源于广西巴马长寿村的益生菌鼠李糖乳杆菌hsryfm1301及其应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，特别涉及一种源于广西巴马长寿村的益生菌鼠李糖乳杆菌hsryfm1301及其 应用。

技术背景

血清胆固醇水平过高是心血管疾病的主要原因，药物是当前治疗心血管疾病的主要方式，但是药物治 疗的成本较高且有较大的副作用。临床研究发现，降低血清中胆固醇水平能够显著降低心血管病的死亡率。 大量动物和人体实验表明，乳酸菌能够降低血清中的胆固醇水平。乳酸菌代谢产生的活性物质能抑制肠道 内致病菌的生长，调节肠道的微生态平衡；胃肠道中的细菌通过抗生素抗性基因的水平转移，给临床医学 带来了严重难题；因此筛选分解胆固醇及甘油三酯，并具有抑菌能力及耐药性较低的益生菌有着重要的意 义。

发明内容

本发明目的在于提供具有分解胆固醇及甘油三酯能力的益生菌菌株及其应用。

本发明提供了一株鼠李糖乳杆菌（Lactobacillus rhamnosus）hsryfm1301，该菌具有分解胆固醇及甘油 三酯能力，已于2013年12月6日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市 朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏号是CGMCC NO.8545。

经试验证明，该菌株具有分解胆固醇及甘油三酯的能力，并耐人工胃液及胆盐，同时具有较强的抑菌 能力，且耐药性较低；通过生理生化、API试剂条和16S rDNA序列比对分析，将该菌株鉴定为鼠李糖乳 杆菌。

本发明还提供了鼠李糖乳杆菌hsryfm1301在制备具有分解胆固醇及甘油三酯能力的发酵乳、发酵乳饮 料及活菌制剂中的应用。

本发明的鼠李糖乳杆菌hsryfm1301具有分解胆固醇及甘油三酯的能力，并耐人工胃液及胆盐，同时具 有较强的抑菌能力且耐药性较低，将其用于制备发酵乳、发酵乳饮料及活菌制剂，具有很好的前景。

附图说明

图1为本发明菌株的形态图。

图2为本发明菌株API试剂条鉴定图。

图3为本发明菌株API鉴定结果。

图4为本发明菌株16S rDNA PCR扩增产物电泳图;泳道M：100+2+3Kb DNA maker；泳道1为：hsryfm1301 16S rDNA扩增产物。

具体实施方式

本研究采用传统涂布平板分离法从广西巴马长寿村采集的样品中分离乳酸菌，通过体外试验筛选出分 解胆固醇及甘油三酯能力较强的乳酸菌菌株，然后通过模拟人体胃肠道环境筛选出耐酸耐胆盐能力较强的 菌株，并研究其抑菌性及耐药性，通过综合比较，获得益生性能最为优异的益生菌菌株。

相关培养基及试剂配方

(1)MRS-THIO培养基：蛋白胨10.0g，三水醋酸钠3.0g，牛肉膏8.0g，柠檬酸三铵2.0g，酵母浸膏4.0g， 七水硫酸镁0.2g，葡萄糖10.0g，一水硫酸锰0.04g，吐温-801.0mL，磷酸氢二钾2.0g，硫乙醇酸钠2.0g， 调pH至6.4，121℃灭菌15min，冷却备用。

(3)胆固醇培养基：胆固醇0.10g、吐温-801.0mL、蔗糖酯0.10g、冰乙酸5.0mL，冰浴超声破碎备用。 将上述制备的胆固醇胶束溶液加入到MRS液体培养基中，使培养基中胆固醇的终浓度为0.10mg/mL。并 调pH至6.50±0.20，121℃灭菌15min，冷却备用。

(4)甘油三酯培养基：将2%的聚乙烯醇水溶液与植物油按3:1的比例混合，用高速组织捣碎机处理后 作为甘油三酯的来源。将上述制备的植物油乳化液加入到MRS液体培养基中，调pH至6.50±0.20，121℃ 灭菌15min，冷却备用。

(5)人工胃液的配制：准确量取20.0mL1mol/L的HCl，用去离子水将pH分别调至2.0、3.0，加入NaCl 使其质量分数达到0.2%，每100.0mL溶液中加入1.0g胃蛋白酶，充分溶解后，用0.22μm微孔滤膜在无菌 操作台中过滤除菌，于无菌试剂瓶中低温保藏备用。

(6)硫酸铁铵显色剂：称取4.46g硫酸铁铵溶解于100.0mL85%磷酸中，取10.0mL溶液用浓硫酸定容 至100.0mL，放入硅胶干燥皿中备用。

具体步骤：

1样品采集

采集广西巴马长寿村中长寿人群及其家族人群样品，加入1mL灭菌液体石蜡油密封后，迅速置于冰 盒内，分离样品中的乳酸菌。

2乳酸菌的分离

将采集的样品经梯度稀释后，分别接种于MRS固体培养基、LBS固体培养基中，37℃厌氧培养48h， 挑取平板上的典型菌落，划线分离得到纯菌落。挑取各平板上的纯菌落于MRS液体培养基中，37℃厌氧 培养24h后，4℃冰箱冷藏备用或冻干保藏。

3乳酸菌的生理生化试验

对分离到的乳酸菌进行革兰氏染色，于显微镜下观察菌体形态，并进行接触酶、运动性、硝酸盐还原 及吲哚等生理生化试验。

结果表明，从采集的15份样品中分离获得217株菌株，通过生理生化试验发现156株菌革兰氏染色 为阳性，形状为杆状、短杆状或球状，在15℃及45℃环境下均能生长，接触酶、运动性、硝酸盐还原、 吲哚、产H₂S及明胶液化试验均为阴性，所以将156株分离细菌初步鉴定为乳酸菌。

4乳酸菌分解胆固醇及甘油三酯能力的测定

将活化好的乳酸菌按3%的接种量接种至MRS-THIO胆固醇培养基中，37℃培养24h后，取培养液0.2mL， 加入1.0mL无水乙醇振荡混匀1min，再加入3.8mL无水乙醇振荡混匀1min，静置5min后再次振荡混匀， 4000r/min离心10min，取2.0mL上清液用于胆固醇的测定，以未接菌的胆固醇培养基作为对照。胆固醇的测 定采用硫酸铁铵比色法，参照GB/T5009.128-2003食品中胆固醇的测定方法，测定其OD560nm值，胆固醇 的分解率按下式计算：

利用长春汇力生物技术有限公司的甘油三酯试剂盒测定培养基中甘油三酯的含量，乳酸菌的甘油三酯 分解率按下式计算：

甘油三酯分解率%=(总甘油三酯含量-残留值)/总甘油三酯含量×100%

156株乳酸菌分解胆固醇及甘油三酯的能力见表1。

表1乳酸菌分解胆固醇及甘油三酯的能力

结果表明，分离获得的156株乳酸菌中，30株乳酸菌分解胆固醇及甘油三脂的能力较强；其中胆固醇 及甘油三酯降解率分别大于30.35%和5.33%的菌株共16株；本发明菌株hsryfm1301的胆固醇及甘油三酯 的降解率最高，分别为61.90%和37.22%。

5乳酸菌耐酸耐胆盐能力的测定

将活化好的乳酸菌制成菌悬液，取1.0mL的菌悬液接种至9.0mL的pH3.0人工胃液中，37℃培养，分 别在0h和3h用平板计数法测定活菌数，计算其存活率(%)。

存活率(%)=3h的活菌数/0h的活菌数×100%

将活化好的乳酸菌按3%的接种量分别接种至含0.00%(即空白)、0.10%、0.30%及0.50%胆盐的MRS 培养基中，37℃培养，分别在0h和3h用平板计数法测定活菌数，计算其存活率(%)。

存活率(%)=3h的活菌数/0h的活菌数×100%

16株乳酸菌的耐酸耐胆盐能力见表2。

表2乳酸菌的耐酸耐胆盐能力

结果表明，16株乳酸菌在pH为3.0的人工胃液及胆盐浓度为0.10%、0.30%、0.50%的MRS培养基中 培养3h存活率均分别大于12.00%、12.50%、10.00%及8.00%；其中在pH为3.0的人工胃液中存活率大于 20%，且在0.10%、0.30%、0.50%的胆盐的MRS培养基中存活率均大于8.50%的菌株共8株；其中本发明 菌株hsryfm1301的耐酸耐胆盐能力较强，在pH为3.0的人工胃液及胆盐浓度为0.10%、0.30%及0.50%的 MRS培养基中存活率分别为71.43%、66.37%、64.55%及19.12%。

6乳酸菌抑菌能力的测定

采用牛津杯法检测8株乳酸菌的抑菌能力。将致病性大肠杆菌、沙门氏菌和金黄色葡萄球菌活化24h， 取0.2mL致病菌菌液均匀涂布于LB培养基平板上，涂布后以平板无可见水滴为准，并用镊子将3只无菌 的牛津杯轻轻放入培养皿中，吸取0.2mL乳酸菌菌悬液于牛津杯中。将平皿置于3-4℃冰箱扩散24h，然 后37℃培养24h，测量抑菌圈直径，结果见表3。

表3乳酸菌的抑菌性

由表3发现，8株乳酸菌对肠道致病菌有一定的抑制能力，其中对大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄 球菌三种致病菌的抑菌圈均大于8.65mm的菌株共4株；菌株hsryfm1301对大肠杆菌、沙门氏菌和金黄色 葡萄球菌的抑制能力较强，抑菌圈直径分别为14.67mm、11.35mm及10.67mm。

7乳酸菌抗生素敏感试验

使用药敏纸片法检测菌株对抗生素的敏感性，抗生素及纸片浓度见表4。

吸取1.0mL菌悬液加入到15.0mL灭菌并融化后的MRS固体培养基中(40-50℃)，于漩涡振荡混合器上 混和均匀后迅速倾注到100mm×H20mm无菌平皿中，摇匀，待平板凝固后贴放标准药物纸片，在37℃恒 温培养箱中倒置培养，48h后测量并记录抑菌圈直径，根据CLSI制定的《抗菌药物敏感性试验执行标准》 （2010版）判定乳酸菌对抗生素的耐药性，结果见表4。

表4乳酸菌的耐药性

注:R为耐药，M为中度敏感，S为敏感。

由表4发现，4株乳酸菌对青霉素G、诺氟沙星、环丙沙星有一定的耐药性，对其他抗生素有不同程 度的敏感性；菌株hsryfm1301对头孢唑啉、头孢拉定、四环素、氯霉利及福平素五种抗生素均敏感，对链 霉素中度敏感，耐药性较低于其他菌株。

8乳酸菌的鉴定

综合以上试验结果发现，本发明菌株hsryfm1301具有较强的分解胆固醇及甘油三酯能力，同时其耐酸 耐胆盐能力也强于其他菌株，其对肠道致病菌的抑菌能力较强且耐药性较低。因此经比较，菌株hsryfm1301 综合性能最为优异。通过革兰氏染色发现，本发明菌株hsryfm1301形状为短杆状，如图1。

（1）糖发酵试验

根据《伯杰氏细菌鉴定手册》，对菌株hsryfm1301进行糖发酵试验，结果如表5所示。

表5hsryfm1301生理生化试验结果

注:"+"90%菌株为阳性；"-"90%菌株为阴性。

由表5发现，本发明菌株hsryfm1301为鼠李糖乳杆菌，它能利用葡萄糖、乳糖、甘露醇、麦芽糖、纤 维二糖、松三糖，不能利用棉籽糖和木糖。

（2）API鉴定

利用API50CHL系列鉴定试剂条对菌株hsryfm1301进行鉴定，鉴定图如图2，鉴定结果见表6及图 3。

表6hsryfm1301的API50CHL系统鉴定结果

注：“+”表示阳性；“‐”表示阴性

由表6及图3可知，本发明菌株hsryfm1301为鼠李糖乳杆菌，鉴定率为99.9%。

（3）菌株16S rDNA测序鉴定

以菌株hsryfm1301基因组DNA作为PCR扩增的模板，采用通用的16S rDNA引物进行PCR扩增， 扩增结果见图4。电泳检测扩增产物后，送至上海生工生物工程技术服务有限公司进行测序。将测序得到 的序列（SEQ ID NO.1）与GenBank数据库中的序列进行比对分析，结果见表7。

表716S rDNA比对结果

结合生理生化试验、API试剂条鉴定及16S rDNA测序鉴定，将本发明菌株hsryfm1301鉴定为鼠李糖 乳杆菌。

应用实施例

1含本发明菌株发酵乳的制作方法

原料乳经标准化后，加入6%的糖，预热至60-65℃，12-20Mpa压力均质，95℃/5min热处理后，冷却 至42-45℃，按3%接种量接种鼠李糖乳杆菌hsryfm1301与嗜热链球菌grx02混合发酵剂，42℃发酵pH至 4.2-4.5，然后置于4℃贮藏。

2含本发明菌株乳酸菌饮料的制作方法

脱脂乳粉复原成12.0%（W/W）的复原脱脂乳350kg，采用95℃/8-10min热处理后，冷却至37-40℃；接 种3.0%（W/W）鼠李糖乳杆菌hsryfm1301发酵剂，于37℃条件下发酵20-24h，终点酸度控制在155-170°T； 加入650kg经90-110℃/5-10s杀菌的糖、稳定剂的混合物（该混合物的组成为0.9%-1.4%（W/W）的果胶和 13.8%-15.4%（W/W）的蔗糖），混合均匀，在20-25Mpa均质；冷却至15-20℃，采用无菌或卫生灌装，于 低温（4-7℃）保藏和销售。

3本发明菌株粉末状产品的制作方法

将鼠李糖乳杆菌hsryfm1301发酵乳冷冻至-50℃--60℃，干燥后含水量为3%-4%，压碎成粉末状，在粉 末状产品中加入奶粉、低聚糖、麦芽糊精等制成粉末状或片块状产品，用于日常使用或作为药品、保健品。

4鼠李糖乳杆菌hsryfm1301发酵乳、乳酸菌饮料及粉末状产品功能特性分析

分别取实施例1制备的发酵乳0.2mL，实施例1制备的乳酸菌饮料0.6mL及实施例3制备的粉末状产 品0.5g，加入到MRS-THIO胆固醇培养基中，37℃培养24h后，取培养液0.2mL，加入1.0mL无水乙醇振 荡混匀1min，再加入3.8mL无水乙醇振荡混匀1min，静置5min后再次振荡混匀，4000r/min离心10min， 取2.0mL上清液用于胆固醇的测定，以未接菌的胆固醇培养基作为对照。胆固醇的测定采用硫酸铁铵比色 法，参照GB/T5009.128-2003食品中胆固醇的测定方法，测定其OD560nm值，胆固醇的分解率按下式计 算：

利用长春汇力生物技术有限公司的甘油三酯试剂盒测定培养基中甘油三酯的含量，发酵乳、乳酸菌饮 料及粉末状产品的甘油三酯分解率按下式计算：

甘油三酯分解率%=(总甘油三酯含量-残留值)/总甘油三酯含量×100%

hsryfm1301发酵乳、乳酸菌饮料及粉末状产品分解胆固醇及甘油三酯的能力见表8。

表8hsryfm1301发酵乳、乳酸菌饮料及粉末状产品分解胆固醇及甘油三酯的能力

由表8发现，hsryfm1301发酵乳、乳酸菌饮料及粉末状产品都具有分解胆固醇及甘油三酯的能力。

以上本发明菌株发酵的产物都具有分解胆固醇及甘油三酯的作用，该菌株的发酵乳及发酵乳制成的乳酸 菌饮料、粉末状产品，都具有分解胆固醇及甘油三酯的功效。