、丝、棉、壳多糖、碳和/或生物相容性金属。本文所用“内部支架(internal scaffold)”是一种适用于本发明任何装置的“基质”的非限制性实例。

在一些实施方案中，本文所述细胞包封装置还具有系链锚(tether anchor)。例如，系链锚可以是适于将所述囊锚定在眼结构上的锚环。本文所述的任何装置适于植入眼部或选自以下的另一个身体靶区：脾、耳、心脏、结肠、肝、肾、乳腺、关节、骨髓、皮下和腹膜间隙。以非限制性实例为例，可将囊植入玻璃体、水样液、眼球筋膜下间隙(Subtenon’s space)、眼周间隙、眼后房和/或眼前房。

本文所述装置的外罩(jacket)优选由选择性渗透的免疫隔离膜(immunoisolatory membrane)制成。例如，外罩由超滤膜或微滤膜制成。本领域技术人员应认识到，超滤膜通常具有1-100 nm的孔径大小，而微滤膜通常具有0.1-10 μm的孔径大小。在其它实施方案中，外罩可由无孔膜材料(例如水凝胶或聚氨酯)制成。术语“外罩”和“半透膜”在本文可互换使用。

在本文所述任何装置中，可使囊成形为中空纤维或平片(flat sheet)。此外，在不同的实施方案中，至少一种额外的生物活性分子可从这些装置中共同递送。例如，至少一种额外的生物活性分子可来自非细胞或细胞源(即至少一种额外的生物活性分子由核心中的一种或多种经遗传工程改造的ARPE-19细胞产生)。

本文还提供用于通过将本发明的可植入细胞培养装置植入患者眼部来治疗眼科病症并允许抗血管生成抗体支架或可溶性VEGF受体或PDGF受体从装置中扩散和与眼中的VEGF和/或PDGF结合从而治疗眼科病症的方法。例如，待治疗的眼科病症可选自早产儿视网膜病、糖尿病性黄斑水肿、糖尿病视网膜病、年龄相关性黄斑变性、青光眼、色素性视网膜炎、白内障形成、成视网膜细胞瘤和视网膜缺血。在一个优选的实施方案中，年龄相关性黄斑变性是湿性年龄相关性黄斑变性。在另一个优选的实施方案中，眼科病症是糖尿病视网膜病。

本发明还提供用于通过将本发明的可植入细胞培养装置植入患有细胞增殖病症的患者中并且允许抗血管生成抗体支架或可溶性VEGF受体或PDGF受体从装置中扩散并与VEGF或PDGF结合来抑制内皮细胞增殖的方法，其中所述结合抑制患者的内皮细胞增殖。例如，所述病症选自血液学病症、动脉粥样硬化、炎症、血管通透性增加和恶性肿瘤。

还提供通过将本文所述可植入细胞培养装置植入接受宿主的靶区来将抗血管生成抗体支架或可溶性VEGF受体或PDGF受体递送给接受宿主的方法，其中包封的一种或多种ARPE-19细胞在靶区分泌抗血管生成抗体支架或可溶性VEGF受体或PDGF受体。优选的靶区包括中枢神经系统，包括脑、脑室、脊髓或眼的水样液和玻璃体液。其它靶区可包括但不限于用于全身递送的整个身体和/或身体器官内或附近的局部靶区，例如乳腺、结肠、脾、卵巢、睾丸和/或骨髓。

本领域技术人员应认识到，在本文所述的有关眼植入和/或眼病症的任何方法中，介于0.1 pg和1000 μg/患者/天的本发明的抗血管生成抗体支架或可溶性VEGF受体或PDGF受体可从可植入细胞培养装置中扩散。然而，对于至身体其它靶区的全身植入，治疗有效量可为1000 mg/患者/天以上。本领域技术人员应认识到，对于这类全身适应症，将必须采用大得多的ECT装置。

对于眼植入，优选治疗量是介于1 pg与1000 μg/天/6 mm装置(包括性的)之间的任何量。在一些实施方案中，治疗量为至少1000 ng/天(1.0 pcd)。此外，本发明的细胞系和装置能够表达该治疗量持续至少三周的一段时间。

另外，本发明还提供用于制备本发明的可植入细胞培养装置的方法。在一种方法中，至少一种ARPE-19细胞经遗传工程改造以分泌由选自以下核酸序列编码的抗血管生成抗体支架或可溶性VEGF受体或PDGF受体：SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:29和SEQ ID NO:31，且遗传修饰的ARPE-19细胞被包封在半透膜内，其中所述膜允许抗血管生成抗体支架或可溶性VEGF受体或PDGF受体从中扩散通过。在另一种方法中，至少一种ARPE-19细胞经遗传工程改造以分泌包含选自以下氨基酸序列的抗血管生成抗体支架或可溶性VEGF受体或PDGF受体：SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:30和SEQ ID NO:32，且遗传修饰的ARPE-19细胞被包封在半透膜内，其中所述膜允许抗血管生成抗体支架或可溶性VEGF受体或PDGF受体从中扩散通过。

本发明还描述了经遗传工程改造以产生本发明的任何多肽(例如SEQ ID NO: 2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30或32)的一种或多种ARPE-19细胞在制备本发明的任何可植入细胞培养装置中的用途，所述装置用于治疗血管病症包括眼的血管病症，例如通过将装置植入患者眼中或在其它患病部位用于局部的和靶向的抗血管生成因子递送。

此外，可通过将装置植入患者眼中并且通过允许本发明的抗血管生成抗体支架或可溶性VEGF受体或PDGF受体从装置中扩散并与眼中的VEGF和/或PDGF结合，来使用本文所述的任何可植入细胞培养装置用于治疗眼科病症。

还提供经遗传工程改造以产生本发明的任何多肽的一种或多种ARPE-19细胞，用于通过将本发明的任何可植入细胞培养装置植入患者眼中并且通过允许抗血管生成抗体支架或可溶性VEGF受体或PDGF受体从装置中扩散并与眼中的VEGF或PDGF结合来治疗眼科病症。

还可将本文所述的任何分离的核酸分子用于制备经遗传工程改造以产生本发明的多肽之一的一种或多种ARPE-19细胞，用于通过将本发明的可植入细胞培养装置植入患者眼中并且通过允许抗血管生成抗体支架或可溶性VEGF受体或PDGF受体从装置中扩散并与眼中的VEGF或PDGF结合来治疗眼科病症。此外，本发明的任何分离的核酸分子也可用于治疗眼科病症，其中治疗包括将本发明的可植入细胞培养装置植入患者眼中并且允许抗血管生成抗体支架或可溶性VEGF受体或PDGF受体从装置中扩散并与眼中的VEGF和/或PDGF结合，其中所述装置中的所述一种或多种ARPE-19细胞已用所述分离的核酸分子进行遗传工程改造从而产生本文所述的任何分离的多肽。

在本文所述的任何实施方案中，血管病症选自但不限于例如早产儿视网膜病、糖尿病性黄斑水肿、糖尿病视网膜病、年龄相关性黄斑变性(例如湿性年龄相关性黄斑变性)、青光眼、色素性视网膜炎、白内障形成、成视网膜细胞瘤和视网膜缺血。本领域技术人员应认识到，本文所述任何装置还可用来治疗各种非眼部的血管病症。

本发明还提供经遗传工程改造以产生本发明的多肽(例如抗血管生成抗体支架或抗血管生成分子)的一种或多种ARPE-19细胞在制备本发明的可植入细胞培养装置中的用途，用于通过将装置植入患有细胞增殖病症的患者的眼中并且通过允许抗血管生成抗体支架或可溶性VEGF受体或PDGF受体从装置中扩散并与眼中的VEGF和/或PDGF结合从而抑制所述患者的内皮细胞增殖，来抑制内皮细胞增殖。同样地，本发明还提供本发明的可植入细胞培养装置，用于通过将装置植入患有细胞增殖病症的患者的眼中并且通过允许抗血管生成抗体支架或可溶性VEGF受体或PDGF受体从装置中扩散并与眼中的VEGF和/或PDGF结合从而抑制所述患者的内皮细胞增殖，来抑制内皮细胞增殖。

在其它实施方案中，本发明提供经遗传工程改造以产生本发明的任何多肽的一种或多种ARPE-19细胞，用于通过将本文所述的任何可植入细胞培养装置植入患有细胞增殖病症的患者的眼中并且通过允许抗血管生成抗体支架或可溶性VEGF受体或PDGF受体从装置中扩散并与眼中的VEGF或PDGF结合从而抑制所述患者的内皮细胞增殖，来抑制内皮细胞增殖。

还考虑了本文所述的任何分离的核酸分子在制备经遗传工程改造以产生本发明的一种或多种多肽的一种或多种ARPE-19细胞中的用途，用于通过将本发明的可植入细胞培养装置植入患有细胞增殖病症的患者的眼中并且通过允许抗血管生成抗体支架或可溶性VEGF受体或PDGF受体从装置中扩散并与眼中的VEGF或PDGF结合从而抑制所述患者的内皮细胞增殖，来抑制内皮细胞增殖。

此外，本发明还提供用于抑制内皮细胞增殖的本发明的任何分离的核酸分子，治疗包括将本发明的可植入细胞培养装置植入患有细胞增殖病症的患者的眼中并且允许抗血管生成抗体支架或可溶性VEGF受体或PDGF受体从装置中扩散并与眼中的VEGF和/或PDGF结合从而抑制所述患者的内皮细胞增殖，且其中所述装置中的所述一种或多种ARPE-19细胞已用所述分离的核酸分子进行遗传工程改造从而产生本发明的多肽。

本领域技术人员应认识到，细胞增殖病症可选自血液学病症、动脉粥样硬化、炎症、血管通透性增加和恶性肿瘤，并可局限于身体的各个部分，包括但不限于眼。因此，可将ECT装置置于这些局部区域附近以治疗所提及的病症。

本文还提供经遗传工程改造以产生本文所述任何多肽的一种或多种ARPE-19细胞在制备本发明的可植入细胞培养装置中的用途，用于通过将装置植入接受宿主的靶区且其中包封的一种或多种ARPE-19细胞在靶区分泌抗血管生成抗体支架或可溶性VEGF受体或PDGF受体，而将抗血管生成抗体支架或可溶性VEGF受体或PDGF受体递送给接受宿主。同样地，本发明的任何可植入细胞培养装置可用于通过将装置植入接受宿主的靶区，且其中包封的一种或多种ARPE-19细胞在靶区分泌抗血管生成抗体支架或可溶性VEGF受体或PDGF受体，而将抗血管生成抗体支架或可溶性VEGF受体或PDGF受体递送给接受宿主。

此外，经遗传工程改造以产生本文所述任何多肽的一种或多种ARPE-19细胞可用于通过将任何本发明的可植入细胞培养装置植入接受宿主的靶区，且其中包封的一种或多种ARPE-19细胞在靶区分泌抗血管生成抗体支架或可溶性VEGF受体或PDGF受体，而将抗血管生成抗体支架或可溶性VEGF受体或PDGF受体递送给接受宿主。

同样地，本文所述的任何分离的核酸分子可用于经遗传工程改造以产生本文所述任何多肽的一种或多种ARPE-19细胞的制备，用于通过将本发明的可植入细胞培养装置植入接受宿主的靶区，且其中包封的一种或多种ARPE-19细胞在靶区分泌抗血管生成抗体支架或可溶性VEGF受体或PDGF受体，而将抗血管生成抗体支架或可溶性VEGF受体或PDGF受体递送给接受宿主。

本文所述的任何分离的核酸分子还可用于将抗血管生成抗体支架或可溶性VEGF受体或PDGF受体递送给接受宿主，所述递送包括将本发明的可植入细胞培养装置植入接受宿主的靶区，其中包封的一种或多种ARPE-19细胞在靶区分泌抗血管生成抗体支架或可溶性VEGF受体或PDGF受体，且其中所述装置中的所述一种或多种ARPE-19细胞已用所述分离的核酸分子进行遗传工程改造从而产生本发明的任何多肽。

本领域技术人员应认识到，靶区选自中枢神经系统，包括脑、脑室、脊髓及眼的水样液和玻璃体液。其它靶区可位于身体的其它部位，并把ECT装置置于那些部位附近。各部位可包括但不限于脾、耳、心脏、结肠、肝、肾、乳腺、关节、骨髓、皮下和腹膜间隙。

另外，本发明还提供产生分离多肽的方法，所述方法包括表达本文所述的任何分离的核酸分子并收获所表达的多肽。

本发明还提供包含经遗传工程改造以产生治疗有效量的一种或多种抗血管生成抗体支架或抗血管生成分子(例如至少10,000 ng/天/10⁶个细胞)的ARPE-19细胞的细胞系。优选细胞系产生治疗有效量持续至少3个月的一段时间(即3、6、9、12、15、18、21、24个月或更多个月)。

在一些非限制性的实施方案中，可采用重复转染方法，将一种或多种抗血管生成抗体支架或抗血管生成分子导入ARPE-19细胞。具体地讲，重复转染可以是1次转染、2次转染、3次转染或更多次转染(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多次转染)。如果重复转染方法为1次转染，则细胞系将含有一种抗血管生成抗体支架或抗血管生成分子。如果重复转染方法为2次转染，则细胞系将含有2种抗血管生成抗体支架或抗血管生成分子。这些可以是相同或不同的抗血管生成抗体支架或抗血管生成分子。如果重复转染方法为3次转染，将细胞系将含有3种抗血管生成抗体支架或抗血管生成分子。这些可以是相同或不同的抗血管生成抗体支架或抗血管生成分子。本领域技术人员应认识到，重复转染方法中的转染数将决定所得细胞系中的(相同或不同)抗血管生成抗体支架和/或抗血管生成分子的数目。

在一些实施方案中，如果重复转染为1次转染，则细胞系产生介于10,000与30,000 ng/天/10⁶个细胞之间的一种或多种抗血管生成抗体支架或抗血管生成分子。优选细胞系产生大约或至少15,000 ng/天/10⁶个细胞的一种或多种抗血管生成抗体支架或抗血管生成分子。在其它实施方案中，如果重复转染为2次转染，则细胞系产生介于30,000与50,000 ng/天/10⁶个细胞之间的一种或多种抗血管生成抗体支架或抗血管生成分子。优选细胞系产生大约或至少35,000 ng/天/10⁶个细胞的一种或多种抗血管生成抗体支架或抗血管生成分子。在另外其它的实施方案中，如果重复转染为3次转染，则细胞系产生介于50,000与75,000 ng/天/10⁶个细胞之间的一种或多种抗血管生成抗体支架或抗血管生成分子。优选细胞系产生大约或至少70,000 ng/天/10⁶个细胞的一种或多种抗血管生成抗体支架或抗血管生成分子。

抗血管生成分子可以是例如可溶性VEGF受体和/或可溶性PDGF受体。

可采用重复转染方法将相同的抗血管生成抗体支架和/或抗血管生成分子的多个拷贝导入ARPE-19细胞。或者，还可采用重复转染方法将不同的抗血管生成抗体支架和/或抗血管生成分子的多个拷贝导入ARPE-19细胞。

在一个实施方案中，ARPE-19细胞是使用包含由SEQ ID NO. 1的核酸序列编码的可溶性VEGF受体或含有SEQ ID NO. 2的氨基酸序列的可溶性VEGF受体的载体经过遗传工程改造的。

本发明还提供包含经遗传工程改造以产生治疗有效量的一种或多种抗血管生成抗体支架或抗血管生成分子的ARPE-19细胞的任何细胞系，其中治疗有效量为至少10,000 ng/天/10⁶个细胞(例如至少15,000、20,000、25,000、30,000、35,000、40,000、45,000、50,000、55,000、60,000、65,000、70,000、75,000或更多ng/天/10⁶个细胞。这类细胞系能够产生这种治疗有效量持续至少3个月(例如至少6、9、12、15、18、21或24个月)或更长。本领域技术人员应认识到，在一些实施方案中，这类细胞系可采用本文所述重复转染方法产生。然而，还可采用本领域已知的其它方法以获得治疗有效量的一种或多种抗血管生成抗体支架或抗血管生成分子的产生。

本文所述的任何细胞系可经遗传工程改造以分泌由选自以下核酸序列编码的抗血管生成抗体支架或可溶性VEGF受体或PDGF受体：SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:29和SEQ ID NO:31。同样地，本文所述的任何细胞系可经遗传工程改造以分泌包含选自以下氨基酸序列的抗血管生成抗体支架或可溶性VEGF受体或PDGF受体：SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:30和SEQ ID NO:32。

本文还描述了含有核心的可植入细胞培养装置，所述核心含有本发明的一个或多个细胞系(即采用重复转染方法经遗传工程改造产生治疗有效量的本文所述的任何抗血管生成抗体支架和/或抗血管生成分子的ARPE-19细胞或经遗传工程改造以分泌至少10,000 ng/天/10⁶个细胞的ARPE-19细胞)和包绕核心的半透膜，其中所述膜允许一种或多种抗血管生成抗体支架和/或抗血管生成分子从中扩散通过。

在一些实施方案中，核心含有0.5-1.0 x 10⁶个细胞。

核心还可含有配置在半透膜内的基质。在其它实施方案中，基质包括大量单丝，其中单丝被捻成纱或被织成网或被捻成呈无纺线的纱，且其中细胞或组织分布在上面。本领域技术人员应认识到，单丝可由选自以下的生物相容性材料制成：丙烯酸类、聚酯、聚乙烯、聚丙烯、聚乙腈、聚对苯二甲酸乙二醇酯、尼龙、聚酰胺、聚氨酯、聚丁酯、丝、棉、壳多糖、碳和/或生物相容性金属。例如，单丝为包含介于装置内体积的40-85%的聚对苯二甲酸乙二醇酯(PET)纤维。

本文所述细胞包封装置还可具有系链锚。例如，系链锚可以是适于将装置锚定在眼结构上的锚环。

可将本文所述的任何装置植入(或用于植入)眼或身体的另一个靶区，例如脾、耳、心脏、结肠、肝、肾、乳腺、关节、骨髓、皮下和/或腹膜间隙。以非限制性实例为例，可将装置植入(或用于植入)玻璃体、水样液、眼球筋膜下间隙、眼周间隙、眼后房和/或眼前房。

本文所述装置的半透膜优选由选择性渗透的免疫保护膜(immunoprotective membrane)制成。在其它实施方案中，半透膜由超滤膜或微滤膜制成。本领域技术人员应认识到，半透膜通常具有约100 nm的中值孔径大小。

在另外其它的实施方案中，半透膜由无孔膜材料(例如水凝胶或聚氨酯)制成。在本文所述的任何装置中，半透膜的标称分子量截止值(MWCO)为500 kD。优选半透膜厚度为约90-120 um之间。本文所述的任何装置可配置成中空纤维或平片。装置的长度可为约4 mm-11 mm之间。在一些实施方案中，装置具有介于约0.9 mm-1.2 mm之间的内径。在一个优选的实施方案中，装置的末端使用甲基丙烯酸甲酯密封。

本发明的任何装置可包括以下额外特性的1、2、3、4、5、6、7个或全部：

a. 核心含有介于0.5-1.0 x 10⁶个之间的ARPE-19细胞；

b. 装置的长度为4 mm-11 mm之间；

c. 装置的内径为0.9-1.2 mm之间；

d. 装置的末端使用甲基丙烯酸甲酯密封；

e. 半透膜具有约100 nm的中值孔径大小；

f. 半透膜的标称分子量截止值(MWCO)为500 kD；

g. 半透膜的厚度为90-120 μm之间；

h. 核心含有内部支架，其中支架包含占装置内体积40-85%的聚对苯二甲酸乙二醇酯(PET)纤维；和

i. 其任何组合。

此外，在不同的实施方案中，至少一种额外的生物活性分子可从这些装置中共同递送。例如，至少一种额外的生物活性分子可来自非细胞或细胞源(即至少一种额外的生物活性分子由核心中的一种或多种经遗传工程改造的ARPE-19细胞产生)。

本发明还提供本发明的任何可植入细胞培养装置将合适治疗剂量的一种或多种抗血管生成抗体支架或抗血管生成分子递送至受试者眼中的用途，其中治疗剂量为至少100 ng/天/眼(例如至少100、200、300、400、500、1000、1500、2000、2500、3000、3500、4000ng/天/眼或更多)。同样地，本发明还提供一种或多种抗血管生成抗体支架或抗血管生成分子，用于通过将合适治疗剂量的一种或多种抗血管生成抗体支架或抗血管生成分子递送到受试者眼中来治疗需要治疗的受试者，其中治疗剂量为至少100 ng/天/眼(例如至少100、200、300、400、500、1000、1500、2000、2500、3000、3500、4000 ng/天/眼或更多)。

本文还提供用于治疗眼科病症的方法，所述方法通过将本发明的任何可植入细胞培养装置植入患者眼中并且允许抗血管生成抗体支架或抗血管生成分子从装置中扩散并与眼中的VEGF和/或PDGF结合，从而治疗眼科病症。在一些实施方案中，本发明提供用于治疗眼科病症的细胞系(即本文所述的任何细胞系)，其中将细胞系掺入可植入细胞培养装置中、其中将装置植入患者眼中，且其中抗血管生成抗体支架或抗血管生成分子从装置中扩散并与眼中的VEGF和/或PDGF结合，从而治疗眼科病症。

例如，待治疗的眼科病症可选自早产儿视网膜病、糖尿病性黄斑水肿、糖尿病视网膜病、年龄相关性黄斑变性、青光眼、色素性视网膜炎、白内障形成、成视网膜细胞瘤和视网膜缺血。在一个优选的实施方案中，年龄相关性黄斑变性是湿性年龄相关性黄斑变性。在一个优选的实施方案中，眼科病症是糖尿病视网膜病。

本发明还提供用于抑制内皮细胞增殖或血管形成的方法，所述方法通过将本发明的可植入细胞培养装置植入患有细胞增殖病症的患者中，并且允许抗血管生成抗体支架或抗血管生成分子从装置中扩散并与VEGF和/或PDGF结合，其中所述结合抑制患者的内皮细胞增殖或血管形成。例如，所述病症可选自血液学病症、动脉粥样硬化、炎症、血管通透性增加和恶性肿瘤。在这类方法中，每天每患者的治疗有效量的一种或多种抗血管生成抗体支架或抗血管生成分子从装置中扩散。

还提供将抗血管生成抗体支架或抗血管生成分子递送给接受宿主的方法，所述方法如下进行：通过将本文所述的任何可植入细胞培养装置植入接受宿主的靶区，其中包封的一种或多种ARPE-19细胞在靶区分泌抗血管生成抗体支架或抗血管生成分子。优选的靶区可包括但不限于中枢神经系统，包括脑、脑室、脊髓、眼的水样液和玻璃体液、脾、耳、心脏、结肠、肝、肾、乳腺、关节、骨髓、皮下和/或腹膜间隙。其它靶区可包括但不限于用于全身递送的整个身体和/或身体器官内或附近的局部靶位点，例如乳腺、结肠、脾、卵巢、睾丸和/或骨髓。在这类方法中，每天每患者的治疗有效量的抗血管生成抗体支架或抗血管生成分子扩散至靶区。

本领域技术人员应认识到，在本文所述的有关眼植入和/或眼病症的任何方法中，每天每患者的治疗有效量的本发明的抗血管生成抗体支架或抗血管生成分子从可植入细胞培养装置中扩散。例如，介于0.1 pg与1000 μg/患者/天之间的本发明的抗血管生成抗体支架或抗血管生成分子可从可植入细胞培养装置中扩散(例如进入一个或多个靶区)。

本发明还提供用于制备本发明的可植入细胞培养装置的方法。例如，通过遗传工程改造至少一种ARPE-19细胞以分泌一种或多种抗血管生成抗体支架或抗血管生成分子(例如由选自以下核酸序列编码的那些：SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:29和SEQ ID NO:31)，并将遗传修饰的ARPE-19细胞包封在半透膜内，其中所述膜允许抗血管生成抗体支架或抗血管生成分子从中扩散通过。在一个优选的实例中，本发明的抗血管生成分子是可溶性VEGF受体和/或可溶性PDGF受体。

除非另有限定，否则本文所用的所有技术和科学术语都具有与本发明所属领域普通技术人员通常理解的相同含义。虽然与本文所述方法与材料类似或等同的方法与材料可用于实施或测试本发明，但下面描述了合适的方法与材料。本文提及的所有出版物、专利申请、专利和其它参考文献均通过引用以其整体予以结合。在有冲突的情况下，将以本申请(包括定义)为准。另外，材料、方法和实施例只是说明性的，并非旨在限制性的。

根据下列详述和权利要求书，本发明的其它特征和优点将是显然的。

附图简述

图1是显示pCpGfree-vitro表达载体(InvivoGen)图谱的示意图。

图2显示用表达分子p834的细胞进行的细胞系筛选和命中测定(hit determination)的实例。

图3显示分子p834和p873的蛋白质印迹结果和分子p834的SDS-PAGE结果。

图4显示p834和p838的HUVEC生物测定。

图5显示p834的溶液结合测定。

图6显示表达p834的细胞系的稳定性。

图7显示保存在容器中4周后p834 ECT装置的组织切片。

图8显示植入新西兰白兔眼中3个月后移出的p834 ECT装置的组织学。

图9显示质量与效能图中产生834蛋白的细胞系的PCD。对第一、第二和第三转染/重复细胞系作图。

图10显示通过用p963和p964转染的细胞产生的PDGFR β Fc融合蛋白的检测ELISA。

图11显示产生PDGFR-D1-D5-hIgG1 Fc的克隆细胞系的实例。

图12显示分泌抗血管生成分子包括单克隆抗体、Fab片段、单链抗体和受体Fc的代表性细胞系。

图13显示体外ECT方式中代表性Mab、ScFv、Fab和受体Fc细胞系的装置蛋白质产量。

图14是显示p834、p873和p917的相对结构的示意图。

图15是p834、p873和p917的序列比对。

图16是p834和阿柏西普的序列比对。

图17是显示自组合荷载装置分泌的PDGFR-Fc和VEGFR-Fc的抗PDGFR加上抗Fc检测的蛋白质印迹。

发明详述

蛋白质是用于治疗眼疾病的治疗剂的主要类别。然而，基于大的抗体的蛋白质药物不能够旁路通过(bypass)血-视网膜屏障，因此，需要重复眼内给药进行治疗。之前已表明在人的临床试验中，包封细胞技术(encapsulated cell technology，ECT)眼内装置可在2年的进程中将生物治疗剂持续递送到眼，从而表明该项技术也可扩展到其它眼用生物制剂中，例如与湿性AMD有关的眼用生物制剂。

合成了代表抗体支架生物制剂的主要类别的cDNA序列，包括例如完全抗体、抗体Fab片段、单链(ScFv)抗体和融合受体-Fc分子。使用cDNA表达载体以产生分泌基于所需抗体的生物制剂的稳定的人细胞系。随后将细胞系包封，以产生眼用ECT植入物。通过ELISA测定蛋白质分泌的速率。

培养的克隆细胞系分泌抗体支架蛋白质的全部类别，许多与基于CHO-细胞系的制造系统等同。克隆细胞系显示稳固的重组蛋白分泌，一些细胞系的水平接近200-20,000 ng/100万个细胞/天(20 pcd)。在一些实施方案中，可采用1、2、3次或更多次转染的重复转染方法对细胞进行遗传工程改造。出乎意料的是，重复DNA转染和选择显著增加细胞系产生重组蛋白的能力，所述重组蛋白分泌50,000 ng/100万个细胞/天至大于70,000 ng/100万个细胞/天(70 pcd)。可采用重复转染方法将相同或不同的抗血管生成抗体支架和/或抗血管生成分子的多个拷贝导入细胞(例如ARPE-19细胞)。用包括1次转染的重复转染方法产生的分子可称为“第一代”分子。用包括2次转染的重复转染方法产生的分子可称为“第二代”分子。用包括3次转染的重复转染方法产生的分子可称为“第三代”分子。

已成功地将产生基于活性抗体支架的生物制剂和受体融合蛋白的细胞系包封，且最初以高达50-1000 ng/天的水平检出来自单个ECT装置的重组蛋白的初期产量。随后重复DNA转染的细胞系联合培养基优化，提高眼用ECT装置水平直到4,000-10,000 ng/天。

因此，这些ECT装置可为用于大的生物分子的有效药物递送平台，所述生物分子包括用于眼部适应症以及局部和/或全身适应症的抗体、抗体支架和/或受体融合蛋白。

血管内皮生长因子(VEGF)是参与血管发生(胚胎循环系统形成)和血管生成(自预先存在的血管系统的血管生长)两者的信号转导蛋白。虽然VEGF主要以其对血管内皮的作用而著称，但它还影响各种各样的其它细胞类型，例如刺激单核细胞/巨噬细胞迁移、神经元、癌细胞、肾上皮细胞等。

在VEGF家族内有许多蛋白质，这是由于mRNA可变剪接的结果而引起。各种剪接变体影响VEGF的功能，因为它们决定所得蛋白质是促血管生成还是抗血管生成。另外，剪接变体还影响VEGF与细胞表面上的硫酸肝素蛋白聚糖(HSPG)和neuripilin共同受体的相互作用，这进而提高VEGF结合并激活VEGF信号转导受体(VEGFR)的能力。

VEGF剪接变体作为糖基化二硫键结合的二聚体从细胞中释放。在结构上，VEGF属于半胱氨酸结(cysteine-knot)生长因子的PDGF家族，因此，存在几种密切相关的蛋白质，即胎盘生长因子(P1GF)、VEGF-B、VEGF-C和VEGF-D，它们一起构成生长因子的VEGF亚家族。VEGF本身常被称为VEGF-A，从而与这些其它的相关生长因子区分开来。

蛋白质的VEGF家族通过与存在于细胞表面上的VEGFR或酪氨酸激酶受体结合而刺激细胞反应。VEGF受体具有由7个免疫球蛋白样结构域组成的胞外部分、单个跨膜跨越区和一个含有割裂酪氨酸-激酶结构域的胞内部分。VEGF-A与VEGFR-1 (Flt-1)和VEGFR-2 (KDR/Flk-1)两者结合。VEGFR1作为全长受体酪氨酸激酶(RTK)表达并呈可溶形式，其只携带胞外域。VEGFR-2似乎介导与VEGF的几乎所有已知的细胞反应，并在注定分化为成血成血管细胞和成血管细胞的中胚层祖细胞中表达。VEGFR-1的功能不太十分确定，但是被认为调节VEGFR-2信号转导。VEGF-C和VEGF-D，而非VEGF-A，也是介导淋巴管生成的第3受体(VEGFR-3)的配体。

血小板衍生生长因子(PDGF)是在血管生成中起作用的生长因子。存在多种形式的PDGF，所构成的二聚体含有两个A链(AA)、两个B链(BB)或混合的A/B链(AB)。PDGF是周细胞的有效促分裂原，周细胞是用作内皮细胞生长的支持物的一类细胞。PDGF受体(PDGFR)以两种形式(α和β)存在。PDGFR β对PDGF-BB具有最高亲和力，并且已表明呈融合蛋白-Fc形式或作为胞外可溶性受体的分泌蛋白质而发挥抗血管生成生物作用。最近，已证实在小鼠眼部血管新生模型(包括抗VEGF分子和拮抗性PDGF分子的组合)中有效的协同性抗血管生成活性。因此抗PDGF、抗VEGF疗法的组合可比单独的抗VEGF疗法发挥更高的抗血管生成活性。

可采用本领域已知的标准技术，将目标基因(即编码给定的抗血管生成抗体支架或抗血管生成分子的基因，例如本发明的VEGF受体或PDGF受体构建体)插入合适表达载体的克隆位点。编码VEGF受体分子的人(和其它哺乳动物)基因的核酸和氨基酸序列是已知的。参见例如美国专利号4,997,929、5,141,856、5,364,769、5,453,361、WO 93/06116、WO 95/30686，通过引用结合到本文中。

本发明考虑了各种特定的截短VEGF受体和/或PDGF受体构建体。还考虑了破坏VEGF与其受体或PDGF与其受体结合的抗血管生成抗体支架(即抗体和抗原结合片段及其衍生物、单链抗体等)。例如，本文所述的可溶性VEGFR受体蛋白包含分泌性VEGF受体1 (sVR1)、分泌性VEGF受体2 (sVR2)的片段和/或分泌性VEGF受体2和VEGF受体1的VEGF结合结构域的嵌合体。这些分泌性蛋白质结合VEGF，并且含有多个Ig样结构域。来自VR1和VR2两者的几个免疫球蛋白样结构域用于本文公开的可溶性VEGF受体构建体。本领域技术人员应认识到，结构域2 (D2)是sVR1的VEGF-结合结构域(“VBD”)，但它需要结构域3 (D3)用于VEGF的高亲和力结合。sVR1的截短物(含有结构域1-3 (D1-3)或结构域2-3 (D-3))以比仅结构域2高的亲和力结合VEGF。此外，这些截短物还中和VEGF的血管生成作用。VR2对于高亲和力VEGF结合具有类似的要求，但是另外必须是二聚体的，因为单体形式以极低亲和力结合。本文所述的各种受体构建体包括VR2的结构域1、2和3以及VR1的结构域2和VR2的结构域3的嵌合体。形式可以是单体形式或二聚体形式。本文所述的可溶性VEGF受体构建体的二聚化组分是全长Fc区。

在另一个实例中，已表明PDGFR β胞外域1-5结合PDGF。PDGFR β胞外域1-3的截短物也结合PDGF。因此这些可溶性天然胞外域的组合或作为融合蛋白将允许PDGF的可溶性拮抗剂的产生。PDGFR β拮抗剂的使用可补充VEGF拮抗剂的抗血管生成作用，如多个眼部新血管形成模型所示(Jo等，2006)。

本发明还提供来源于(和/或生物类似于)已知的抗VEGF化合物及其生物反应性片段的抗血管生成抗体支架和受体融合蛋白。例如，已知的抗VEGF化合物包括但不限于抗VEGF受体片段(即阿柏西普)和/或抗VEGF抗体(或其抗原结合片段) (即贝伐单抗，DrugBank DB00112；或雷珠单抗DrugBank DB01270))。这些已知的抗VEGF化合物的序列是本领域已知的。在其它实例中，文献中还描述了生物活性拮抗性PDGF受体片段(Heidaran等，1990；Heidaran等，1995；Nakamura等2001)。

本发明具体的抗血管生成抗体支架和VEGF受体构建体包括：

1) p834 (VEGFR-Fc#1，[RS-VEGF受体1、结构域2和VEGF受体2、结构域3 (R1D2-R2D3)]-EFEPKSC-hIgG1 Fc)

2) p838 (VEGFR-Fc#2，[VEGF受体2、结构域1、2和3 (R2D1-R2D2-R2D3)])

3) p876 (VEGF抗体ScFv#1，有His标签)

4) p913 (VEGF抗体ScFv#2，没有His标签)

5) p873 (阿柏西普、VEGFR-Fc#3、VEGF受体1、结构域2和VEGF受体2、结构域3 (R1D2-R2D3) hIgG1 Fc)

6) p874/p875 (贝伐单抗、VEGF完全抗体#1，重链/轻链) 

7) p915/p914 (雷珠单抗、VEGF抗体Fab，重链片段/轻链)

8) p916/p914 (雷珠单抗、VEGF完全抗体#2，重链/轻链)

9) p917 (VEGFR-Fc#1、[RS-VEGF受体1、结构域2和VEGF受体2、结构域3 (R1D2-R2D3)]-hIgG1 Fc)

本文首次描述的VEGF构建体优于WO 09/149205中描述的那些VEGF受体构建体。具体地讲，缺乏Fc尾的VEGF受体构建体(参见例如WO 09/149205的SEQ ID NO: 12)在动物模型中是高度炎症性的，或者不能制备成稳定的细胞系。WO09/149205申请中的每个构建体包括IgG铰链区但不包括Fc尾。结果，这些构建体全部是F(ab)-2样分子。本领域技术人员应认识到，已报道了F(ab)’2蛋白显示免疫原性(参见Fumia等，Molecular Immunology 45:2951-61 (2008)；Lutz等，Autoinflammatory Reviews 7:508-13 (2008)，每份文献均通过引用以其整体结合到本文中)。

本发明的一个出人意料的发现是含有IgG铰链区加上Fc尾的VEGF受体构建体，例如构建体p834 (SEQ ID NO: 1)，在兔中产生远远少得多的免疫应答，而在临床情况下完全不产生。

本文所述的3个构建体p834 (VEGF-Fc)、p873 (阿柏西普)和p917 (阿柏西普RS)具有略不同的氨基酸序列。例如，p834与p873之间的差异包括下列差异：

a. 834在信号肽与成熟蛋白质之间含有RS氨基酸

b. 834在铰链处含有EFEPKSC

c. 834含有末端K (天然)

d. 873含有5’ attB1和3’ attB2重组位点(recomb site) (未翻译)

另外，产生了基于p873但除去attB1和attB2并且在信号肽与成熟蛋白质之间加回RS氨基酸的一种新的阿柏西普RS分子(p917)。图14中图解性地说明了这些序列差异，图15中显示了序列比对。p834和阿柏西普的序列比对见图16。

令人吃惊的是，p834预料不到地胜过(即产生更多的抗血管生成抗体支架) p873和p917构建体两者。

因此，p834在结构上既不同于本领域已知的其它构建体(即p873)和根据这些已知构建体产生的构建体(即p917)，并且又显示相对于所述构建体的令人吃惊和预料不到的优势。

根据834、873和917产生了细胞系，并且测量了抗血管生成抗体支架产量。结果概括如下。

转染p834 (以及p910、p969)每次都导致高表达克隆的产生。因此，明显存在有关p834的一些优势，其是873或917所缺少的—可能是具有赋予额外分子稳定性的额外半胱氨酸的较长铰链。

本发明的具体抗血管生成PDGF受体构建体包括：

10) p964 (PDGFR-Β结构域1-5受体-IgG4 Fc融合物) 

11) p963 (PDGFR-Β结构域1-5受体-IgG1 Fc融合物)

12) p974 (PDGFR-Β结构域1-3受体-IgG1 Fc融合物)

13) p978 (PDGFR-Β结构域1-5受体)

14) p977 (PDGFR-Β结构域1-5受体加上His6标签)

下面显示了这些构建体每一个的具体核苷酸和氨基酸序列。

为了清楚的目的，在本申请中如下辨别本发明的构建体、细胞系和抗血管生成抗体支架和/或抗血管生成分子：“pXXX”是指质粒(例如质粒p834)，“XXX-X-XX”是指细胞系(例如细胞系834-10-5)，而“XXX”是指分子(例如分子834)。然而，本领域技术人员应认识到，基于本发明的任何支架和构建体和细胞系可互换地提及、辨别和/或界定。

在一些实施方案中，可将相同的分子导入不同的表达载体，从而制备不同的质粒。例如，可将分子834 cDNA导入pCpG vitro free杀稻瘟素抗性载体以制备质粒p834 cDNA。或者，还可将分子834导入pCpG vitro free新霉素抗性载体以制备质粒p910；或导入pCpG潮霉素抗性载体以制备质粒p969 (参见实施例7)。

采用本文所述的重复转染方法，可将相同(或不同的)抗血管生成抗体支架和/或抗血管生成分子的多个拷贝掺入细胞(例如ARPE-19细胞)中。例如，如果重复转染方法采用2次转染，则产生第二代构建体(910)，其含有两拷贝的834 cDNA。同样地，如果重复转染方法采用3次转染，则产生第三代构建体(969)，其含有3拷贝的834 cDNA。

如图17所示，将963 PDGFR-Fc细胞系和910(834)第二代VEGFR-Fc细胞系作为单一细胞系或作为细胞系的混合物(“混合载荷”)包封在单个ECT装置中。在2小时培养后，装置条件培养基的蛋白质印迹分析显示混合载荷的装置同时分泌963 PDGFR-Fc和910(834) VEGFR-Fc蛋白两者。

各种各样的宿主/表达载体组合可用于表达编码生长因子或其它目标生物活性分子的基因。使用表达载体(即重组DNA分子)实现长期稳定的体内表达，所述载体中编码抗血管生成抗体支架或抗血管生成分子(例如VEGF受体或PDGF受体)的基因与在体内植入哺乳动物宿主时不进行减量调节的启动子有效连接。合适的启动子包括例如强组成型哺乳动物启动子，例如β-肌动蛋白、eIF4A1、GAPDH等。应激诱导型启动子，例如金属硫蛋白1 (MT-1)或VEGF启动子也可是适宜的。另外，可以使用含有核心启动子和定制5’ UTR或增强子元件的杂合启动子。其它已知的能够控制基因表达的非反转录病毒启动子，例如CMV或SV40或腺病毒的早期和晚期启动子是适宜的。还可加入增强子元件以赋予应激环境(例如低O₂)下的额外基因表达。一个实例是红细胞生成素增强子，其在低氧诱导下赋予相关基因元件增量调节。

然后可使用含有目标基因的表达载体转染所需细胞系。可利用标准转染技术例如脂质体、磷酸钙共沉淀、DEAE-葡聚糖转染或电穿孔。可购买市售哺乳动物转染试剂盒，例如Fugene6 (Roche Applied Sciences)。另外，可使用病毒载体转导所需细胞系。合适病毒载体的实例是市售的病毒载体的pLenti家族(Invitrogen)。可以使用人哺乳动物细胞。在所有情况下，重要的是装置中所含细胞或组织不被污染或掺杂。对于需要重链和轻链组分的抗体支架蛋白，各自编码相关抗体重链或轻链的双重构建体可同时共转染，从而得到表达功能性二价Fab和四价完全抗体分子的细胞系。

用于所公开的构建体的优选启动子包括SV40启动子和CMV/EF1α启动子，如图1所示。

其它有用的表达载体可由例如染色体、非染色体的区段和合成DNA序列组成，例如各种已知的SV40衍生物和已知的细菌质粒例如pUC，来自大肠杆菌(E. coli)的pBlueScript^TM质粒，包括pBR322、pCR1、pMB9及其衍生物。含有遗传霉素(G418)、潮霉素或杀稻瘟素药物选择基因的表达载体(Southern, P. J., In Vitro, 18, 第315页(1981)；Southern, P. J.和Berg, P., J. Mol. Appl. Genet., 1, 第327页(1982))也是有益的。这些载体可利用各种不同的增强子/启动子区以驱动目标生物基因和/或赋予抗性以用毒素选择的基因(例如G418、潮霉素B或杀稻瘟素)两者的表达。可使用各种不同的哺乳动物启动子以指导G418和潮霉素B基因和/或目标生物基因的表达。G418抗性基因编码氨基糖苷磷酸转移酶(APH)，其酶促地使加入培养基中的G418 (100-1000 μg/μl)失活。只有表达APH基因的那些细胞可在通常还导致第二生物基因表达的药物选择后存活。潮霉素B磷酸转移酶(HPH)基因编码特异性修饰潮霉素毒素的酶和并使之失活。用与潮霉素B磷酸转移酶基因相同的质粒共转染或包含在该质粒中的基因，可在50-200 μg/ml浓度的潮霉素B存在下优先表达。

可使用的表达载体的实例包括但不限于市售pRC/CMV (Invitrogen)、pRC/RSV (Invitrogen)、pCDNA1NEO (Invitrogen)、pCI-Neo (Promega)、pcDNA3.3 (Invitrogen)和GS载体系统(Lonza Group，Switzerland)。其它合适的市售载体包括pBlast、pMono或pVitro。在一个优选的实施方案中，表达载体系统是可获得的具有新霉素(G418)、潮霉素和杀稻瘟素抗性基因的pCpGfree-vitro表达载体(InvivoGen，San Diego，CA)) (参见图1)。

在一个实施方案中，可以使用含有突变型DHFR和完整pUC18序列(包括多接头)的cDNA的pNUT表达载体。参见例如Aebischer, P.等, Transplantation, 58, 第1275-1277页(1994)；Baetge等, PNAS, 83, 第5454-58页(1986)。可对pNUT表达载体进行修饰，使得DHFR编码序列被G418或潮霉素药物抗性的编码序列置换。pNUT表达载体内的SV40启动子还可用任何合适的组成型表达的哺乳动物启动子(例如上述启动子)置换。

本领域技术人员应认识到，还可使用任何其它合适的市售表达载体(例如pcDNA家族(Invitrogen)、pBlast、pMono、pVitro或pCpG-vitro (Invivogen))。调节表达的主要元件通常存在于表达盒中。这些元件包括启动子、5’非翻译区(5’ UTR)和3’非翻译区(3’ UTR)。合适表达载体的其它元件对质粒整合或表达可能至关重要，但可能不是容易地显而易见。技术人员能够设计和构建合适的表达载体用于所要求保护的发明。合适载体的选择、设计和/或构建尽在本领域常规技术水平内。

已克隆了编码VEGF1、VEGF2、PDGF α和PDGF β受体的基因和cDNA，且已发表了其核苷酸序列。(GenBank Accession U01134和AF063658、NM_006206、BC032224)。可采用标准重组DNA方法，例如PCR扩增、用寡核苷酸探针的基因组和cDNA文库筛选，来获得编码可用于本发明的生物活性分子的非公开可获得的其它基因。编码生物活性分子的任何已知基因可用于本发明的方法。

选择的细胞是ARPE-19细胞系，一种自发产生的连续性人视网膜色素沉着的上皮细胞系。然而，本领域技术人员应认识到，还可使用其它合适的细胞，包括但不限于CHO细胞、BHK细胞、RPE (原代细胞或永生化细胞)。细胞选择取决于预定的应用。可针对特定抗血管生成抗体支架或VEGF受体构建体的分泌来选择包封细胞。还可使用合成和分泌构建体的激动剂、类似物、衍生物或片段(其具有活性)的细胞。本领域技术人员应认识到，其它合适的细胞类型还可经遗传工程改造以分泌本文所述的任何抗血管生成抗体支架或VEGF受体构建体。

为了成为用于基于包封细胞的递送系统的平台细胞系，细胞系应尽可能多地具有以下特性：(1)细胞在严格条件下应是适应性强的(hardy) (包封细胞在无血管组织腔隙例如在中枢神经系统或眼中，特别在眼内环境中应能起作用)；(2)细胞应能够被遗传工程改造(需要将所需的治疗因子改造进入细胞)；(3)细胞应具有相对长的寿命(细胞应产生足够的子代以便储存、表征、工程改造、安全试验和临床批量制造)；(4)细胞应优选为人源的(这增加包封细胞与宿主间的相容性)；(5)装置中的细胞应显示体内大于80%存活力持续超过1个月的时间(这确保长期递送)；(6)包封细胞应递送有效量的有益生物制品(这确保治疗的有效性)；(7)细胞应具有低水平的宿主免疫反应(这确保移植物的长寿命)；和(8)细胞应是非致瘤的(以在装置渗漏的情况下为宿主提供额外的安全性)。

ARPE-19细胞系(参见Dunn等, 62 Exp. Eye Res. 155-69 (1996)；Dunn等, 39 Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 2744-9 (1998)；Finnemann等, 94 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 12932-7 (1997)；Handa等, 66 Exp. Eye. 411-9 (1998)；Holtkamp等, 112 Clin. Exp. Immunol. 34-43 (1998)；Maidji等, 70 J. Virol. 8402-10 (1996)；美国专利号6,361,771)显示用于包封细胞型递送系统的成功平台细胞的所有特征。ARPE-19细胞系可获自美国典型培养物保藏中心(American Type Culture Collection, ATCC编号CRL-2302)。ARPE-19细胞是正常的视网膜色素上皮(RPE)细胞，并表达视网膜色素上皮细胞特异性标志物CRALBP和RPE-65。ARPE-19细胞形成稳定的单层，其显示形态和功能极性。

本发明的遗传工程改造的ARPE-19细胞表达本发明的一种或多种抗血管生成抗体支架或抗血管生成分子以产生治疗量的抗血管生成抗体支架和/或抗血管生成分子。在一些实施方案中，经遗传工程改造的ARPE-19细胞能够产生至少10,000 ng/天/10⁶个细胞。优选这些细胞能够产生这个量持续至少3个月的时间。

在其它实施方案中，可采用重复转染方法，将这些分子导入ARPE-19细胞。重复转染含有至少1次转染、2次转染、3次转染或更多次转染(例如4、5、6、7、8、9、10次或更多次)转染。如果重复转染为1次转染，则本发明的细胞系可产生介于10,000与30,000 ng/天/10⁶个细胞之间、优选大约或至少15,000 ng/天/10⁶个细胞的基于一种或多种抗体支架的生物制剂和受体融合蛋白(即抗血管生成抗体支架或抗血管生成分子)。或者，如果重复转染为2次转染，则细胞系可产生介于30,000与50,000 ng/天/10⁶个细胞之间、优选大约或至少35,000 ng/天/10⁶个细胞的一种或多种抗血管生成抗体支架或抗血管生成分子。在其它实施方案中，如果重复转染为3次转染，则细胞系产生介于50,000与75,000 ng/天/10⁶个细胞之间、优选大约或至少70,000 ng/天/10⁶个细胞的一种或多种抗血管生成抗体支架或抗血管生成分子。在一些实施方案中，可采用这类重复转染，将所述抗血管生成抗体支架或抗血管生成分子导入细胞。或者，在重复转染的每次转染中，不同的抗血管生成抗体支架或抗血管生成分子被导入细胞。

当使用本发明的装置时，优选将介于10²与10⁸个工程改造的ARPE-19细胞、最优选将已经遗传工程改造以分泌本文所述一种或多种抗血管生成抗体支架或VEGF或PDGF受体构建体的0.5-1.0 x 10⁶或5x10²-6x10⁵个ARPE-19细胞包封在各个装置中。可通过植入较少或较多数目的囊，来控制剂量，优选每名患者介于1和50个囊。本文所述眼用装置能够递送介于约0.1 pg与1000 μg/眼/患者/天之间的一种或多种抗血管生成抗体支架或者一种或多种可溶性VEGF受体或PDGF受体构建体。在一个非限制性实例中，治疗量为每眼500-50,000 ng稳态(steady state)。在另一个实例中，治疗量为每眼至少10 μg/ml稳态。此外，本发明的细胞系和装置能够表达这个治疗量为期至少3个月的时间。

用于分离产生选定产物的细胞或组织的技术和程序是本领域技术人员已知的，或者可在不超过常规实验的情况下改编自已知程序。

如果待分离的细胞是适于体外生长的复制性细胞或细胞系，则特别有利的是产生这些细胞的细胞库。细胞库的一个特别优势是它是从细胞的相同培养物或批次制备的细胞来源。即所有细胞来源于相同的细胞源并且暴露在相同条件和应激下。因此，小瓶可作为均质培养物处理。在移植情况下，这大大促进了相同装置或替换装置的制作。它还允许简化的试验方案，这就确保了植入细胞不含反转录病毒等。它还允许载体体内和体外的平行监测，因此允许研究对体内驻留是独特的作用或因素。

本文所用术语“个体”或“接受者”或“宿主”可互换使用，用以指人或动物受试者。

“生物活性分子” (“BAM”)是能够对植入本发明装置的个体的身体发挥生物学上有益的作用的物质。例如，本文所述抗血管生成抗体支架和VEGF受体构建体是BAM的实例。

术语“囊”和“装置”和“载体”在本文可互换使用，用以指本发明的ECT装置。

除非另有说明，否则术语“细胞”意指任何形式的细胞，包括但不限于组织所容纳的细胞、细胞簇和各个分离的细胞。

本文所用“生物相容性囊”或“生物相容性装置”或“生物相容性载体”意指所述囊或装置或载体在植入个体中时，不会引起足以导致所述囊被排斥或例如通过降解赋予其不可操作性的有害宿主反应。

本文所用的“免疫隔离囊”或“免疫保护囊”或“免疫隔离装置”或“免疫保护装置”或“免疫隔离载体”或“免疫保护载体”意指所述囊在植入个体中时，有利地分配装置细胞内容物，并使宿主免疫系统对其核心内的细胞的有害作用减到最小。

本文所用“生物活性分子的长期稳定表达”意指以足以保持其有益生物活性为期1个月以上、优选3个月以上、最优选6个月以上时间的水平持续产生生物活性分子。装置及其内容物的植入能够体内保持功能性为期3个月以上，并且在许多情况下为期1年以上，而在一些情况下长于两年或更多年。

术语“外罩”和“半透膜”在本文可互换使用。

术语“内部支架”是可用于本文所述装置的“基质”的实例。

包绕核心的外罩膜的“半渗透”性质允许由细胞产生的分子(例如代谢物、营养物和/或治疗性物质)从装置中扩散到周围的宿主眼组织，但足够不渗透以保护核心中的细胞免于宿主的有害免疫攻击。

从载体的核心中排除IgG不是免疫隔离的标准，因为在大多数情况下，仅IgG不足以产生靶细胞或组织的细胞溶解。因此，对免疫隔离囊，考虑了高达1000 kD的外罩标称分子量截止(MWCO)值。优选MWCO介于50-700 kD之间。最优选MWCO介于70-300 kD之间。参见例如WO 92/19195。在一个优选的实施方案中，MWCO为500 kD。

本发明还涉及生物相容性、任选免疫隔离和/或免疫保护的、用于将本文所述抗血管生成抗体支架或可溶性VEGF受体的一种或多种递送至眼的装置。这类装置含有核心和包绕核心的生物相容性外罩，所述核心含有产生或分泌抗血管生成抗体支架、VEGF受体或PDGF受体的活细胞，其中所述外罩具有允许抗血管生成抗体支架或VEGF受体扩散至眼和中枢神经系统(包括脑、脑室、脊髓)的分子量截止值(“MWCO”)。

本发明还提供生物相容性的和可植入的以及任选免疫隔离和/或免疫保护的装置，其含有具有产生或分泌一种或多种抗血管生成抗体支架或抗血管生成分子的细胞的核心和包绕细胞的半透膜，所述半透膜允许一种或多种抗血管生成抗体支架或抗血管生成分子从中扩散通过。

这类装置可包括以下额外特性的1、2、3、4、5、6、7个或全部：

a. 核心含有约0.5-1.0 x 10⁶个ARPE-19细胞；

b. 装置的长度约为4 mm-11 mm；

c. 装置的内径介于0.9 mm-1.2 mm之间；

d. 装置的末端使用甲基丙烯酸甲酯密封；

e. 半透膜具有约100 nm的中值孔径大小；

f. 半透膜的标称分子量截止值(MWCO)为500 kD；

g. 半透膜的厚度介于90-120 um之间；

h. 核心含有内部支架，其中支架包含占装置内体积40-85%的聚对苯二甲酸乙二醇酯(PET)纤维；

i. 其任何组合。

各种生物相容性囊适于递送本发明的分子。有益的生物相容性聚合物囊包含(a)含有一种或多种细胞的核心，或悬浮于液体培养基中，或固定在生物相容性基质内，和(b)包含不含分离细胞的膜的包绕外罩，其是生物相容性的，并允许细胞产生的生物活性分子扩散入眼中。

许多转化的细胞或细胞系被有利地隔离在具有液体核心的囊内，所述核心包含例如营养培养基和任选含有维持细胞存活力和功能的其它因子的来源。本发明装置的核心可起生长因子(例如催乳素或胰岛素样生长因子2)、生长调节物质例如转化生长因子β (TGF-β)或成视网膜细胞瘤基因蛋白质或营养物转运增强剂(例如全氟化碳，其可提高核心中溶解氧的浓度)的贮库的作用。这些物质的某些还适于包含在液体培养基中。

另外，任何本发明的装置还可用作所需药物或生物治疗剂受控递送的贮库。在这种情况下，核心含有高浓度的选定药物或生物治疗剂(单独或与细胞或组织组合)。另外，还可将伴随载体(satellite vehicle)植入接受者中，所述伴随载体含有在其中植入本发明的装置的身体部位创造或产生宜人环境的物质。在这类情况下，将含有免疫隔离的细胞的装置与释放控制量的例如以下物质的伴随载体一起植入所述部位：减量调节或抑制接受者的炎性反应的物质(例如抗炎类固醇类)或刺激毛细血管床向内生长的物质(例如血管生成因子)。

或者，核心可包含稳定细胞位置的水凝胶或其它生物相容性材料的生物相容性基质(例如胞外基质组分)。本文的术语“水凝胶”是指交联亲水聚合物的三维网。该网呈基本由水组成的凝胶的形式，优选凝胶为90%以上的水。形成水凝胶的组成成分归入3类。第1类带有净的负电荷(例如藻酸盐)。第2类带有净的正电荷(例如胶原和层粘连蛋白)。市售胞外基质组分的实例包括Matrigel^TM和Vitrogen^TM。第3类为净的中性电荷(例如高度交联的聚氧化乙烯或聚乙烯醇)。

任何合适的基质或隔离物都可用于核心内，包括沉淀脱乙酰壳多糖、合成聚合物和聚合物共混物、微载体等，这取决于待包封细胞的生长特性。

或者，装置可具有内部支架。支架可防止细胞聚集，并改善细胞在装置内的分布。(参见PCT公布号WO 96/02646)。支架限定了包封细胞的微环境，并使细胞良好地分布在核心内。特定装置的最佳内部支架十分依赖于待使用的细胞类型。在这类支架不存在时，贴壁细胞聚集形成聚簇。

例如，内部支架可以是纱线或网格。用于形成纱线或网格内部支架的细丝由任何合适的生物相容性的基本不可降解的材料形成。(参见美国专利号6,303,136和6,627,422，所述专利通过引用结合到本文中)。优选本发明的囊可类似于PCT国际专利申请WO 92/19195或WO 95/05452 (通过引用予以结合)或美国专利号5,639,275、5,653,975、4,892,538、5,156,844、5,283,187或5,550,050 (通过引用予以结合)中描述的囊。可用于形成纱线或织网的材料包括能够形成纤维的任何生物相容性聚合物，例如丙烯酸类、聚酯、聚乙烯、聚丙烯、聚丙烯腈、聚对苯二甲酸乙二醇酯、尼龙、聚酰胺、聚氨酯、聚丁酯或天然纤维例如棉、丝、壳多糖或碳。可将任何合适的热塑聚合物、热塑弹性体或具有成纤维性质的其它合成或天然材料插入预制的中空纤维膜或由平膜片(flat membrane sheet)形成的中空圆柱体中。例如，用于缝合材料或用于血管移植物制备中的丝、PET或尼龙细丝是十分有助于这种应用类型的。在其它实施方案中，可使用或编织金属带或金属线。这些丝状材料的每一种都具有受良好控制的表面和几何性质，可以大规模产生，并具有长的植入物使用历史。在某些实施方案中，可使细丝“纹理化”以提供细胞突出部分可与之连接的粗糙表面和“手柄(hand-hold)”。细丝可用胞外基质分子包覆或是表面经处理的(例如等离子体辐射(plasma irradiation))以提高对细丝的细胞粘附。

在一些实施方案中，优选以非随机单向定向组构的细丝捻成束形成不同厚度和空隙体积的纱线。空隙体积定义为存在于细丝之间的间隙。纱线的空隙体积应在20-95%之间变化，但优选介于50-95%间。在一个优选的实施方案中，内部支架由填充装置内体积40-85%之间的PET纤维制成。细丝间优选的空隙空间介于20-200 μm之间，足以允许沿纱线的长度用细胞接种支架，并允许细胞附着于细丝。包含纱线的细丝的优选直径介于5-100 μm之间。这些细丝应具有足够的机械强度以允许捻成包含纱线的束。细丝截面形状可改变，其中环状、矩形、椭圆形、三角形和星形横截面是优选的。

或者，可将细丝或纱线织成网。可使用类似于线轴的导纱器(carrier)，在编织机上产生网，所述导纱器含有单丝或复丝，其在编织期间用于向网提供纱线或细丝。导纱器的数目是可调节的，并且可用相同细丝或具有不同组成和结构的细丝组合缠绕。由经纬密度(pick count)确定的编织物角度受导纱器的转运速度和生产速度控制。在一个实施方案中，使用心轴以产生中空网格管。在某些实施方案中，编织物被构造成单层，在其它实施方案中，它是多层结构。编织物的拉伸强度是单个细丝拉伸强度的线性求和。

在其它实施方案中，构建管状编织物。可将编织物插入细胞接种在上面的中空纤维膜中。或者，可允许细胞渗入网格管壁以便可供细胞附着的表面积最大化。当这类细胞渗入发生时，编织物既用作细胞支架基质，又用作装置的内支架。与备选方法相比，编织物支持的装置的拉伸强度的提高显著较高。

注意到，对于不是免疫特许的植入部位，例如眼周部位和前房(水状体)和后房(玻璃体)以外的其它部位，囊优选是免疫隔离的。生物相容性材料的组分可包括环绕半透膜和内部细胞支持性支架材料。转化的细胞优选被接种在支架材料上，其被上述选择性渗透膜包封。此外，粘合纤维(bonded fiber)结构可用于细胞植入。(参见美国专利号5,512,600，通过引用予以结合)。生物可降解聚合物包括例如由聚乳酸PLA、聚乳酸-乙醇酸共聚物PLGA和聚乙醇酸PGA及其等同物组成的聚合物。泡沫支架已用于提供移植细胞可附着在上面的表面(PCT国际专利申请顺序号98/05304，通过引用予以结合)。编织的网格管已用作血管移植物(PCT国际专利申请WO 99/52573，通过引用予以结合)。另外，核心可由自水凝胶形成的固定化基质组成，所水凝胶述稳定细胞的位置。水凝胶是凝胶形式的交联亲水聚合物的三维网，基本由水组成。

各种聚合物和聚合物共混物可用来制造环绕半透膜，包括聚丙烯酸脂(包括丙烯酸共聚物)、聚乙二烯、聚氯乙烯共聚物、聚氨酯、聚苯乙烯、聚酰胺、乙酸纤维素、硝酸纤维素、聚砜(包括聚醚砜)、聚磷腈、聚丙烯腈、聚丙烯腈/氯乙烯共聚物及其衍生物、共聚物和混合物。优选环绕半透膜是生物相容性半渗透性中空纤维膜。美国专利号5,284,761和5,158,881 (通过引用予以结合)公开了这类膜和制备所述膜的方法。环绕半透膜由聚醚砜中空纤维形成，例如美国专利号4,976,859或美国专利号4,968,733 (通过引用予以结合)描述的聚醚砜中空纤维。替代的环绕半透膜材料是聚砜。

所述囊可以是适于保持生物活性并提供产物或功能递送通路的任何构造，包括例如圆柱形、矩形、盘形、块形(patch-shaped)、卵形、星形或球形。此外，可将囊盘绕或缠绕成网状或嵌套结构。如果所述囊在植入后要回收，则趋向于导致所述囊从植入部位迁移的构造不是优选的，例如小得足以在接受宿主血管中移动的球形囊。某些形状，例如矩形、小块、圆盘、圆柱体和平片提供较大的结构整体性，如需要回收则是优选的。

优选装置具有在植入期间有助于保持装置安置并有助于回收的系链。这类系链可具有适于使所述囊牢固附着在适当位置的任何合适形状。例如，缝线可为环、圆盘或缝线。在一些实施方案中，系链的形状像孔眼，使得可使用缝线将系链(因此将装置)牢固附着在巩膜上或其它合适的眼结构上。在另一个实施方案中，系链在一端与所述囊是连续的，而在另一端形成预先穿有缝线的针。在一个优选的实施方案中，系链是适于将所述囊锚定于眼结构的锚环。系链可由形状记忆金属和/或本领域已知的任何其它合适的医学级材料构成。

在中空纤维构造中，纤维可具有小于2000微米、优选小于1200微米的内径。还考虑了具有小于300-600微米的外径的装置。在一个优选的实施方案中，内径介于0.9 mm与1.2 mm之间。对于植入眼中，在中空纤维构造中，所述囊的长度优选可介于0.4 cm至1.5 cm之间，长度最优选介于0.4至1.0 cm之间。在一个优选的实施方案中，装置的长度介于4 mm与11 mm之间。较长的装置可容纳于眼中，然而，对于牢固且合适的安置，可能需要弧形或弓形。中空纤维构造优选用于眼内安置。

对于眼周安置，考虑了中空纤维构造(尺寸基本同上)或平片构造。考虑用于平片的上限约为5 mm x 5 mm—呈正方形。还考虑了具有大致相同表面积的其它形状。

制造用于递送抗血管生成抗体支架、可溶性VEGFR或可溶性PDGFR的微装置可具有介于1毫米与2.5毫米之间的长度，其内径介于300与500微米之间，外径介于450与700微米之间。在这类微化装置中，可使用含有介于10与60条单丝的PET的内部支架材料。这些微化装置的分子量截止值范围介于100与2000 kDa之间。相比之下，70 kDa葡聚糖的被动扩散范围介于100与2000 x 10^-10 cm²/s之间。虽然本文所述的任何合适的膜材料可用于这些微化装置，但是两种优选的材料是聚醚砜和/或聚砜。此外，可制造具有或没有由合适材料(例如镍钛诺)制成的锚的微装置。有关微化装置的完整论述参见WO2007/078922，该文献通过引用结合到本文中。

通过本领域技术人员熟悉的相转化方法(phase inversion process)，制备了考虑用于递送本文所述抗体支架、VEGFR和PDGFR构建体的选择性渗透特性的膜以驻留在膜的内层(inner skin)内。内表面上的排斥层(rejecting skin)的选择性渗透特性的开发改进孔结构的制造一致性和排斥性质的控制，同时还在包封装置的整个下游制造期间保护膜性质。开发本发明描述的膜的选择性渗透特性以允许治疗必需品所需的分子大小通过；然而，还使所述特性最优化以允许释放所必需的最大尺寸，同时限制仅略大于既定蛋白质大小的分子进入所述囊中。

由于用于本发明的细胞和宿主接受者之间相互作用的同种异体性质，对排斥的最大顾虑来自直接针对移植的包封细胞的宿主免疫细胞复合物介导的攻击，而不是来自细胞溶解补体介导的攻击复合物或通过抗体与补体相互作用的相互作用。虽然用于本发明的膜被设计成允许高达免疫球蛋白G大小的分子通过，但该膜仍将限制例如Clq (约400 kDa) (细胞攻击复合物装配所需要的最大分子)等分子的转运。因此，用于本发明的膜的设计将使宿主内的营养物和代谢物交换率最大化，支持宿主内移植细胞的长期存活力，允许将靶治疗分子从包封细胞大量递送给宿主，同时防止包封细胞的补体识别和与宿主的直接细胞接触。

考虑与本文所述抗血管生成抗体支架、VEGFR和PDGFR构建体一起使用的开放式膜(open membrane)可具有高达1000 kD的标称分子量截止(MWCO)值。优选MWCO介于50-700 kD之间，理想的是约为300 kD。在一个优选的实施方案中，MWCO为500 kD。所考虑的膜的标称孔径大小可具有约100 nm的标称孔径大小，并且根据孔隙的高斯分布，最大绝对孔隙应小于150 nm。70 kDa大小的葡聚糖分子的被动扩散介于100与2000 x10^-10 cm²/s之间，优选70 kDa葡聚糖的扩散系数更接近2000 x10^-10 cm²/s。与抗血管生成抗体支架和VEGFR构建体一起使用的开放式膜可具有约100 ml/min/m²/mmHg的较高水压渗透性值。或者，如果不使用极开放式膜，则可使用更加“免疫隔离的”和/或“免疫保护的”膜。对于这类免疫隔离膜，水压渗透性通常可为0.4-170 ml/min/m²/mmHg的范围，例如0.5-100 ml/min/m²/mmHg，优选15至50 ml/min/m²/mmHg的范围。采用测定本领域技术人员公认的单分子量排斥的测试程序，更加“免疫隔离的”膜的标称分子量截止值将排斥90%的牛白蛋白，而70 kDa葡聚糖分子的扩散通量将依旧约为2000 x10^-10 cm²/s。按Dionne等，ASAIO文摘，第99页(1993)和Colton等，The Kidney，主编Brenner B M和Rector F C，第2425-89页(1981)所述定义、测定和计算的所述囊的葡萄糖传质系数将大于10^-6 cm/sec，优选大于10^-4 cm/sec。

在一个优选的实施方案中，中值孔径大小约为100 nm。环绕本发明装置的核心的周围区或外围区(外罩)可以是选择性渗透的、生物相容性的和/或免疫隔离的。它以这类方式产生，使得它不含分离的细胞，并且完全环绕(即隔离)核心，从而防止核心中的任何细胞和接受者身体之间的接触。生物相容性半渗透中空纤维膜和制备所述膜的方法公开于美国专利号5,284,761和5,158,881 (另参见WO 95/05452)，其每一份均通过引用以其整体结合到本文中。例如，囊外罩可由聚醚砜中空纤维形成，例如描述于美国专利号4,976,859、4,968,733和5,762,798的聚醚砜中空纤维，每一份通过引用结合到本文中。

为成为选择性渗透的，以这类方式形成外罩使得它具有这样的分子量截止值(“MWCO”)范围，其既适于预期在装置植入后将遭遇的免疫反应的类型和程度，又适于最大物质的分子大小，所述最大物质进出装置进入眼的通过是期需的。在植入装置后由接受者发动的免疫攻击的类型和程度部分取决于其内部隔离的部分的类型，部分取决于接受者的性质(即接受者与BAM来源在遗传上相关的密切程度)。如果植入组织或细胞与接受者是同种异体时，则免疫排斥主要可通过接受者免疫细胞针对植入细胞的细胞介导的攻击而进行。如果组织或细胞对接受者是异种的，则通过接受者细胞溶解补体攻击复合物装配的分子攻击可占优势，以及抗体与补体的相互作用。

外罩允许高达预定大小的物质通过，但防止更大的物质通过。更具体地讲，以这样的方式产生周围区或外围区使得它具有预定大小范围的孔隙或空隙，结果装置是选择性渗透的。环绕外罩的MWCO必须足够小以防止对核心进行免疫攻击所需的物质进入，但又足够大以允许将抗血管生成抗体支架或VEGF受体或PDGF受体递送给接受者。优选在使用截短的抗血管生成抗体支架或VEGF受体或PDGF受体时，本发明装置的生物相容性外罩的MWCO约为1 kD至约150 kD。然而，如果需要递送未截短的抗血管生成抗体支架或受体，则应使用MWCO大于200 kD的开放式膜。

本文有关装置的外罩所用的术语“生物相容性”总的来说是指装置及其内容物。具体地讲，它是指植入完整装置及其内容物以避免身体各种保护系统的有害作用并保持功能持续可观的一段时间的能力。本文所用术语“保护系统”是指由本发明载体植入其中的个体的免疫系统发动的免疫攻击的类型和其它排斥机制，例如可由个体身体中存在的异物诱导的纤维变性反应、异物反应和其它炎性反应类型。除了避免免疫系统的保护性反应或异物纤维变性反应以外，本文所用术语“生物相容性”还暗示没有由载体及其内容物引起的特定不良细胞毒性或全身作用，例如可能干扰载体或其内容物的所需功能的那些。

可以这样的方式选择或设计装置的外表面，使得它特别适于植入选定部位。例如，外表面可以是光滑的、斑点状的或粗糙的，这取决于是否需要被周围组织的细胞附着。还可选择或设计特别适于所选植入部位的形状或构造。

装置周围区或外围区(外罩)的生物相容性由组合因素引起。对于生物相容性和持续功能性重要的是装置形态、疏水性和装置本身表面上不存在不良物质或从装置本身不浸出不良物质。因此，要避免引起异物反应的刷状表面(brush surface)、折叠、夹层或其它形状或结构。此外，装置形成材料足够纯以确保不需要的物质不会从装置材料自身中浸出。另外，在装置制成后，避免用这样的流体或材料(例如血清)处理装置的外表面，所述流体或材料可附着到装置或被装置吸附并随后损害装置的生物相容性。

首先，用于形成装置外罩的材料是根据其与植入装置接受者的组织相容并被所述组织接受的能力选择的物质。使用对接受者或对分离的细胞无害的物质。优选的物质包括聚合物材料，即热塑聚合物。特别优选的热塑聚合物质是适度疏水的热塑聚合物物质，即具有如Brandrup J.等, Polymer Handbook 第3版, John Wiley & Sons, NY (1989)中定义的溶解参数的热塑聚合物物质，溶解参数介于8与15之间，或者更优选介于9与14之间(焦耳/m³)^1/2。选择具有足够低使得可溶于有机溶剂，却又足够高使得可以分配以形成合适的膜的溶解参数的聚合物物质。这类聚合物物质应基本上不含不稳定的亲核部分并且甚至在稳定剂不存在时应具有对氧化剂和酶的极高抗性。还必须考虑对于具体载体所考虑的体内驻留时间：必须选择当暴露于生理条件和应激时适当稳定的物质。已知充分稳定、甚至体内驻留时间延长例如超过一年或两年时间的许多热塑性塑料。

用于构建装置的材料的选择由详细描述于Dionne WO 92/19195 (通过引用结合到本文)的多个因素决定。简单来讲，可以使用各种聚合物和聚合物共混物来制造囊外罩。形成装置和其中的生长表面的高分子膜可包括聚丙烯酸脂(包括丙烯酸共聚物)、聚乙二烯、聚氯乙烯共聚物、聚氨酯、聚苯乙烯、聚酰胺、聚甲基丙烯酸甲酯、聚二氟乙烯、聚烯烃、乙酸纤维素、硝酸纤维素、聚砜、聚磷腈、聚丙烯腈、聚丙烯腈/氯乙烯共聚物及其衍生物、共聚物和混合物。

优选的铸膜液(membrane casting solution)包含溶于水混溶性溶剂二甲基乙酰胺(DMACSO)中的聚砜或溶于水混溶性溶剂丁内酯中的聚醚砜。这种铸造液可任选包含影响成品膜的通透性质的亲水或疏水添加剂。对于聚砜或聚醚砜，优选的亲水添加剂为聚乙烯吡咯烷酮(PVP)。其它合适的聚合物包含聚丙烯腈(PAN)、聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)、聚二氟乙烯(PVDF)、聚氧化乙烯、聚烯烃(例如聚异丁烯或聚丙烯)、聚丙烯腈/聚氯乙烯(PAN/PVC)和/或纤维素衍生物(例如乙酸纤维素或丁酸纤维素)。对于这些和其它合适的聚合物和共聚物，相容的水混溶性溶剂参见美国专利号3,615,024中的教导。

其次，用于制备装置的生物相容性外罩的物质不含可浸出性致热物质或否则有害的、刺激性的或免疫原性物质，或者彻底纯化以除去这类有害物质。此后，在植入前装置的整个制备或保持期间，要十分小心以防止装置或外罩被可能不利影响其生物相容性的物质掺杂或污染。

第三，以这样的方式形成装置的外部构造，包括其质地，使得它在植入后提供与接受者的眼部的最佳对接。还发现某些装置几何结构特别地引起异物纤维变性反应，应予以避免。因此，装置不应含具有夹层(例如刷状表面或折叠)的结构。总体来说，同一载体或邻近载体的相对载体表面或边缘应相隔至少1 mm，优选大于2 mm，最优选大于5 mm。优选的实施方案包括外径介于约200与1600 μm之间和长度介于约0.4与1 mm之间的圆柱体。优选本发明装置的核心具有介于约2 μl与20 μl之间的体积。然而，本领域技术人员应认识到，也可使用具有小于0.5 μl (例如约0.3 μl)的核心体积的“微化”装置。

生物相容性装置的环绕外罩可任选包括降低或防止植入载体的局部炎性反应和/或产生或促进植入细胞或组织的合适局部环境的物质。例如可包括免疫应答的一种或多种介质的抗体。可得到的可能有用的抗体(例如抗淋巴因子肿瘤坏死因子(TNF)和抗干扰素(IFN)的抗体)可包括在基质前体溶液中。同样地，可以包括抗炎类固醇。参见Christenson，L.等，Christenson, L.等, J. Biomed. Mat. Res., 23, 第705-718页(1989)；Christenson, L., Ph.D.论文, Brown University, 1989, 通过引用结合到本文。或者，可以包括刺激血管生成(毛细血管床的向内生长)的物质。

在一些实施方案中，本发明装置的外罩是免疫隔离和/或免疫保护的。即它保护装置的核心中的细胞免受其中植入装置的个体的免疫系统影响。这通过以下方面进行：(1)通过防止个体身体的有害物质进入核心，(2)通过将个体与核心中可存在的炎性物质、抗原物质或其它有害材料的接触减到最小，和(3)通过提供足以防止所隔离的部分与个体免疫系统的有害部分间的免疫接触的空间和物理屏障。

在一些实施方案中，外罩可以是超滤膜或微孔膜。本领域技术人员应认识到，超滤膜是具有约1-约100纳米范围的孔径大小的膜，而微孔膜具有介于约1至约10微米的范围。

这种物理屏障的厚度可变化，但它总是足够厚以防止屏障任一侧细胞和/或物质之间的直接接触。该区域的厚度范围一般为介于5与200微米之间；优选为10-100微米的厚度，特别优选为20-50或20-75微米的厚度。在一个优选的实施方案中，半透膜的厚度介于90与120 μm之间。可通过使用本发明的装置防止或使之降到最低的免疫攻击的类型包括由巨噬细胞、嗜中性粒细胞、细胞免疫应答(例如自然杀伤细胞和抗体依赖性T细胞介导的细胞溶解(ADCC))和体液应答(例如抗体依赖性补体介导的细胞溶解)引起的攻击。

囊外罩可由以下各种聚合物和聚合物共混物制造：包括聚丙烯酸脂(包括丙烯酸共聚物)、聚乙二烯、聚氯乙烯共聚物、聚氨酯、聚苯乙烯、聚酰胺、乙酸纤维素、硝酸纤维素、聚砜(包括聚醚砜)、聚磷腈、聚丙烯腈、聚丙烯腈/氯乙烯共聚物及其衍生物、共聚物和混合物。由这类材料制造的囊描述于例如美国专利号5,284,761和5,158,881，通过引用结合到本文中。还可以使用由聚醚砜(PES)纤维形成的囊，例如描述于美国专利号4,976,859和4,968,733 (通过引用结合到本文中)的囊。

根据外表面形态，将囊归类为1型(T1)、2型(T2)、1/2型(T1/2)或4型(T4)。这类膜描述于例如Lacy等，“Maintenance Of Normoglycemia In Diabetic Mice By Subcutaneous Xenografts Of Encapsulated Islets (包封胰岛的皮下异种移植物在糖尿病小鼠中保持血糖量正常)”，Science，254，第1782-84页(1991)，Dionne等，WO 92/19195和Baetge，WO 95/05452。优选为光滑的外表面形态。

本领域技术人员应认识到，具有选择性渗透的免疫隔离膜的囊外罩对于不是免疫特许的部位是优选的。相比之下，微孔膜或选择性渗透膜可适于免疫特许部位。对于植入免疫特许部位，由PES或PS膜制成的囊是优选的。

可采用本领域已知的密封囊的任何合适方法，包括应用聚合物黏合剂和/或卷曲、打结和热封。另外，也可使用任何合适的“干燥”密封方法。在这类方法中，提供基本上无孔的配件(fitting)，通过该配件引入含细胞溶液。在充填后，将囊密封。这类方法描述于例如美国专利号5,653,688、5,713,887、5,738,673、6,653,687、5,932,460和6,123,700，所述专利通过引用结合到本文中。在一个优选的方法中，装置的末端使用甲基丙烯酸甲酯密封。

按照本发明的方法，除本文所述的抗血管生成抗体支架或VEGF受体之外，还可以共同递送其它分子。例如，与抗血管生成因子一起递送一种或多种营养因子可能是优选的。

共同递送可以多种方式实现。在该实例中，抗体和抗体片段需要编码轻链和重链序列的构建体。首先，细胞可用含有编码所述分子的基因的各个构建体转染。其次，细胞可用含有两个或更多个基因以及必要的控制元件的单一构建体转染。第三，两个或更多个分别经工程改造的细胞系可以共同包封，或者可将一个以上装置植入目标部位。

对于某些适应症，可能优选的是将BAM同时递送至眼中的两个不同部位。例如，可能需要将神经营养因子递送至玻璃体以供应神经视网膜(RPE的神经节细胞)以及通过眼球筋膜下间隙递送抗血管生成因子(例如本发明的抗血管生成抗体支架或VEGF受体的一种或多种)以供应脉络膜血管系统。

本发明还考虑在治疗方案进程中使用不同的细胞类型。例如，可用含有第一细胞类型(例如BHK细胞)的囊装置植入患者中。如果之后患者对该细胞类型出现免疫应答，则可收回或移出囊，并植入含有第二细胞类型(例如CHO细胞)的第二囊。以这种方式，可连续提供治疗分子，即使患者对包封细胞类型之一产生免疫应答。

本发明的方法和装置欲用于灵长类动物，优选人宿主、接受者、患者、受试者或个体。对于本发明的装置和方法，考虑多个不同的眼植入部位。合适的植入部位包括但不限于眼的水样液和玻璃体液、眼周间隙、前房和/或眼球筋膜囊下(Subtenon’s capsule)。在体内，植入部位可包括皮下、腹膜内或CNS内。另外，植入可定位于需要所需生物疗法的病变处或附近的局部递送。这类病患部位的实例可为发炎关节、脑和CNS病变、良性或恶性肿瘤的部位。装置进入循环系统还可将体内潜在病患部位的范围延伸至远端影响的器官和组织。

接受者对植入装置的免疫应答的类型和程度将受接受者与核心内分离细胞的关系的影响。例如，如果核心含有同基因细胞，则这些将不会引起强烈的免疫反应，除非接受者遭受装置内有关特定细胞或组织类型的自身免疫。很少可得到同基因细胞或组织。在许多情况下，可获得同种异体或异种细胞或组织(即来自与未来的接受者相同物种或不同物种的供体)。使用免疫隔离装置允许在无需同时免疫抑制接受者的情况下，植入同种异体或异种细胞或组织。使用免疫隔离囊还允许使用不匹配细胞(异型(allographs))。因此，比起可用常规移植技术治疗的个体，本发明装置使得治疗更多的个体成为可能。

预期对异种移植的组织的免疫应答的类型和活力不同于将同基因或同种异体组织移植入接受者所遇到的应答。这种排斥主要可通过细胞介导的或补体介导的攻击进行。从载体的核心中排除IgG不是免疫保护的标准，因为在大多数情况下，仅IgG不足以产生靶细胞或组织的细胞溶解。使用免疫隔离装置，可能递送所需的高分子量产物或提供涉及高分子量物质的代谢功能，条件是将介导免疫攻击所必需的关键物质从免疫隔离囊中排除。这些物质可包含补体攻击复合物组分Clq，或它们可包含吞噬细胞或细胞毒性细胞。使用免疫隔离囊在这些有害物质与分离的细胞之间提供保护屏障。

虽然本发明的装置是大型囊(macrocapsule)，但本领域技术人员应认识到，还可使用例如描述于Rha、Lim和Sun的微囊。(参见Rha, C. K.等,美国专利号4,744,933；Methods in Enzymology 137, 第575-579页(1988)；美国专利号4,652,833；美国专利号4,409,331)。总体来说，微囊因以下方面而不同于大型囊：(1)从装置的外层完全排除细胞，和(2)装置外层的厚度。通常，微囊具有约1 μl体积，并含有小于10⁴个细胞。更具体地讲，微囊化一般每个囊包封约500-50,000个细胞。

可以使用具有较低MWCO的囊以进一步防止患者免疫系统的分子与包封细胞相互作用。

按照本文所述方法使用的任何装置必须在至少一维上使核心中的任何分离细胞与接受者的周围眼组织紧密靠近，以保持分离细胞的存活力和功能。然而，用于形成装置的材料的扩散限制在所有情况下并不仅仅指定其构造限制。可以使用改变或提高基础载体的扩散性质或营养物或氧运输性质的某些添加剂。例如，核心的内部培养基可补充氧饱和的全氟化碳，因此减少对血液携带的氧直接接触的需要。这将允许分离的细胞或组织保持活力，同时将例如血管紧张素的梯度从载体释放到周围组织，刺激毛细血管向内生长。Faithful, N. S. Anaesthesia, 42, 第234-242页(1987)和NASA Tech Briefs MSC-21480, U.S. Govt. Printing Office, Washington, D.C. 20402 (通过引用结合到本文中)提供了使用全氟化碳的参考文献和方法。或者对于克隆细胞系例如PC12细胞，可将经遗传工程改造的血红蛋白序列导入细胞系以产生优异的氧储备。参见NPO-17517 NASA Tech Briefs，15，第54页。

包封细胞还可通过环境控制和大量营养物和微量营养物补充引发(prime)分泌增加。重组细胞的上游开发领域众所周知的是，使培养基、pH和温度最优化可对细胞生长、密度和重组蛋白产量具有重大作用。以这样的方式引发的细胞和ECT装置可提高在植入宿主时的生产率，允许可用于疗法的增加的生产率表型延长。作为实例，这类营养化合物可以是但不限于Tris、HEPES、葡萄糖、蔗糖、磷脂、胆固醇、抗坏血酸、镁、钠、维生素、钾和钙、细胞条件培养基、胎牛血清、白蛋白、卵磷脂、鞘磷脂、脂蛋白、HDL、LDL、聚胺、乙醇胺、纤连蛋白、运铁蛋白(transferring)、层粘连蛋白、霍乱毒素、氢化可的松和其它类固醇类、前列腺素类、胰岛素、EGF、FGF2和其它生长因子、地塞米松、β-巯基乙醇和其它还原剂和硒。另外，可使用来自市售培养基供应商例如Biowhittaker、Gibco/Invitrogen、Hyclone、JRH、Expression Systems、Sigma、PAA和Irvine Scientific预先配制的培养基。

装置外罩的厚度应足以防止患者对存在的装置产生免疫应答。为此，装置优选具有至少1 μm或更大的厚度并且不含细胞。

另外，还可将强化结构元件掺入装置中。例如，可以这类方式制备这些结构元件，使得它们是不可渗透的，且被适当配置以允许将装置栓系或缝合在接受者的眼组织上。在某些情况下，这些元件可起将外罩牢固密封(例如在圆柱体的末端上)的作用，从而完成核心材料(例如模塑的热塑夹(thermoplastic clip))的隔离。在许多实施方案中，合乎需要的是这些结构元件不应堵塞选择性渗透的外罩的有效面积。

本发明的装置具有用于在植入后完全回收的足够大小和耐久性。本发明的一个优选装置具有约1-3uL体积的核心。微化装置的内部几何结构具有约0.05-0.1 uL的体积。

还可将至少一种额外的BAM与本文所述抗血管生成抗体支架和/或可溶性VEGF受体一起从装置中递送至眼。例如，可由细胞源或非细胞源提供至少一种额外的BAM。如果由非细胞源提供至少一种额外的BAM，则额外的一种或多种BAM可被包封、分散在细胞系统的一个或多个组件中或与其连接，所述组件包括但不限于：(a)密封剂；(b)支架；(c)外罩膜；(d)系链锚；和/或(e)核心培养基。在这类实施方案中，BAM从非细胞源的共同递送可从与细胞源的BAM相同的装置发生。

或者，可以使用两个或更多个包封细胞系统。例如，最少一个额外的生物活性分子可为核酸、核酸片段、肽、多肽、模拟肽(peptidomimetic)、碳水化合物、脂质、有机分子、无机分子、治疗剂或其任何组合。具体地讲，治疗剂可以是抗血管生成药物、甾体和非甾体抗炎药物、抗有丝分裂药物、抗肿瘤药物、抗寄生虫药物、IOP减压药(reducer)、肽药物和/或获准用于商业用途的任何其它生物活性分子药物。

合适的赋形剂包括但不限于获准用于制剂的任何不可降解聚合物或生物可降解聚合物、水凝胶、溶解度增强剂、疏水分子、蛋白质、盐或其它络合剂。

可通过本领域已知的任何合适方法，例如改变治疗剂的浓度和/或每只眼的装置数和/或改变包封赋形剂的组成，来改变非细胞的剂量。可通过改变：(1)每个装置的细胞数，(2)每只眼的装置数和/或(3)每个细胞的BAM生产水平，来改变细胞剂量。可通过改变例如转导细胞中BAM基因的拷贝数，或驱动BAM表达的启动子效率，来改变细胞产生。来自细胞源的合适剂量可介于约1 pg/天至约1000 mg/天的范围。

本发明还涉及用于制备本文所述大型装置的方法。装置可通过本领域已知的任何合适方法形成。(参见例如美国专利号6,361,771、5,639,275、5,653,975、4,892,538、5,156,844、5,283,138和5,550,050，所述每个专利均通过引用结合到本文中)。

还可根据其分子量，调整所使用的膜以控制分子(例如抗血管生成抗体支架或可溶性VEGF受体)的扩散。(参见Lysaght等, 56 J. Cell Biochem. 196 (1996)；Colton, 14 Trends Biotechnol. 158 (1996))。可采用包封技术，在使用或不使用免疫抑制药物的情况下，将细胞移植入宿主而又无免疫排斥。囊可由生物相容性材料制成，所述材料在植入宿主后，不引起足以导致所述囊被排斥或例如通过降解赋予其不可操作性的有害宿主反应。生物相容性材料对于大分子例如宿主免疫系统的组分是相对不渗透的，但对小分子例如胰岛素、生长因子和营养物则是可渗透的，同时允许排除代谢废物。通过本发明的组成，各种生物相容性材料适于递送生长因子。具有各种各样的外表面形态和其它机械和结构特性的多种生物相容性材料是已知的。

如果需要具有热塑膜或聚合物膜的外罩的装置，则可通过改变前体材料溶液(铸造液)的固体含量、水混溶性溶剂的化学组成或任选包括铸造液的亲水或疏水添加剂(如美国专利号3,615,024的教导)，来确定孔径大小范围和分布。还可通过改变凝固剂和/或浴剂(bath)的疏水性，来调节孔径大小。

通常，铸造液将包含含有溶解的水不溶性聚合物或共聚物的极性有机溶剂。这种聚合物或共聚物在与溶剂混溶性水相接触时沉淀，在界面部位形成选择性渗透的膜。膜中孔隙的大小取决于水相至有机相的扩散速率；亲水或疏水添加剂通过改变扩散速率而影响孔径大小。当水相进一步扩散到溶剂中，聚合物或共聚物的其余部分沉积形成有横隔片的支持体(trabecular support)，其赋予完成的装置机械强度。

装置的外表面同样取决于溶解的聚合物或共聚物沉积的条件(即暴露于空气中，这产生开放的、有横隔片的或海绵样外层；浸入水性沉淀浴剂，这导致光滑的选择性渗透膜双层；或暴露于水蒸气饱和的空气中，这导致中间结构)。

装置的表面质地部分取决于挤压喷嘴是定位于浴剂之上还是浸入浴剂中：如果喷嘴置于浴剂表面上，则将形成粗糙的外层，而如果喷嘴浸入浴剂中，则形成光滑的外表面。

周围或外围基质或膜可用构成核心的材料预形成或充填(例如使用注射器)，随后以将核心材料完全封闭起来的方式密封。如果基质前体材料存在于核心中，则可将装置暴露在引起核心基质形成的条件下。

本发明的装置可供植入多种多样的细胞或组织类型，包括完全分化的、依赖贴壁的、胎儿或新生儿的细胞或组织、或者转化的、不依赖贴壁的细胞或组织。由供体(即原代细胞或组织，包括成人、新生儿和胎儿细胞或组织)或由体外复制的细胞(即永生化细胞或细胞系，包括经遗传修饰的细胞)制备待隔离的细胞。在所有情况下，通常在无菌条件下制备足量的细胞以产生有效水平的所需产物或供应有效水平的所需代谢功能，在隔离前适当保持(例如在平衡盐溶液例如Hank盐中，或在营养培养基例如Ham's F12中)。

本发明的ECT装置具有趋于缩短装置中心与最接近外罩部分之间的距离的形状，目的在于允许来自患者的营养物易于进入细胞或允许患者的蛋白质进入细胞，从而通过细胞起作用以提供代谢功能。在此情况下，优选非球形形状，例如圆柱体。

影响待置于本发明的装置核心内的细胞数或组织量(即装填密度)的4个重要因素是：(1)装置尺寸和几何结构；(2)装置内的有丝分裂活性；(3)核心制备和/或装填的粘度要求；和(4)植入前测定和合格性要求。

对于这些因素的第一个(装置尺寸和几何结构)，关键营养物和代谢需要物(metabolic requirements)扩散进入细胞以及代谢物从细胞中扩散出来对细胞的持续存活力是决定性的。在RPE细胞(例如ARPE-19细胞)的情况下，邻近的细胞能够吞噬濒死细胞并利用碎片作为能量来源。

由物质扩散进入装置而满足的代谢需要之一是对氧的需要。特定细胞的需氧量必定取决于所选择的细胞。参见Wilson D. F.等, J. Biol. Chem., 263, 第2712-2718页(1988)中提供的用于氧代谢测定的方法和参考文献。

对于第2个因素(细胞分裂)，如果预期所选细胞在装置内期间活跃分裂，则它们将继续分裂直到填满可用空间，或例如接触抑制限制进一步分裂等现象出现为止。对于复制细胞，可以选择装置的几何结构和尺寸，使得装置核心完全充填将不因扩散限制而导致关键营养物丧失。

对于第3个因素(核心材料的粘度)，占据多达70%装置体积的密度的细胞可为有活力的，但该浓度范围内的细胞溶液可具有相当大的粘度。将极粘溶液中的细胞引入装置可能过分困难。一般来说，对于两步策略和混合挤压策略两者，高于30%的细胞装填密度几乎不可用，一般来说，最佳装填密度将为20%和更低。例如，对于组织碎片，为了保持内部细胞的存活力，重要的是遵守与上述相同的通用原则，并且组织碎片直径不应超过250微米，在其和最近扩散表面之间的内部细胞具有小于15个、优选小于10个细胞。

最后，有关第4个因素(植入前和测定要求)，在许多情况下，装置制备与植入之间将需要一定的时间量。例如，就其生物活性而言，可能重要的是使装置合格。因此，在有丝分裂活跃的细胞的情况下，优选的装填密度还应考虑为了进行合格性测定必须存在的细胞数。

大多数情况下，在体内植入前，采用体外测定法确定装置内的BAM (例如抗血管生成抗体支架或VEGF受体或PDGF受体)的功效将是重要的。可利用模型系统构建并分析装置以允许测定在每个细胞或单位体积基础上的载体的功效。

按照用于装置装填和测定装置功效的这些准则，然后可通过具体应用所需的生物活性的量，确定用于植入的实际装置尺寸。装置数目和装置尺寸应在植入时充分产生治疗作用，并通过具体应用所需的生物活性量来确定。在释放治疗性物质的分泌细胞的情况下，可采用本领域已知的标准剂量考虑和标准，确定所需分泌性物质的量。要考虑的因素包括接受者的尺寸和体重；细胞的生产率或功能水平；以及适当时其功能被替换或增加的器官或组织的正常生产率或代谢活性。考虑在经免疫隔离和植入程序后可能不能存活的细胞的部分也是重要的。此外，还必须考虑接受者是否患有可能干扰植入物的功效的先前存在的病况。可容易地制造含有成千上万个细胞的本发明的装置。例如，现有的眼科临床装置含有介于200,000与750,000个细胞，而微化装置可含有介于10,000和100,000个细胞。其它大尺度装置可含有介于1,000,000-100,000,000个细胞。

包封细胞疗法基于这样的构思：通过在植入宿主之前，用半渗透性生物相容性材料包绕细胞，将细胞与接受宿主的免疫系统隔离。例如，本发明包括其中将遗传工程改造的ARPE-19细胞包封在免疫隔离囊的装置，所述装置在植入接受宿主中时，使宿主免疫系统对装置核心中的ARPE-19细胞的有害作用减到最小。通过将ARPE-19细胞包封在由微孔膜形成的可植入聚合物囊中，使其与宿主免疫隔离。该方法防止宿主和植入组织间的细胞-细胞接触，从而消除通过直接呈递的抗原识别。

可眼内(例如在前房和玻璃体腔中)、眼周(例如眼球筋膜囊内或眼球筋膜囊下)或两者递送本文所述的任何抗血管生成抗体支架或VEGF受体或PDGF受体(单独或以任何组合)。还可使用本发明的装置以提供控释和缓释的抗血管生成抗体支架或受体以治疗各种眼科病症、眼病和/或其它对眼有影响的疾病。

可眼内(优选在玻璃体中)或经眼(优选在眼球筋膜下间隙或区域中)递送抗血管生成因子(例如本文所述的任何抗血管生成抗体支架或可溶性VEGF受体)，其剂量范围为0.1 pg和1000 μg (例如介于0.1 pg与500 μg之间、介于0.1 pg与250 μg之间、介于0.1 pg与100 μg之间、介于0.1 pg与50 μg之间、介于0.1 pg与25 μg之间、介于0.1 pg与10 μg之间、介于0.1 pg与5 μg之间、介于0.1 pg与100 ng之间、介于0.1 pg与50 ng之间、介于0.1 pg与25 ng之间、介于0.1 pg与10 ng之间或介于0.1 pg与5 ng之间)/眼/患者/天。在一个非限制性实例中，治疗量为至少0.5-50 μg/ml眼中稳态。合适的治疗量可包括例如0.5 μg、0.6 μg、0.7 μg、0.8 μg、0.9 μg、1 μg、2 μg、3 μg、4 μg、5 μg、6 μg、7 μg、8 μg、9 μg、10 μg、11 μg、12 μg、13 μg、14 μg、15 μg、16 μg、17 μg、18 μg、19 μg、20 μg、21 μg、22 μg、23 μg、24 μg、25 μg、26 μg、27 μg、28 μg、29 μg、30 μg、31 μg、32 μg、33 μg、34 μg、35 μg、36 μg、37 μg、38 μg、39 μg、40 μg、41 μg、42 μg、43 μg、44 μg、45 μg、46 μg、47 μg、48 μg、49 μg、50 μg、51 μg、52 μg、53 μg、54 μg、55 μg、56 μg、57 μg、58 μg、59 μg、60 μg、61 μg、62 μg、63 μg、64 μg、65 μg、66 μg、67 μg、68 μg、69 μg、70 μg、71 μg、72 μg、73 μg、74 μg、75 μg、76 μg、77 μg、78 μg、79 μg、80 μg、81 μg、82 μg、83 μg、84 μg、85 μg、86 μg、87 μg、88 μg、89 μg、90 μg、91 μg、92 μg、93 μg、94 μg、95 μg、96 μg、97 μg、98 μg、99 μg、100 μg、150 μg、200 μg、250 μg、300 μg、350 μg、400 μg、450 μg、500 μg、550 μg、600 μg、650 μg、700 μg、750 μg、800 μg、850 μg、900 μg、950 μg、1000 μg。此外，本发明的细胞系和装置能够表达该治疗量为期至少3个月的时间。

可通过本发明的各种实施方案治疗的眼科病症包括但不限于糖尿病视网膜病、糖尿病性黄斑水肿、增殖性视网膜病、视网膜血管病、血管异常、年龄相关性黄斑变性和其它后天性疾病、眼内炎、感染性疾病、炎性但非感染性疾病、AIDS相关病症、眼缺血综合征、妊娠相关病症、外周视网膜变性、视网膜变性、中毒性视网膜病变、视网膜肿瘤、脉络膜肿瘤、脉络膜病症、玻璃体病症、视网膜脱落和增殖性玻璃体视网膜病、非穿透性创伤、穿透性创伤、白内障后并发症和炎性视神经病变。

本领域技术人员应认识到，年龄相关性黄斑变性包括但不限于湿性和干性年龄相关性黄斑变性、渗出性年龄相关性黄斑变性和近视性变性。

在一些优选的实施方案中，待治疗的病症是年龄相关性黄斑变性的湿性形式或糖尿病视网膜病。本发明还可用于治疗眼部新血管形成、与许多眼部疾病和病症相关的病况。例如，视网膜缺血相关眼部新血管形成是糖尿病和许多其它疾病中失明的主要原因。

本发明的细胞系和装置还可用于治疗由具有眼部症状和非眼部症状的疾病或病况引起的眼部症状。一些实施例包括AIDS以及其它病况中的巨细胞病毒视网膜炎和玻璃体病症、妊娠所致视网膜中的高血压变化和以下各种感染性疾病的眼部效应：例如结核病、梅毒、莱姆病、寄生物病、犬弓蛔虫、眼蝇蛆病(ophthalmonyiasis)、囊尾蚴病(cyst cercosis)和真菌感染。

装置和细胞系还可用于治疗与基于其它眼内新血管形成的疾病有关的病况。例如，这类新血管形成可发生在例如糖尿病视网膜病、视网膜中央静脉阻塞及或许年龄相关性黄斑变性等疾病中。角膜新血管形成是主要问题，因为它干扰视力，并使患者容易有角膜移植失败的倾向。大部分严重视力丧失与引起眼部新血管形成的病症有关。

本发明还涉及抗血管生成抗体支架或可溶性VEGF受体或PDGF受体的方法和递送以治疗细胞增殖性病症，例如血液学病症、动脉粥样硬化、炎症、血管通透性增加和眼部环境内或体内所需靶定位置以外的恶性肿瘤。

使用本文所述装置和技术提供相对于其它递送途径的若干优势：可将抗血管生成抗体支架或VEGF受体或PDGF受体直接递送至眼，这减少不需要的周围副作用或使不需要的周围副作用减到最低，且与局部应用相比，可递送极少剂量的抗血管生成抗体支架或受体(即毫微克或低微克量，而非毫克)，从此还可能减少副作用。此外，因为活细胞不断产生新合成的抗血管生成抗体支架和受体，这些技术应优于抗血管生成抗体支架或VEGF受体的注射递送，其中注射之间的剂量大幅度波动，且抗血管生成抗体支架或受体不断降解却没有持续地补充。

可将经遗传工程改造以分泌本发明的抗血管生成抗体支架或可溶性VEGF受体的活细胞和细胞系包封在本发明的装置内，并经手术插入(在眼球后麻醉下)任何合适的眼部解剖结构。例如，装置可经手术插入眼的玻璃体中，其中优选将装置系在巩膜上以利于取出。装置可保持在玻璃体中，只要是实现所需的预防或疗法所必需的。例如，所需疗法可包括促进神经元或光感受器存活或修复，或抑制和/或逆转视网膜或脉络膜新血管形成以及抑制色素层、视网膜和视神经炎症。随着玻璃体放置，可将抗血管生成抗体支架或VEGF受体递送至视网膜或视网膜色素上皮(RPE)。

在其它实施方案中，将装填细胞的装置眼周植入称为眼球筋膜囊的间隙内或之下，这比植入玻璃体具有较少侵入性。因此，可消除并发症例如玻璃体出血和/或视网膜脱落。这种给药途径还允许将本文所述的抗血管生成抗体支架或可溶性VEGF受体或PDGF受体递送至RPE或视网膜。眼周植入特别优选用于治疗脉络膜新血管形成及视神经和葡萄膜炎症。一般来说，自眼周植入部位的递送将允许抗血管生成抗体支架或可溶性VEGF受体循环至脉络膜血管系统、视网膜血管系统和视神经。

使用本文所述装置和方法将抗血管生成因子(例如本发明的抗血管生成抗体支架或可溶性VEGF受体)直接递送至脉络膜血管系统(眼周)或递送至玻璃体(眼内)可减轻或缓解与现有技术治疗方法和装置有关的问题，可允许治疗不太确定的或隐匿性脉络膜新血管形成，以及通过辅助疗法或维持疗法提供减轻或预防复发性脉络膜新血管形成的方式。

在无菌条件下进行本发明的生物相容性装置的植入。可使用注射器或本领域技术人员已知的任何其它方法植入装置。一般将装置植入接受者身体的这类部位，其可允许将分泌产物或功能适当递送至接受者以及将营养物适当递送至植入细胞或组织，并且还可允许接近装置以便收回和/或置换。考虑了多个不同的植入部位。这些包括例如水样液、玻璃体液、眼球筋膜囊下、眼周间隙和前房。优选对于不是免疫特许的植入部位，例如眼周部位及前房(水状体)和后房(玻璃体)以外的其它部位，囊是免疫隔离的。

优选验证固定在装置内的细胞在植入前和植入后均适当地起作用。本发明众所周知的任何测定法或诊断检验都可用于这些目的。例如，可采用ELISA (酶联免疫吸附测定法)、色谱测定法或酶测定法或对分泌产物有特异性的生物测定法。如有需要，可通过从接受者中收集合适的样品(例如血清)，并对其进行测定，监测随时间推移的植入物的分泌功能。

多种现有技术装置和手术技术的使用导致很多视网膜脱落。这种并发症的发生减少，因为与若干其它疗法相比，本发明的装置和方法的侵入性较低。

还可按照本发明使用本文所述抗血管生成抗体支架和VEGF受体的修饰、截短和/或突变形式(mutein form)。此外，还考虑了这些抗血管生成抗体支架或受体的活性片段(即具有足以实现治疗作用的生物活性的那些片段)的使用。此外考虑了连接一个或多个聚乙二醇(PEG)或其它重复性聚合部分以及这些蛋白质及其多顺反子形式的组合而修饰的抗血管生成抗体支架或受体分子。

按照本文所述方法对许多病况进行治疗，每眼将只需要一个或至多不超过50个植入装置以供应合适的治疗剂量。治疗剂量可介于约0.1 pg与1000 μg/眼/患者/天之间(例如介于0.1 pg与500 μg之间、介于0.1 pg与250 μg之间、介于0.1 pg与100 μg之间、介于0.1 pg与50 μg之间、介于0.1 pg与25 μg之间、介于0.1 pg与10 μg之间、介于0.1 pg与5 μg之间、介于0.1 pg与100 ng之间、介于0.1 pg与50 ng之间、介于0.1 pg与25 ng之间、介于0.1 pg与10 ng之间、或介于0.1 pg与5 ng/眼/患者/天之间)。在一个非限制性实例中，治疗量为至少0.5-50 μg/ml眼中稳态。合适的治疗量可包括例如0.5 μg、0.6 μg、0.7 μg、0.8 μg、0.9 μg、1 μg、2 μg、3 μg、4 μg、5 μg、6 μg、7 μg、8 μg、9 μg、10 μg、11 μg、12 μg、13 μg、14 μg、15 μg、16 μg、17 μg、18 μg、19 μg、20 μg、21 μg、22 μg、23 μg、24 μg、25 μg、26 μg、27 μg、28 μg、29 μg、30 μg、31 μg、32 μg、33 μg、34 μg、35 μg、36 μg、37 μg、38 μg、39 μg、40 μg、41 μg、42 μg、43 μg、44 μg、45 μg、46 μg、47 μg、48 μg、49 μg、50 μg、51 μg、52 μg、53 μg、54 μg、55 μg、56 μg、57 μg、58 μg、59 μg、60 μg、61 μg、62 μg、63 μg、64 μg、65 μg、66 μg、67 μg、68 μg、69 μg、70 μg、71 μg、72 μg、73 μg、74 μg、75 μg、76 μg、77 μg、78 μg、79 μg、80 μg、81 μg、82 μg、83 μg、84 μg、85 μg、86 μg、87 μg、88 μg、89 μg、90 μg、91 μg、92 μg、93 μg、94 μg、95 μg、96 μg、97 μg、98 μg、99 μg、100 μg、150 μg、200 μg、250 μg、300 μg、350 μg、400 μg、450 μg、500 μg、550 μg、600 μg、650 μg、700 μg、750 μg、800 μg、850 μg、900 μg、950 μg、1000 μg。此外，本发明的细胞系和装置能够表达该治疗量为期至少3个月的时间。

本发明的每种眼科装置能够以单个或聚簇形式储存介于约1,000与约750,000个之间的细胞，这取决于其类型。

在下面的实施例中将对本发明作进一步描述，其不限制权利要求书中描述的本发明的范围。

实施例

实施例1：细胞亚克隆

使各种抗血管生成抗体支架和可溶性VEGF受体在NTC-200细胞中表达。本文所用术语“NTC-200”和“ARPE-19细胞”可互换使用以描述经遗传工程改造以表达本发明的抗血管生成抗体支架和可溶性VEGF和PDGF受体的优选细胞类型。

为了实现蛋白质的分泌，构建体含有天然或IgSP鼠免疫球蛋白前导序列，后者在以前用来指导CNTF从NTC-200细胞中分泌。本文如下描述了既定蛋白质的核苷酸和氨基酸序列和相应核酸序列：

1) p834

2) p838

3) p876

4) p873

5) p874

6) p875

7) p915

8) p914

9) p916

10) p913

11) p917

12) p964

13) p963

14) p974

15) p978

16) p977

对于可溶性VEGF受体(例如p834、p838和p873)，使用对所需产物有特异性的寡核苷酸引物对，通过PCR自sVEGFR1 (hFlt)或sVEGFR2 (hKDR) cDNA (GenBank登记号分别为U01134和AF063658)扩增基因片段。根据已知抗VEGF化合物例如贝伐单抗和雷珠单抗(Genentech)的序列的部分，设计本文所述抗血管生成抗体支架(例如p876、p874、p875、p895、p896、p913和p897)。扩增产物用合适的限制性内切核酸酶消化，并连接到Neurotech哺乳动物表达载体pCpGfree-vitro (InvivoGen)中，其示意图见图1。pCpGfree-vitro是市售载体，完全没有CpG二核苷酸，并掺入策略性放置的S/MARS绝缘子，因此降低沉默或基因相互作用的可能性。另外，S/MARS序列可有助于宿主基因组内的染色体整合。这种设计使得插入基因的表达被细胞机器沉默(关闭)不太可能。与其它表达载体(pcDNA，pKan，pCI-Neo等)比较时，pCpGfree-vitro始终产生稳定的较高生产性的重组细胞系。pCpGfree-vitro载体系统包括3种形式的表达载体，其通过新霉素、杀稻瘟素或潮霉素抗性基因的存在情况而区分。可使用不同选择标志用于每次重复，通过将相同的cDNA序列亚克隆到基于新霉素、杀稻瘟素和潮霉素抗性的表达载体的每一个中，来使细胞系重复转染。这类方法允许基因剂量扩增而又不需要产生通常存在于CHO制造细胞系的DHFR品系。

用杀稻瘟素或新霉素(G418)或潮霉素选择转化的重组克隆，并通过限制消化和琼指糖凝胶电泳分析，对纯化的小量制备质粒DNA进行了分析。通过自动化双脱氧测序(GeneWiz，Edison，NJ)，接着应用Vector NTI v10.0序列分析软件(Invitrogen Corp，Carlsbad，CA)进行层析谱汇编(chromatogram assemblies)，证实了含有合适插入片段的所有推定的质粒克隆。

实施例2：细胞系构建

使用经证实的质粒克隆转染NTC-200细胞以获得稳定的多克隆细胞系。简单地说，按照生产商的建议，使用6.0 ul Fugene 6转染试剂(Roche Applied Science，Indianapolis IN)，用3.0 ug质粒DNA转染先前接种18小时的200-300K细胞。在含10% FBS、内皮SFM或Optimem培养基(Invitrogen Corp，Carlsbad，CA)的3.0 ml DMEM/F12中进行转染。24-48小时后，向细胞提供含有1.0 ug/ul G418的新鲜培养基，或者传代至含有G418的T-25组织培养瓶。在为期14-21天的选择下，使细胞系传代直到恢复正常生长，之后除去药物，在表征前让细胞恢复(~1周)。

将这些多克隆细胞系分散，然后接种在培养皿中。在适当生长后，通过显微术观察到成千上万的各个集落，挑选和克隆扩繁。针对重组分子产生，通过ELISA对亚克隆上清液进行分析，并结合细胞数测定，以供产生排序的(rank-ordered)克隆产率。针对ECT装置中的稳定性、产率和体内生物物理特性及动物研究的生物产量选择所需克隆细胞系。

使用人sVEGF R1/Flt1 Quantikine ELISA Kit (R&D Systems，Minneapolis，MN)或多克隆抗人IgG1 Fc ELISA (Neurotech)，在几周进程内测量这些细胞系中重组蛋白的表达稳定性。简单地说，将之前接种在12孔组织培养板的含10% FBS的DMEM/F12中的50K细胞在HBSS (Invitrogen Corp，Carlsbad，CA)中洗涤2次，然后用1.0 ml内皮SFM (Invitrogen Corp，Carlsbad，CA)进行脉冲2小时。将脉冲培养基保存在-20 C下，并按照生产商的方案，在收集的一周内进行测定。

成功地产生分泌由下列抗血管生成抗体支架和截短的VEGF和PDGF受体编码的蛋白质的稳定细胞系：

1) p834

2) p838

3) p876

4) p873

5) p874

6) p875

7) p915

8) p914

9) p916

10) p913

11) p917

12) p964

13) p963

14) p974

15) p978

16) p977

实施例3：细胞系筛选和命中测定

如所述的产生表达抗血管生成分子的重组NTC-200细胞系，此处显示针对分子p834 (一种VEGFR-Fc分子)的筛选选择的一个实例。对克隆上清液应用抗VEGFR ELISA测定法，并采用细胞计数试剂盒8方法(CCK-8，Dojindo Inc.)以计算所分析的克隆的细胞数。在该实施例中，在该筛选ELISA中克隆的排序表明至少8个克隆命中具有大于10,000 ng/100万个细胞/天(10皮克/细胞/天(pcd))的产率。在图2所示散点图中，使用ELISA产量相对细胞数对p834亚克隆作图，允许显现可显示有利于有益的ECT按比例扩大扩繁的生长和分泌性质的克隆系。

9种不同的抗体和受体型Fc-分子的现有细胞系产生导致7-20 pcd范围内的细胞系产量，如表1所示。这些水平与通过常规CHO系制备方法获得的产量水平相当。在各种情况下，除最上面排列的克隆用于ECT以外，选择每个分子实体的至少5个独立的亚克隆作为备份细胞系。产生高生产性抗体和受体Fc型细胞系的成功表明，NTC-200细胞系/pCpG表达系统可广泛应用于生物治疗性分子，特别是已知CHO制备的产物所代表的那些生物治疗性分子。

表1. 实例细胞系产量(皮克/细胞/天)

实施例4：蛋白质表征

蛋白质表达

p834分子的结构基于与人IgG1 Fc结构域符合读框融合的嵌合VEGF-受体1结构域2和VEGF-受体2结构域3分子。细胞系条件培养基中的p834-10-5蛋白在非还原性蛋白质印迹上具有预测的100 kDa的二聚体分子量(非糖基化)和约130 kDa的实测值(糖基化)。在还原性蛋白质印迹上，预测的834-10-5的单体分子量为50 kDa，所观察到的分子量约为60 kDa (糖基化)。834-10-5细胞系条件培养基的G蛋白亲和纯化显示非还原性SDS-PAGE下的单条带，与蛋白质印迹分析中所观察到的结果一致。由15 mg/升hyperflask培养的产量证实了834-10-5细胞系的高产率。(参见图3)。

HUVEC生物测定法

VEGF-A以其体外刺激HUVEC细胞增殖的能力而著称。因此，用于测量VEGF-A抑制的合适生物测定法可为针对已知量的VEGF-A作为HUVEC细胞的刺激物(R & D Systems)对抑制分子进行滴定。收获p834-10-5细胞系的条件培养基，连续稀释以抑制VEGF-A对HUVEC细胞的刺激。发现在该测定法中，p834-10-5条件培养基显示EC50 = ~50 pM，其100%抑制= ~100 pM，如图4所示。p834-10-5抑制活性类似于VEGFR-Fc对照(R & D Systems)的生物活性，p838-6多克隆细胞系条件培养基的生物活性亦如此。总之，与对照蛋白质(VR1 D1-3-Fc)类似，这些细胞系的重组蛋白可有效地抑制内皮细胞增殖。然而，得自模拟品转染的亲代细胞(WT)的条件培养基不抑制HUVEC生长。

溶液结合测定

使用来自转染细胞系的条件培养基，进行了VEGF的溶液结合研究。简单地说，在VEGF存在下，使滴定量的条件培养基在室温下孵育过夜。游离VEGF采用灵敏的EIA (R&D Systems，Minneapolis，MN)测量，并进行了非线性回归分析(GraphPad Software Inc.，San Diego，CA)。

通过p834-10-5 ECT玻璃体的和移出条件培养基样品抑制或干扰市售VEGF夹心ELISA (R&D Systems)的反应性的能力，在生物物理上证实了p834-10-5 ECT的重组分子的结合活性。如图5所示，p834-10-5样品显示IC50 = ~ 12 pM，而在~100 pM时观察到>90%抑制。从纯化的蛋白质、从含有p834-10-5 ECT装置的非免疫抑制的兔玻璃体(1或3个月时间点)或从兔的移出p834-10-5 ECT装置产生的分泌蛋白质中，检测到这种抑制活性。作为阴性对照，表明了来自模拟品转染的亲代细胞(WT)的条件培养基不结合VEGF。

实施例5：装置表征和植入结果

细胞系稳定性研究

重组细胞系可制造性的一个标准是克隆扩繁导致的产率的限度。经计算，克隆细胞的40代的生长和产率分析可证实产量稳定性，并供应用于产生原始细胞库(达到传代~17)和工作细胞库(达到传代~23)的充分信息。经计算，一个工作细胞库足以制造至少100,000,000个装置。p834-10-5细胞系的连续传代显示组织培养中直至40代的稳定性，其在所测定的一组时间点上的平均产量为10.4 pcd (皮克/细胞/天)。(参见图6)。

装置产量时程研究

使来自研究细胞库等分部分的p834-10-5细胞系扩繁，并在装置充填前扩繁。通过注入具有由聚砜半透膜构成的壁并充填聚对苯二甲酸乙二醇酯(PET)纱线用于细胞附着的6 mm ECT装置，来包封细胞。将装置分别置于具有营养培养基的密封容器初级包装中，并在37 C下温育10周。在保持温育的时程中，通过从包装中取出，并通过ELISA测定p834-10-5蛋白分泌，定期对ECT装置中的重组蛋白产量进行检查。结果表明初始装置产量为480 ng/装置/天的p834-10-5蛋白，逐渐减少至6周后的~60 ng/装置/天的基线产量。图7中，2个装置的组织切片显示稳固的内部834-10-5细胞生长，表明在一个月装置培养期间的高存活力。

在植入后1和3个月，含有经遗传工程改造以分泌p838和p834 VEGFR构建体的ARPE-19细胞的装置显示优异的安全性概况。此外，这些装置(“NT-503装置)在植入后1和3个月在体内是稳定的。

表2显示这些NT-503装置的PK数据：

表2：NT-503 PK

表3显示NT-503装置贮存稳定性(shelf stability)的结果：

表3：NT-503存放期：所证实的体内稳定性

4周存放期

如上所示，与p838相比，p834装置递送13倍较高水平的VEGF受体。无论如何，对于NT-503，体外装置产量和体内性能(按玻璃体水平测量)两者保持稳定。此外，对植入的NT-503装置的体外保持期和相应体内性能的评价表明存放期稳定性高达4周持续时间。

因此，p834装置可用于进行中的人临床试验，以确保在人类的成功概念验证。此外，可进行额外工作以选择较高生产性p838克隆用于该临床试验的第二组群(现有的p838细胞系是多克隆细胞系)。

最后，如果可能的话，可进行不断的努力以延长NT-503装置超过4周以上的存放期。然而，目前这不是必需的，因为用于本领域的大多数细胞疗法制品具有1周的存放期。

实施例6：动物研究

在包装后4周，将装置植入非免疫抑制的新西兰白兔眼中。为了测定植入后1个月和3个月后的p834-10-5产量，摘除动物的眼球，从提取的玻璃体中定量测定p834-10-5的浓度，并与移出装置产率进行比较。植入后1个月，移出装置产生大于100 ng/ml/天的p834-10-5蛋白，其稳态玻璃体浓度大于250 ng/ml。植入后3个月，移出装置以高于200 ng/ml继续产生，同时检出超过700 ng/ml的玻璃体浓度。(参见表4)。1年后，兔玻璃体样品含有350 ng/ml p834-10-5蛋白，表明在12个月的进程中继续产生重组受体。

如图8所示，3个月植入后，移出装置的组织学显示稳固的细胞生长，类似于图7所示来自保持在容器中的装置的样品中所观察到的细胞形态。通过兽医眼科医师的定期检查，在研究期间，未观察到接受治疗的兔的眼内有临床显著性不良事件。

表4：p834的体内产生

实施例7：重复基因剂量给予增加重组蛋白产生

使用重复转染以增加基因剂量，特别是p834 cDNA的剂量。制备具有相同834 cDNA的3种表达质粒：p834 pCpG vitro free (杀稻瘟素抗性)、p910 pCpG vitro free (新霉素抗性)和p969 pCpG vitro free (潮霉素抗性)。将p910转染至杀稻瘟素抗性p834-10-5细胞系，通过应用新霉素选择回收所得双重整合子(integrant)克隆。分离超过p834-10-5的PCD产量水平的亚克隆。如图9所示，最初1次(“1x”)转染产生具有15-20 PCD的裸细胞产量水平(Fc ELISA)的上述p834-10-5细胞系。从亲代834-10-5克隆转染和选择p910克隆，得到具有产量水平35-40 PCD的910 (834-10-5)-4-47克隆。p969至910 (834-10-5)-4-47亚克隆的重复转染和选择得到很多潮霉素抗性p969衍生克隆，其最初分离物分泌重组蛋白的水平在50 PCD至> 100 PCD范围。通过杀稻瘟素、潮霉素和新霉素培养基每种中的969个克隆系的培养，证实了保持全部3种遗传整合事件的表达。基于重组蛋白与板结合的VEGF直接结合，接着通过使用抗人Fc检测，通过ELISA测定法测定，存在显示最低效能丧失的三重转染克隆。出乎意料的是，与基于3 x转染的基因剂量的简单算术加法相比，检测出重组蛋白高达8倍的值，这就表明了预料不到的协同生物选择与通过连续转染(例如采用重复转染方法)增加基因剂量有关。

实施例8：通过重复转染的细胞系的剂量递增临床前研究

按照实施例6的方法，使用双重转染子细胞系910(834-10-5)-4-47和三重转染子细胞系969(910(834-10-5)-4-47)-33产生ECT装置，随后植入兔中。植入1个月后，摘除兔的眼球，提取玻璃体以定量测定834蛋白的水平。同时，手术取出装置，将移出的装置进一步培养在细胞生长培养基中，以确定装置的重组蛋白产率。如表5所示，910装置和969装置的产量导致834蛋白的稳态玻璃体水平分别接近用834单次转染的蛋白质所观察到的水平的5倍和10倍(表5)。与细胞系PCD产量数据一致，与通过连续转染基因剂量的简单相加效应所预期的相比，体内观察到较高的834蛋白稳态浓度(表6相对于表4)，再次表明了预料不到的由重复转染方法所致的协同分泌增强的协同生物选择。

表5. 通过910(834-10-5)-4-47装置体内产生的p834蛋白

表6. 通过969[910(834-10-5)-4-47]体内产生的p834蛋白

实施例9：应用于834-10-5细胞系的p544 (CNTF)的转染

在一个相继DNA转染的实施方案中，可使用编码无关(即不同) cDNA的表达载体产生分泌具有不同功能的两种不同蛋白质的细胞系。将编码睫状神经营养因子(一种在色素性视网膜炎和地图样萎缩(geographic atrophy)患者的视网膜中具有神经保护作用细胞因子)的CNTF表达载体p544转染至834-10-5细胞系。针对抗生素选择转染细胞，并根据相应的ELISA测定法，回收产生CNTF和834蛋白的最高生产性细胞系。采用重复转染，得到CNTF /834阳性克隆的数目，并描述于表6中。

引人关注的是，在这些最高生产性克隆内，与历史CNTF细胞系对照(~0.5 pcd)相比，未观察到基于亲代834-10-5克隆或通过p544衍生的CNTF表达的产量损失，表明了与亲代表达水平相比通过包封双重表达细胞系(没有产量真实度损失)的组合疗法的潜力。这些结果表明，ECT疗法不限于单一分子实体的产生，而是可以产生分泌多种治疗分子的细胞系。在这种情况下，CNTF起针对干性AMD的神经保护疗法的作用，而VEGF拮抗剂起针对湿性AMD的抗血管生成疗法的作用。

下面提供p544核酸和氨基酸序列：

p544 CNTF (具有基因组内含子)

剪接的翻译p544，包括信号肽

表7. 来源于重复转染的细胞系的544 CNTF和834蛋白产生。

实施例10：可溶性PDGFR拮抗剂

双重分子组合ECT疗法可以靶向血管生成，例如通过分泌各自的抗血管生成因子的双重装置或分泌两种不同分子的组合细胞系。例如，使用质粒p963、p964、p974、p978和p977，构建抗血管生成抗体支架和/或PDGFR可溶性拮抗剂细胞系，所述每个编码PDGFRβ，或作为可溶性受体或作为可溶性融合蛋白。开发出PDGFRβ特异性ELISA，其中俘获抗体是抗Fc，检测抗体是抗PDGFR β抗体(图10)，表明NTC-200细胞的瞬时转染产生相当于p963 PDGFR-IgG1 Fc和p964 PDGFR-IgG4 Fc的预测结构的免疫原性物质。

实施例11：产生PDGFR-Fc的细胞系

采用类似于前述实施例中提及的用于产生VEGF拮抗剂生产性细胞系的方法，还产生了PDGFR拮抗剂生产性细胞系。如表8所示，p963的克隆选择导致产率为7.7 pcd的克隆963G2。可以利用通过重复转染进一步操作963G2来提高p963蛋白的产率。

表8. PDGFR-IgG1 Fc生产性细胞系

实施例12：ECT中的其它抗血管生成抗体支架和培养基对装置产量的影响

除834-10-5 VEGFR-Fc拮抗剂以外，其它细胞系来源于单次转染和克隆选择。如图12的一个实例所示，生成了代表单克隆抗体(Mab-p874)、Fab片段(Fab-p915)、单链Fv (ScFv-p918)和VEGFR-Fc (受体-Fc-p834)的细胞系，其产生8 pcd-35 pcd (Mab)。当置入ECT装置形式中时，观察到大范围的重组蛋白产量，这取决于所用的细胞系。此外还注意到，根据所测试的DMEM 10% FBS培养基和内皮无血清培养基(Endo-Gibco)，培养基在蛋白质分泌中起重大作用。

如834-10-5受体Fc装置和913-9-45 Fab装置中所观察的，根据用endo或DMEM 10% FBS培养，测量到装置产量几乎没有差异。然而，918-4-35 ScFv和874-1-23 Mab装置对Endo中的培养十分敏感，而在DMEM 10% FBS中培养时，得到最高产量，对于Mab高达3 ug/天/装置。

这些结果表明，在植入宿主前，装置用合适的培养基预处理可能是必需的以使细胞优化，从而允许最大的产率和可存活性。

例如，在植入兔眼前4周，将874-1-23装置在DMEM 10% FBS中调节。植入后1个月摘取兔的眼球，通过VEGF-Fc ELISA并且还通过Fc-ELISA，对874 Mab蛋白的玻璃体水平进行了评价。如表9中所见，在植入ECT装置的兔玻璃体中检出介于400 ng/ml与高达1.7 μg/ml之间的874 Mab蛋白。

表9. 兔玻璃体和移出物中的874抗VEGF Mab ECT产生

另外，在用SCID小鼠的系统设置下，针对Mab产量对874-1-23 ECT装置进行了评价。虽然874是抗VEGF抗体，但据报道其针对人VEGF有特异性，而非啮齿动物VEGF。因此，据推测，该分子的抗人血管生成功能在SCID小鼠模型中不具有不良生理作用。对于每只小鼠，在皮下植入SCID小鼠背部之前，将4个874-1-23 ECT装置培养在DMEM 10% FBS中，共测试了6只小鼠。1个月后，通过心脏穿刺提取小鼠血清，并通过VEGF-Fc ELISA对874蛋白质的血清浓度进行了评价。

表10. 874 Mab蛋白在SCID小鼠血清中的蓄积

因此，如表10中所见，通过直接结合VEGF-Fc ELISA测量，874-1-23 ECT植入物能够产生高达19 μg/ml稳态的874 Mab。这些ECT装置部分以及附着组织的组织学检查显示在紧接植入物的附近有大量新出现的血管形成。实现了ECT装置表面的血管形成，并允许扩散重组蛋白摄取并转运至动物的循环系统中。

等同内容

在上述随附的说明书中提供了本发明的一个或多个实施方案的详情。虽然类似或等同于本文所述的任何方法和材料均可用于实施或测试本发明，但此处描述了优选的方法和材料。本发明的其它特征、目的和优势从说明书和权利要求书来看将是显然的。在说明书和随附权利要求书中，单数形式包括复数指示物，除非文中另有清楚说明。除非另有定义，否则本文所用的所有技术和科学术语都具有与本发明所属领域普通技术人员通常理解的相同含义。本说明书所引用的所有专利和申请均通过引用予以结合。

上述说明仅为了说明目的而提供，并无意使本发明受限于所公开的确切形式，但却受限于随附权利要求书。