一种特异性克伦特罗半抗原衍生物、克伦特罗人工抗原及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及生物化工生物检测技术领域，具体地，涉及一种克伦特罗半抗原和人工抗原合成方法以及在检测克伦特罗中的应用。 

背景技术

随着社会的发展和进步，人们生活水平不断地提高，对健康饮食越来越重视。食品安全问题，特别是食品中的兽药残留问题越来越引起人们的高度重视。要提高禽畜产品的安全，除了严格控制和有效的管理之外，对添加剂以及兽药等有毒化学物质残留的监控是至关重要的，因此，科学准确的兽药残留检测方法是动物源食品安全与否的重要保障。 

克伦特罗（Clenbuterol，Clen）是一种人工合成的β₂-肾上腺素受体激动剂，常作为支气管扩张剂用于防治支气管哮喘、哮喘性慢性支气管炎症及肺气肿等呼吸系统疾病所致的支气管痉挛。当其用量达到治疗量5~10倍时，Clen可增强肌肉发育，降低脂肪沉积，因此又称瘦肉精。所以Clen常被作为饲料添加剂非法用于肉用动物的生产之中。更重要的是，由于Clen在动物体内吸收快，分布广，脂溶性高，具有残留性积累和半衰期长等特性。人在食用残留有Clen的肉品后引起的中毒事件不断发生。因此，各国政府度禁止Clen作为饲料添加剂用于肉用动物的生产之中。我国政府也规定严禁在饲料中添加Clen，并制订了Clen残留量标准。所以加强对该类药物在食品中的残留检测和监督非常必要。 

目前，国家标准和行业标准中对饲料及动物源性食品中克伦特罗残留的检测常采用HPLC和GC—MS法。虽然此方法特异性强、灵敏度高、精确，但是样本前处理操作步骤繁琐，成本高，再加上设备昂贵、花费大、操作技能要求高等原因而不适合大批量样品的筛选检测。免疫分析法（如酶联免疫法、胶体金法以及荧光免疫层析发），由于在抗原抗体的定性定量方面独特的优势和操作简便分析样本大等优点弥补了理化分析的不足，在β-兴奋剂的残留检测中起着越来越重要的作用。酶联免疫吸附测定法可同时检测多个样品，具有灵敏、特异性强等优点，但是不适用于现场检测。胶体金法和荧光免疫层析法操作简单、快速、无需大型检测仪器设备，更适用于现场及时检测，是快速检测发展的趋势。 

影响免疫分析法检测质量的根本原因是抗体的特异性与亲和性，这些性质又取决于免疫半抗原的分子结构，所以免疫半抗原分子设计与合成是产生特异性抗体和建立小分子药物残留快速检测技术研究最基础和最关键的步骤。 

    CN103159852A(2013-6-19)公开了一种特异性克伦特罗人工抗原的合成方法，然而该方法中所用的免疫半抗原的分子结构和人工抗原制备仍有待改进。 

发明内容

本发明的目的之一是提供一种特异性克伦特罗半抗原衍生物。 

本发明的目的之二是提供一种特异性克伦特罗半抗原衍生物的制备方法。 

本发明的目的之三是提供一种特异性克伦特罗抗原。 

本发明的目的之四是提供一种特异性克伦特罗抗原的制备方法。 

本发明的目的之五是提供所述克伦特罗半抗原和人工抗原在克伦特罗免疫检测中的应用。 

本发明提供了一种特异性克伦特罗半抗原衍生化合物，其化学结构式为： 

。

本发明半抗原衍生化合物是根据克伦特罗结构定向合成的衍生物，考虑到克伦特罗 与沙丁胺醇结构上的相似，所以选择与沙丁胺醇结构相似的一端设计引入羧基活性官能团结构，最大程度地保留并暴露了克伦特罗与沙丁胺醇有差异的且免疫原性大的部分，同时有具有与载体蛋白偶联的活性基团。 

本发明还保护所述克伦特罗半抗原衍生化合物的制备方法，其特征在于，以现有的化合物4-氨基-3,5-二氯溴代苯乙酮（CAS：37148-47-3）为原料，通过两步反应制备，其制备路径如下： 

      作为优选，所述反应条件具体为在0.015-0.028mol的4-氨基-3,5-二氯溴代苯乙酮固体中加入异丙醇作为溶剂，在冰水浴条件下加入0.01-0.03mol的4-氨基-4甲基-戊酸，常温反应0.8-1.2h，待原料完全转化后进行结晶、过滤、洗涤干燥得到第一白色固体；

将所述第一白色固体溶于乙醇中，依次加入0.001-0.003mol 92-98%的KBH₄ 0.002-0.003mol ZnCl₂，常温反应12-18h后，过滤；滤液浓缩，异丙醇洗涤，得到第二白色固体即为特异性克伦特罗半抗原衍生物。

所述第一白色固体为4 - {[ 2 -（4 -氨基-3,5 -二氯苯基）-2 - 氧代乙基]氨基}-4 - 甲基戊酸；所述第二白色固体即为克伦特罗半抗原衍生化合物。 

一种特异性克伦特罗人工抗原，其特征在于所述克伦特罗人工抗原是由所述特异性克伦特罗半抗原衍生化合物制备得到的，其化学结构式为： 

所述protein即载体蛋白为牛血清白蛋白或卵清蛋白。

一种利用本发明所述克伦特罗半抗原衍生化合物制备克伦特罗人工抗原的方法，其特征在于利用碳二亚胺法所述克伦特罗半抗原衍生化合物与载体蛋白偶联得到，包括以下步骤： 

P1、将所述克伦特罗半抗原衍生化合物溶解于DMSO或DMF中得到衍生化合物溶液；

P2、向P1中加入EDC（1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐）再加入NHS(N-羟基琥珀酰亚胺）室温、搅拌下均匀混合后反应15~60分钟；所述EDC、NHS和克伦特罗半抗原衍生化合物摩尔用量比为1~2:1~1.5:1~2；

P3、将P2中所得到的反应液在25~30度下加入到含有载体蛋白的溶液中搅拌，进行偶联反应1~5小时，其中所述载体蛋白为牛血清白蛋白或卵清蛋白；

所述载体蛋白为牛血清白蛋白时，衍生化合物与牛血清白蛋白的摩尔比为40~60:1，且合成的人工抗原为克伦特罗免疫原；载体蛋白为卵清蛋白时，衍生化合物与卵清蛋白的摩尔比为30~50:1，且合成的人工抗原为包被原；

P4、将P3所述反应液进行透析，收集透析液即为克伦特罗人工抗原。

优选地，P3中所述载体蛋白溶液的缓冲液为0.1mol/L的NaHCO₃缓冲液；P4中所述透析液为0.010.1mol/L的磷酸缓冲液（PH为7.2~7.9）。 

NaHCO₃缓冲液:称取8.4g NaHCO₃，溶于定容至1000ml超纯水中，调节PH至7.4；磷酸缓冲液：称取NaH₂PO₄·H₂O：0.3g，NaCL ：9g，Na₂HPO₄·12H₂O ：0.3g定容至1000ml，调节PH为7.1~7.8。 

   本发明还保护上述所述克伦特罗人工抗原在克伦特罗特异性抗体制备中的应用；所述抗体为单克隆抗体或多克隆抗体。 

    本发明还保护一种利用如上所述克伦特罗人工抗原为原料在克伦特罗免疫分析法检测中的应用，所述免疫分析法为胶体金法或荧光免疫层析法。 

     进一步地，所述克伦特罗人工抗原在荧光免疫层析法检测克伦特罗中的应用，其步骤如下： 

P1. 利用所述克伦特罗人工抗原免疫动物制备抗体；

P2. 细胞融合和筛选；

P3. 腹水制备和抗体纯化；

P4. 将P3中得到的抗体和抗兔IgG二抗分别进行荧光染料标记，并配制成检测分析液；

P5.将所述克伦特罗包被原和兔IgG抗体分别喷涂于硝酸纤维素膜条上的前后两端（靠近吸水纸端为前端，靠近样品垫为后端）制备检测线和质控线；

P6.将玻璃纤维样品垫、P5中所述含有检测线和质控线的硝酸纤维素膜、吸水纸和PVC黑色地板组装成免疫层析试纸条；

P7.将P6中所述试纸条切割适当宽度装入塑料卡盒中，与P4中所述检测分析液配套使用在荧光免疫层析检测仪上检测。

    本发明的优点及特点； 

     本发明提供了一种定向合成的克伦特罗衍生化合物，根据图3所示的克伦特罗和沙丁胺醇的结构特征，在其结构相同的一端（烷基端）定向衍生出活性官能团结构（羧基），最大程度的保留暴露了二者的特异性结构和免疫性强的结构（即苯环端的结构部分）；基于本发明的人工抗原制备方法，利用如上所述克伦特罗衍生化合物制备得到特异性的克伦特罗人工抗原；将所述特异性人工抗原制备出特异性抗体，并成功用于克伦特罗荧光免疫层析法检测中。

    本发明抗原和抗体原料都属于自制，原料成本大大降低，且抗原以及抗体特异性强，结合荧光免疫层析技术建立高特异性和高灵敏度的克伦特罗快速检测方法。 

附图说明

图1是克伦特罗衍生化合物结构式； 

图2 是克伦特罗人工抗原结构式；

图3是克伦特罗和沙丁胺醇结构式比对示意图；

图4是克伦特罗衍生化合物的¹H-NMR图谱；

图5是克伦特罗人工抗原（免疫原和包被原）的SDS-PAGE图；

图6是未装塑料卡的克伦特罗荧光免疫层析检测卡的结构；

图7是带有塑料卡盒的克伦特罗荧光免疫层析检测卡结构；

图8是荧光免疫层析法检测克伦特罗标准品抑制曲线图；

图9是克伦特罗荧光免疫层析检测阴性结果图谱；

图10是克伦特罗荧光免疫层析检测阳性结果图谱。

具体实施方式

   下面是结合附图进一步详细说明本发明。除特殊说明外，本发明在实施例中所用试剂盒原料均为常规试剂。 

   实施例1 

克伦特罗半抗原衍生化合物的第一种定向合成方法：

    S1. 称取4-氨基-3,5-二氯溴代苯乙酮(国产CAS：37148-47-3）

固体5.65g（0.02mol）于50ml三口瓶中，加入20ml异丙醇作为溶剂，在冰水浴条件下加入2.63g（0.02mol）4-氨基-4甲基-戊酸（进口品牌，CAS：3235-46-9）后，常温反应1h（TLC跟踪反应，原料已完全转化）、结晶、过滤、洗涤干燥得到白色固体，即：4 - {[ 2 -（4 -氨基-3,5 -二氯苯基）-2 - 氧代乙基]氨基}-4 - 甲基戊酸。

     S2. 将S1中得到的白色固体0.66g（0.002mol）溶于20ml乙醇总，依次加入0.11g（0.002mol）95%的KBH₄,0.27g（0.002mol）ZnCl₂，常温反应15h后，过滤。滤液浓缩，异丙醇洗涤，得到图1所示的白色固体0.58g,即：为克伦特罗衍生化合物。将合成的衍生化合物进行¹H-NMR鉴定，其结果如图4所示。 

克伦特罗半抗原衍生化合物的第二种定向合成方法： 

在0.015mol的4-氨基-3,5-二氯溴代苯乙酮固体中加入15ml异丙醇作为溶剂，在冰水浴条件下加入0.01mol的4-氨基-4甲基-戊酸，常温反应0.8h，待原料完全转化后进行结晶、过滤、洗涤干燥得到第一白色固体；

将第一白色固体溶于15ml乙醇中，依次加入0.001mol 92%的KBH₄ 0.002mol ZnCl₂，常温反应12h后，过滤；滤液浓缩，异丙醇洗涤，得到第二白色固体即为特异性克伦特罗半抗原衍生物。

   克伦特罗半抗原衍生化合物的第三种定向合成方法： 

在0.028mol的4-氨基-3,5-二氯溴代苯乙酮固体中加入30ml异丙醇作为溶剂，在冰水浴条件下加入0.03mol的4-氨基-4甲基-戊酸，常温反应1.2h，待原料完全转化后进行结晶、过滤、洗涤干燥得到第一白色固体；

将第一白色固体溶于30ml乙醇中，依次加入0.003mol 98%的KBH₄ 0.003mol ZnCl₂，常温反应18h后，过滤；滤液浓缩，异丙醇洗涤，得到第二白色固体即为特异性克伦特罗半抗原衍生物。

   实施例2 

克伦特罗人工抗原（免疫原和包被原）的第一种合成方法：

    称取40mg克伦特罗衍生化合物，溶解于2ml DMF中，形成20mg/ml的终浓度，取其中90μL与 6μL EDC（100mg/ml)混合, 再加入10ul NHS（50mg/ml), 均匀混合后在搅拌条件下反应15~60min。

     将上述反应混合液离心（1600rmp）后加入到1ml 6mg/mlBSA溶液中（或加入到1ml 4.5mg/ml OVA溶液中）在室温搅拌条件下反应1~5h后，用磷酸缓冲液透析4次，12h换一次液。收集透析液，用美国伯乐（BIO-RAD ）公司的Quick Start Bradford Protein Assay Kit测定免疫原和包被原的浓度分别为5.4mg/ml和3.8mg/ml。得到的克伦特罗人工抗原（免疫原和包被原）结构式如图2所示。图2中protein为BSA（牛血清蛋白）或OVA（卵清蛋白）。 

   所述BSA溶液（或OVA溶液）配制方法：称取60mg BSA（或45mg OVA）溶于10ml的0.1mol/L的NaHCO₃缓冲液. 

    所述NaHCO₃缓冲液制备方法:称取8.4g NaHCO₃，溶于定容至1000ml超纯水中，调节PH至7.1~7.9；

   所述磷酸缓冲液制备方法：称取NaH₂PO₄·2H₂O：0.3g，NaCL ：9g，Na₂HPO₄·12H₂O ：0.3g定容至1000ml，调节PH为7.3~7.8。

   克伦特罗免疫原（Clen-BSA）、BSA的SDS-PAGE图见附图5所示，M：marker；1：BSA；2:Clen-BSA;3:Clen-OVA; 4: OVA, 由附图可见BSA的分子量为66kDa，部分Clen-BSA的分子量大于BSA，所以电泳迁移率小于BSA，说明偶联成功。同样，Clen-OVA的分子量也大于OVA，偶联成功。 

克伦特罗人工抗原（免疫原和包被原）的第二种合成方法： 

P1、将克伦特罗半抗原衍生化合物溶解于DMSO中得到衍生化合物溶液；

P2、向P1中加入EDC（1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐）再加入NHS(N-羟基琥珀酰亚胺）室温、搅拌下均匀混合后反应15分钟；EDC、NHS和克伦特罗半抗原衍生化合物摩尔用量比为1:1~1:1；

P3、将P2中所得到的反应液在25度下加入到含有载体蛋白的溶液中搅拌，进行偶联反应1小时，其中所述载体蛋白为牛血清白蛋白或卵清蛋白；

所述载体蛋白为牛血清白蛋白时，衍生化合物与牛血清白蛋白的摩尔比为60:1，且合成的人工抗原为克伦特罗免疫原；载体蛋白为卵清蛋白时，衍生化合物与卵清蛋白的摩尔比为30:1，且合成的人工抗原为包被原；

P4、将P3所述反应液进行透析，收集透析液即为克伦特罗人工抗原。

   克伦特罗人工抗原（免疫原和包被原）的第三种合成方法： 

P1、将克伦特罗半抗原衍生化合物溶解于DMF中得到衍生化合物溶液；

P2、向P1中加入EDC（1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐）再加入NHS(N-羟基琥珀酰亚胺）室温、搅拌下均匀混合后反应15分钟；所述EDC、NHS和克伦特罗半抗原衍生化合物摩尔用量比为2:1.5:1；

P3、将P2中所得到的反应液在25度下加入到含有载体蛋白的溶液中搅拌，进行偶联反应1小时，其中所述载体蛋白为牛血清白蛋白或卵清蛋白；

所述载体蛋白为牛血清白蛋白时，衍生化合物与牛血清白蛋白的摩尔比为40:1，且合成的人工抗原为克伦特罗免疫原；载体蛋白为卵清蛋白时，衍生化合物与卵清蛋白的摩尔比为50:1，且合成的人工抗原为包被原；

P4、将P3所述反应液进行透析，收集透析液即为克伦特罗人工抗原。

    实施例3 

   克伦特罗人工抗原在荧光免疫层析检测克伦特罗中的应用：

  P1.免疫动物

   将实施例2中第一种合成方法得到的克伦特罗免疫原（Clen-BSA）稀释成0.2mg/ml,取500ul免疫原与等体积的弗氏完全佐剂混合后，乳化完全，免疫BALB/c小鼠，在小鼠背部皮下及足部进行注射免疫。第一次免疫用完全弗氏佐剂，之后用不完全弗氏佐剂。第四次免疫后一周眼眶取血，分离血清，测抗克伦特罗抗体的效价。 经ELISA检测，小鼠四次免疫后的抗体效价为1:322,000。

  P2. 细胞融合和筛选 

     四次免疫后的小鼠经腹腔注射约100μg免疫原再次加强免疫，3 天后，取该小鼠脾脏用于融合。取SP2/0细胞与脾细胞混合，加入无血清培养液，离心（1500rpm，3min），取沉淀细胞，逐滴加入1ml 50％ 聚乙二醇4000，静置90秒。 然后逐滴加入37℃预温的无血清培养液10ml，静置5min。融合后细胞悬液离心（1000rpm，3min），用完全培养液，接种于加有饲养层细胞的96孔板内，每孔2×10⁴/ml骨髓瘤细胞。置37℃，5％CO₂培养箱内培养两天，加入2×HAT的完全培养液，使孔内终浓度为1×HAT。待杂交瘤细胞集落长至孔底1/10-1/5面积的时候，即用ELISA方法筛选融合细胞抗体阳性孔。

    P3. 腹水制备和抗体纯化 

     取BALB/c小鼠，于腹腔注射0.5ml 石蜡油，7天后,腹腔注射0.5ml 1×10⁶ 阳性杂交瘤细胞。观察小鼠生长情况，7天左右可见腹部隆起，及时采集腹水。 利用亲和层析技术（Protein G Resin 亲和纯化）纯化得到高纯度的单克隆抗体，蛋白量为4mg。

   P4. 检测分析液制备 

   a. 分别荧光标记上述P3中得到的单克隆抗体和抗兔IgG抗体。

   b. 用含有BSA的磷酸缓冲液将荧光标记后的抗体稀释配制成检测分析液。 

    P5. 克伦特罗荧光免疫层析试纸卡制备 

    a. 用包被缓冲液 (磷酸缓冲液)分别将将实施例2中得到的克伦特罗包被原（Clen-OVA）和兔抗体IgG稀释到适当浓度 (0.25 mg/ml)。在25±5℃的温度下，将稀释后的Clen-OVA和兔抗体IgG均匀喷于硝酸纤维膜上（分别形成检测线和质控线），在12%-30%的湿度条件下烘干5~8小时左右，干燥保存备用；

b. 在黑色PVC基片上分别依次粘贴步骤a所得到的包被好的硝酸纤维素膜、玻璃纤维纸和吸水纸形成检测卡（图6），按照要求切割成适当宽度。图6中，1：黑色PVC基片；2：吸水纸：3：硝酸纤维素膜；4：玻璃纤维；5：质控线带（C线）；6：检测线带（T线）；

c.将步骤b所得到的检测卡装入卡盒的下盖中，盖上上盖，形成完整的带卡盒检测卡（图7）。图7中，1：下盖；2：上盖；3：加样窗口；4：玻璃纤维；5：检测窗口；6：质控线带（C线）；7：检测线带（T线）；8：硝酸纤维素膜；9：克伦特罗项目标志（Clen）；10：条形码识别区域；

    P6. 检测 

    取100ul 样本与100ul的检测分析液均匀混合后，取100ul加入到检测卡的加样窗口，反应5-10min后，在FCR荧光免疫分析仪（由湖州海创生物科技有限公司生产）上检测，根据样本的T线信号值与C线信号比值（T/C值）与Cutof值比对判断阴阳性结果。

     P7. 荧光免疫层析法检测克伦特罗的灵敏度 

     将空白尿液中添加克伦特罗标准品（购自德国DR公司），配置成0ng/ml、0.25ng/ml、0.5ng/ml、1ng/ml、2ng/ml、4ng/ml、8ng/ml系列浓度样品。将上述系列浓度样品按照P6中的步骤进行检测，每个样品重复3次，检测的实验结果如表1所示，根据表1数据以Clen浓度为横坐标，T/C值为纵坐标绘制标准曲线（四参数回归法回归）如图8所示。图8中曲线对应的方程如表2所示，计算得IC₅₀=0.86ng/ml。

将0ng/ml样品重复检测6次，分别计算其T/C值的平均值（X）、标准偏差（SD）以及精密度（CV值）。灵敏度的计算方式为，X-2*SD的T/C值在图8的标准曲线里所对应的Clen浓度值。 

   将表3数据中的X-2*SD的T/C值作为y值代入图8标准曲线对应的方程中(方程：y = (A - D) / [1 + (x/C)^B] + D）的到的x值为0.16ng/ml,即灵敏度为0.16ng/ml. 

   P8. 克伦特罗荧光免疫层析检测试纸卡检测原理

     采用竞争法检测，样品中的克伦特罗抗原和检测线（T线）上的克伦特罗抗原（包被原）竞争结合检测分析液中的荧光标记的抗克伦特罗抗体。当样本中抗原浓度很低时，检测线上结合的荧光抗体增多，进而检测线上的荧光信号就强，因此，检测线（T线）荧光信号与质控线（C线）上荧光信号的比值（T/C值）就大；反之，样本中克伦特罗抗原浓度较高时，T/C值就很小。所以，样本中克伦特罗含量越高，T/C值越低。根据T/C值与Cut of值的比较判断检测结果的阴阳性。

   如图9和10所示，分别是克伦特罗荧光免疫层析法检测的阴性和阳性结果图谱。由图可以看出，与阴性样本检测结果图谱相对比，阳性样本检测结果图谱中T线峰值远远小于阴性样本的峰值。阴性和阳性样本区分明显。 

   P9. 荧光免疫层析法检测克伦特罗的交叉反应 

   将常见的β2受体激动剂分别用阴性猪尿配置成30ng/ml的样本，进行荧光免疫层析检测，与正常阴性尿样以及Cutof值相比都呈现阴性结果。检测结果如表2所示：

      表2常见β2受体激动剂的荧光免疫层析检测结果

注：Cut off值为1ng/ml克伦特罗所对应的T/C值加上2倍SD范围。即：0.47~0.86。