含有脑膜炎奈瑟球菌B血清群外膜蛋白质的外膜囊(OMV)疫苗

文中引用的所有的文献都被完整地纳入作为参考。

                            技术领域

本发明涉及抗脑膜炎奈瑟球菌(Neisseria meningitidis)B血清群(NmB)的疫苗。

                            背景技术

脑膜炎奈瑟球菌是一种无运动性的革兰氏阴性双球菌人病原体。它群居于咽部，可引起脑膜炎，有时可在不出现脑膜炎的情况下发生败血病。在美国，每年的发病率为0.6-1/100,000人，在战争期间发病率会更高〔参见Lieberman等人(1996)，JAMA，275(19)：1499-1503；Schuchat等人(1997)，NEngl J Med，337(14)：970-976〕。在发展中国家，地方性发病比例会更高，在疫疾流行期间，发病率可达每年500例/100,000人。死亡率极高，在美国是10-20％，在发展中国家更高。在引入抗流感嗜血杆菌(Haemophilus influenzae)的联合疫苗后，脑膜炎奈瑟球菌就成了引起美国所有年龄段的人的细菌性脑膜炎的主要原因〔Schuchat等人(1997)，同上〕。

根据该菌的荚膜多糖，已经鉴定出12种脑膜炎奈瑟球菌的血清群。目前使用的脑膜炎球菌疫苗是由血清群A、C、Y和W135组成的四价多糖疫苗。在针对流感嗜血菌疫苗的成功之后，已开发了针对血清群A和C的偶联疫苗。

然而脑膜炎球菌B仍是一个问题。这种血清群导致约占美国、欧洲和南美脑膜炎总数的50％。不能采用多糖方法，因为menB荚膜多糖是一种α(2-8)-相连的N-乙酰神经氨酸的聚合物，它也存在于哺乳动物组织中。这就导致了对抗原的耐免，事实上如果引发应答，该应答将会是防自身的，因此是不良的。为了避免引发自体免疫和引发保护性免疫应答，将荚膜多糖进行例如化学修饰，用N-丙酰基替代N-乙酰基，而不改变其特异性抗原性〔Romero & Outschoom(1994)ClinMicrobiol Rev 7(4)：559-575)。

已由挪威国家公共卫生委员会制备了抗B血清群的有效的外膜囊(OMV)疫苗〔如Bjune等人(1991)，Lancet，338(8775)：1093-96〕。虽然这种疫苗是安全的，并可预防NmB发病，但是它的疗效受到用于制备这种疫苗的菌株的限制。也已报道了以外膜制剂为基础的其它疫苗。本发明的目的是将这些疫苗的药效扩大至其它菌株。

                           发明的公开

令人惊讶的是，已发现将已经确定的成分加到OMV疫苗中可明显地扩大它们的药效范围。

因而，本发明提供一种组合物，它含有(a)NmB外膜制剂，和(b)下述免疫原性成分中的一种或多种：

·WO99/57280中公开的蛋白质或其免疫原性片段；

·WO99/36544中公开的蛋白质或其免疫原性片段；

·WO99/24578中公开的蛋白质或其免疫原性片段；

·WO00/66791中公开的蛋白质或其免疫原性片段；

·Tettelin等人〔Science(2000)，287：1809-1815〕公开的蛋白质或其免疫原性片段；

·Parkhill等人〔Nature(2000)，404：502-506〕公开的蛋白质或其免疫原性片段；

·WO97/28273中公开的蛋白质或其免疫原性片段；

·WO96/29412中公开的蛋白质或其免疫原性片段；

·WO95/03413中公开的蛋白质或其免疫原性片段；

·WO99/31132中公开的蛋白质或其免疫原性片段；

·WO99/58683中公开的蛋白质或其免疫原性片段；

·WO99/55873中公开的蛋白质或其免疫原性片段；

·脑膜炎奈瑟球菌PorA蛋白、TbpA蛋白、TbpB蛋白、PilC蛋白、OpA蛋白或Omp85蛋白。

如果所述组合物含有WO99/24578中公开的蛋白质，则所述蛋白质较佳含有选自该文中以下的氨基酸序列：SEQ ID 2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、90、92、94、96、98、100、102、104、106、108、110、112、114、116、118、120、122、124、126、128、130、132、134、136、138、140、142、144、146、148、150、152、154、156、158、160、162、164、166、168、170、172、174、176、178、1 80、182、184、186、188、190、192、194、196、198、200、202、204、206、208、210、212、214、216、218、220、222、224、226、228、230、232、234、236、238、240、242、244、246、248、250、252、254、256、258、260、262、264、266、268、270、272、274、276、278、280、282、284、286、288、290、292、294、296、298、300、302、304、306、308、310、312、314、316、318、320、322、324、326、328、330、332、334、336、338、340、342、344、346、348、350、352、354、356、358、360、362、364、366、368、370、372、374、376、378、380、382、384、386、388、390、392、394、396、398、400、402、404、406、408、410、412、414、416、418、420、422、424、426、428、430、432、434、436、438、440、442、444、446、448、450、452、454、456、458、460、462、464、466、468、470、472、474、476、478、480、482、484、486、488、490、492、494、496、498、500、502、504、506、508、510、512、514、516、518、520、522、524、526、528、530、532、534、536、538、540、542、544、546、548、550、552、554、556、558、560、562、564、566、568、570、572、574、576、578、580、582、584、586、588、590、592、594、596、598、600、602、604、606、608、610、612、614、616、618、620、622、624、626、628、630、632、634、636、638、640、642、644、646、648、650、652、654、656、658、660、662、664、666、668、670、672、674、676、678、680、682、684、686、688、690、692、694、696、698、700、702、704、706、708、710、712、714、716、718、720、722、724、726、728、730、732、734、736、738、740、742、744、746、748、750、752、754、756、758、760、762、764、766、768、770、772、774、776、778、780、782、784、786、788、790、792、794、796、798、800、802、804、806、808、810、812、814、816、818、820、822、824、826、828、830、832、834、836、838、840、842、844、846、848、850、852、854、856、858、860、862、864、866、868、870、872、874、876、878、880、882、884、886、888、890、和892〔或含有一种或多种这些SEQ ID的免疫原性片段的蛋白质，或含有与这些SEQ ID之一有序列相同性(宜高于50％，如60％、70％、80％、90％、95％、99％或更高)的序列的蛋白质〕；

如果所述组合物含有WO99/36544中公开的蛋白质，则所述蛋白质较佳含有含有选自该文中以下氨基酸序列：SEQ ID 2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、和90〔或含有一种或多种这些SEQ ID的免疫原性片段的蛋白质，或含有与这些SEQ ID之一有序列相同性(宜高于50％，如60％、70％、80％、90％、95％、99％或更高)的序列的蛋白质〕；

如果所述组合物含有Tettelin等人公开的蛋白质(即由该文公开的一种基因编码的蛋白质)，则所述蛋白质较佳含有选自NMB0001到NMB2160的一条氨基酸序列〔或者含有这2160个基因中的一个或多个的免疫原性片段的蛋白质，或者含有与这2160个基因之一具有序列同一性(较佳大于50％，如60％、70％、80％、90％、95％、99％或以上)的序列的蛋白质〕。

如果所述组合物含有Parkhill等人公开的蛋白质，则所述蛋白质较佳含有选自该文中公开的2121个编码序列的一个氨基酸序列〔或者含有这2121个序列的一个或多个的免疫原性片段的蛋白质，或者含有与这2121个序列中的一个具有序列同一性(较佳大于50％，如60％、70％、80％、90％、95％、99％或以上)的序列的蛋白质〕。

如果所述组合物含有WO99/57280中公开的蛋白质，则所述蛋白质较佳含有选自该文中的以下氨基酸序列：SEQ ID 2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、90、92、94、96、98、100、102、104、106、108、110、112、114、116、118、120、122、124、126、128、130、132、134、136、138、140、142、144、146、148、150、152、154、156、158、160、162、164、166、168、170、172、174、176、178、180、182、184、186、188、190、192、194、196、198、200、202、204、206、208、210、212、214、216、218、220、222、224、226、228、230、232、234、236、238、240、242、244、246、248、250、252、254、256、258、260、262、264、266、268、270、272、274、276、278、280、282、284、286、288、290、292、294、296、298、300、302、304、306、308、310、312、314、316、318、320、322、324、326、328、330、332、334、336、338、340、342、344、346、348、350、352、354、356、358、360、362、364、366、368、370、372、374、376、378、380、382、384、386、388、390、392、394、396、398、400、402、404、406、408、410、412、414、416、418、420、422、424、426、428、430、432、434、436、438、440、442、444、446、448、450、452、454、456、458、460、462、464、466、468、470、472、474、476、478、480、482、484、486、488、490、492、494、496、498、500、502、504、506、508、510、512、514、516、518、520、522、524、526、528、530、532、534、536、538、540、542、544、546、548、550、552、554、556、558、560、562、564、566、568、570、572、574、576、578、580、582、584、586、588、590、592、594、596、598、600、602、604、606、608、610、612、614、616、618、620、622、624、626、628、630、632、634、636、638、640、642、644、646、648、650、652、654、656、658、660、662、664、666、668、670、672、674、676、678、680、682、684、686、688、690、692、694、696、698、700、702、704、706、708、710、712、714、716、718、720、722、724、726、728、730、732、734、736、738、740、742、744、746、748、750、752、754、756、758、760、762、764、766、768、770、772、774、776、778、780、782、784、786、788、790、792、794、796、798、800、802、804、806、808、810、812、814、816、818、820、822、824、826、828、830、832、834、836、838、840、842、844、846、848、850、852、854、856、858、860、862、864、866、868、870、872、874、876、878、880、882、884、886、888、890、892、894、896、898、900、902、904、906、908、910、912、914、916、918、920、922、924、926、928、930、932、934、936、938、940、942、944、946、948、950、952、954、956、958、960、962、964、966、968、970、972、974、976、978、980、982、984、986、988、990、992、994、996、998、1000、1002、1004、1006、1008、1010、1012、1014、1016、1018、1020、1022、1024、1026、1028、1030、1032、1034、1036、1038、1040、1042、1044、1046、1048、1050、1052、1054、1056、1058、1060、1062、1064、1066、1068、1070、1072、1074、1076、1078、1080、1082、1084、1086、1088、1090、1092、1094、1096、1098、1100、1102、1104、1106、1108、1110、1112、1114、1116、1118、1120、1122、1124、1126、1128、1130、1132、1134、1136、1138、1140、1142、1144、1146、1148、1150、1152、1154、1156、1158、1160、1162、1164、1166、1168、1170、1172、1174、1176、1178、1180、1182、1184、1186、1188、1190、1192、1194、1196、1198、1200、1202、1204、1206、1208、1210、1212、1214、1216、1218、1220、1222、1224、1226、1228、1230、1232、1234、1236、1238、1240、1242、1244、1246、1248、1250、1252、1254、1256、1258、1260、1262、1264、1266、1268、1270、1272、1274、1276、1278、1280、1282、1284、1286、1288、1290、1292、1294、1296、1298、1300、1302、1304、1306、1308、1310、1312、1314、1316、1318、1320、1322、1324、1326、1328、1330、1332、1334、1336、1338、1340、1342、1344、1346、1348、1350、1352、1354、1356、1358、1360、1362、1364、1366、1368、1370、1372、1374、1376、1378、1380、1382、1384、1386、1388、1390、1392、1394、1396、1398、1400、1402、1404、1406、1408、1410、1412、1414、1416、1418、1420、1422、1424、1426、1428、1430、1432、1434、1436、1438、1440、1442、1444、1446、1448、1450、1452、1454、1456、1458、1460、1462、1464、1466、1468、1470、1472、1474、1476、1478、1480、1482、1484、1486、1488、1490、1492、1494、1496、1498、1500、1502、1504、1506、1508、1510、1512、1514、1516、1518、1520、1522、1524、1526、1528、1530、1532、1534、1536、1538、1540、1542、1544、1546、1548、1550、1552、1554、1556、1558、1560、1562、1564、1566、1568、1570、1572、1574、1576、1578、1580、1582、1584、1586、1588、1590、1592、1594、1596、1598、1600、1602、1604、1606、1608、1610、1612、1614、1616、1618、1620、1622、1624、1626、1628、1630、1632、1634、1636、1638、1640、1642、1644、1646、1648、1650、1652、1654、1656、1658、1660、1662、1664、1666、1668、1670、1672、1674、1676、1678、1680、1682、1684、1686、1688、1690、1692、1694、1696、1698、1700、1702、1704、1706、1708、1710、1712、1714、1716、1718、1720、1722、1724、1726、1728、1730、1732、1734、1736、1738、1740、1742、1744、1746、1748、1750、1752、1754、1756、1758、1760、1762、1764、1766、1768、1770、1772、1774、1776、1778、1780、1782、1784、1786、1788、1790、1792、1794、1796、1798、1800、1802、1804、1806、1808、1810、1812、1814、1816、1818、1820、1822、1824、1826、1828、1830、1832、1834、1836、1838、1840、1842、1844、1846、1848、1850、1852、1854、1856、1858、1860、1862、1864、1866、1868、1870、1872、1874、1876、1878、1880、1882、1884、1886、1888、1890、1892、1894、1896、1898、1900、1902、1904、1906、1908、1910、1912、1914、1916、1918、1920、1922、1924、1926、1928、1930、1932、1934、1936、1938、1940、1942、1944、1946、1948、1950、1952、1954、1956、1958、1960、1962、1964、1966、1968、1970、1972、1974、1976、1978、1980、1982、1984、1986、1988、1990、1992、1994、1996、1998、2000、2002、2004、2006、2008、2010、2012、2014、2016、2018、2020、2022、2024、2026、2028、2030、2032、2034、2036、2038、2040、2042、2044、2046、2048、2050、2052、2054、2056、2058、2060、2062、2064、2066、2068、2070、2072、2074、2076、2078、2080、2082、2084、2086、2088、2090、2092、2094、2096、2098、2100、2102、2104、2106、2108、2110、2112、2114、2116、2118、2120、2122、2124、2126、2128、2130、2132、2134、2136、2138、2140、2142、2144、2146、2148、2150、2152、2154、2156、2158、2160、2162、2164、2166、2168、2170、2172、2174、2176、2178、2180、2182、2184、2186、2188、2190、2192、2194、2196、2198、2200、2202、2204、2206、2208、2210、2212、2214、2216、2218、2220、2222、2224、2226、2228、2230、2232、2234、2236、2238、2240、2242、2244、2246、2248、2250、2252、2254、2256、2258、2260、2262、2264、2266、2268、2270、2272、2274、2276、2278、2280、2282、2284、2286、2288、2290、2292、2294、2296、2298、2300、2302、2304、2306、2308、2310、2312、2314、2316、2318、2320、2322、2324、2326、2328、2330、2332、2334、2336、2338、2340、2342、2344、2346、2348、2350、2352、2354、2356、2358、2360、2362、2364、2366、2368、2370、2372、2374、2376、2378、2380、2382、2384、2386、2388、2390、2392、2394、2396、2398、2400、2402、2404、2406、2408、2410、2412、2414、2416、2418、2420、2422、2424、2426、2428、2430、2432、2434、2436、2438、2440、2442、2444、2446、2448、2450、2452、2454、2456、2458、2460、2462、2464、2466、2468、2470、2472、2474、2476、2478、2480、2482、2484、2486、2488、2490、2492、2494、2496、2498、2500、2502、2504、2506、2508、2510、2512、2514、2516、2518、2520、2522、2524、2526、2528、2530、2532、2534、2536、2538、2540、2542、2544、2546、2548、2550、2552、2554、2556、2558、2560、2562、2564、2566、2568、2570、2572、2574、2576、2578、2580、2582、2584、2586、2588、2590、2592、2594、2596、2598、2600、2602、2604、2606、2608、2610、2612、2614、2616、2618、2620、2622、2624、2626、2628、2630、2632、2634、2636、2638、2640、2642、2644、2646、2648、2650、2652、2654、2656、2658、2660、2662、2664、2666、2668、2670、2672、2674、2676、2678、2680、2682、2684、2686、2688、2690、2692、2694、2696、2698、2700、2702、2704、2706、2708、2710、2712、2714、2716、2718、2720、2722、2724、2726、2728、2730、2732、2734、2736、2738、2740、2742、2744、2746、2748、2750、2752、2754、2756、2758、2760、2762、2764、2766、2768、2770、2772、2774、2776、2778、2780、2782、2784、2786、2788、2790、2792、2794、2796、2798、2800、2802、2804、2806、2808、2810、2812、2814、2816、2818、2820、2822、2824、2826、2828、2830、2832、2834、2836、2838、2840、2842、2844、2846、2848、2850、2852、2854、2856、2858、2860、2862、2864、2866、2868、2870、2872、2874、2876、2878、2880、2882、2884、2886、2888、2890、2892、2894、2896、2898、2900、2902、2904、2906、2908、2910、2912、2914、2916、2918、2920、2922、2924、2926、2928、2930、2932、2934、2936、2938、2940、2942、2944、2946、2948、2950、2952、2954、2956、2958、2960、2962、2964、2966、2968、2970、2972、2974、2976、2978、2980、2982、2984、2986、2988、2990、2992、2994、2996、2998、3000、3002、3004、3006、3008、3010、3012、3014、3016、3018和3020〔或含有一种或多种这些SEQ ID的免疫原性片段的蛋白质，或含有与这些SEQ ID之一有序列相同性(宜高于50％，如60％、70％、80％、90％、95％、99％或更高)的序列的蛋白质〕。

如果所述组合物含有WO99/28273公开的蛋白质，则所述蛋白质较佳是该文献在图4或图13中公开的蛋白质。

如果所述组合物含有WO96/29412公开的蛋白质，则所述蛋白质较佳含有选自该文献公开的第1-8条序列中的一条氨基酸序列〔或者含有这些序列的一条或多条免疫原性片段的蛋白质，或者含有与这些序列中的一条具有序列同一性(较佳大于50％，如60％、70％、80％、90％、95％、99％或以上)的序列的蛋白质〕。

如果所述组合物含有WO95/03413公开的蛋白质，则所述蛋白质较佳含有选自该文献公开的第1-23条序列中的一条氨基酸序列〔或者含有这些序列的一条或多条免疫原性片段的蛋白质，或者含有与这些序列中的一条具有序列同一性(较佳大于50％，如60％、70％、80％、90％、95％、99％或以上)的序列的蛋白质〕。

如果所述组合物含有WO99/31132公开的蛋白质，则所述蛋白质较佳含有选自该文献公开的SEQ ID 2的氨基酸序列〔或者含有该序列的免疫原性片段的蛋白质，或者含有与该序列具有序列同一性(较佳大于5O％，如60％、70％、80％、90％、95％、99％或以上)的序列的蛋白质〕。

如果所述组合物含有WO99/58683中公开的蛋白质，则所述蛋白质较佳含有选自该文献公开的SEQ ID 2或SEQ ID 4的氨基酸序列〔或者含有SEQ ID 2或SEQID 4的免疫原性片段的蛋白质，或者含有与SEQ ID 2或SEQ ID 4具有序列同一性(较佳大于50％，如60％、70％、80％、90％、95％、99％或以上)的序列的蛋白质〕。

如果所述组合物含有WO99/55873中公开的蛋白质，则所述蛋白质较佳含有选自该文献公开的SEQ ID 2或SEQ ID 4的氨基酸序列〔或者含有SEQ ID 2或SEQID 4的免疫原性片段的蛋白质，或者含有与SEQ ID 2或SEQ ID 4具有序列同一性(较佳大于50％，如60％、70％、80％、90％、95％、99％或以上)的序列的蛋白质〕。

可在Wiertz等人〔Infect.Immun.(1996)，61：298-304〕中找到Opa和PorA的详细描述。PilC在Nassif等人〔PNAS USA(1994)，91：3769-73〕的文献中公开。Omp85在Manning等人〔Microb.Pathog.(1998)，25：11-21〕的文献中公开。TbpA和TbpB在Ala＇Aldeen和Borriello(Vaccine(1996)，14：49-53〕以及Legrain等人〔Protein Expr Purif(1995)，6：570-578〕的文献中公开。

用于组分(b)的较佳蛋白质是：

·蛋白质＇919＇，由WO99/57280的SEQ ID 3069-3074和SEQ ID 3027-3241代表(还可参见该文中的图23和实施例15)；

·蛋白质＇235＇，由WO99/57280的SEQ ID 869-874和3149-3178代表(还可参见该文中的图20和实施例12)；

·蛋白质＇519＇，由由WO99/57280的SEQ ID 3045-3056和3158-3206代表(还可参见该文中的图22和实施例14)；

·蛋白质＇225＇，由WO99/57280的SEQ ID 793-804和3115-3148代表(还可参见该文中的图19和实施例11)；

·蛋白质＇ORF40＇，由WO99/36544的实施例1(SEQ ID 1-6)代表(还可参见WO00/66741的图1，还可参见WO99/31132和WP99/58683)；

·蛋白质＇287＇，由WO99/57280的实施例9代表(还可参见该文中的SED ID1199-1204、3103-3108和3179-3184)；

·蛋白质＇ORF1＇，由WO99/24578的实施例77(SEQ ID 647-654)代表(还可参见WO99/55873和登记号AJ242535)；

·蛋白质＇ORF4＇，由WO99/24578的实施例26(SEQ ID 215-226)代表(还可参见WO00/66741的图2)；

·蛋白质＇ORF46＇，由WO99/24578的实施例55(SEQ ID 457-466)代表(还可参见WO00/66741的图12)。

所述组合物的组分(b)较佳是NmB蛋白。较佳的是，组分(b)包含从获得组分(a)的OMV的不同NmB菌株获得的蛋白质，即所述组分(a)中的OMV较佳由从不同NmB菌株得到的免疫原性组分(b)补充。

可使一种或多种上述成分(或者全部)吸附到Al(OH)₃上。

外膜制剂组分

本发明的组合物包含作为组分(a)的NmB外膜制剂。这种制品较佳成外膜囊(OMV)的形式。

从NmB制备OMV在本领域中是周知的。获得适当的制品的方法在如下文献中公开：Claassen等人〔Vaccine(1996)，14：1001-1008〕；Cartwright等人〔Vaccine(1999)，17：2612-2619)；Peeters等人〔Vaccine(1996)，14：1009-1015〕；Fu等人〔Biotechnology NY(1995)，12：170-74〕；Davies等人〔J.Immunol.Meth.(1990)，134：215-225〕；Saunders等人〔Infect.Immun.(1999)，67：113-119〕；Draabick等人〔Vaccine(2000)，18：160-172〕；Moreno等人〔Infect.Immun.(1985)，47：527-533〕；Milagres等人〔Infect.Immun.(1994)，62：4419-4424〕；Naess等人〔Infect.Immun.(1998)，66：959-965〕；Rosenqvist等人〔Dev.Biol.Stand.(1998)，92：323-333〕；Haneberg等人〔Infect.Immun.(1998)，66：1334-41〕；Andersen等人〔Vaccine(1997)，15：1225-34〕；Bjune等人〔Lancer(1991)，338：1093-96)等等。

OMV较佳是NmB的脱氧胆酸盐抽提产物(即通过脱氧胆酸盐抽提NmB获得的产物)。Fredriksen等人〔MenB-疫苗“Folkehelsa”：一种抗B型脑膜炎球菌疾病的外膜囊疫苗的制备、鉴定和控制(1991)，NIPH Ann.，14(2)：67-80〕。

用于从中抽提OMV的较佳菌株是脑膜炎奈瑟球菌的44/76菌株(B：15：P1.7，16：P5.5：L3、7、9)。

关于OMV组分的更详细描述可在以下文献中查索：如Bjune等人〔Lancet(1991)，338(8775)：1093-96〕，或Fredriksen等人〔抗B型脑膜炎球菌疾病的外膜囊疫苗MenB-疫苗“Folkehelsa”中的高分子量组分的鉴定，Pathobiologyand immunobiology of Neisseriaceae的第818-824页(Cinde-Glez等人编辑)，ISBN，968-6502-13-0〕。

所述OMV组分可被吸附到氢氧化铝佐剂上。较佳的蛋白质：佐剂比为1∶67(wt/wt)。

人用疫苗的标准剂型剂含有25μg蛋白质、2μg LPS和1.67mg Al(OH)₃，可以0.5ml的体积注射到三角肌中。

可对所述OMV组分(如采用脱氧胆酸盐抽提法获得的)进行处理，以除去某些成分。例如，可除去热原成分或毒性成分(如LPS)。

较佳的是，如Fredfiksen等人〔Pathobiology and immunobiology of Neisseriaceae的第818-824页〕所述，所述OMV组分应保留80kDa的抗原成分。

更佳的是，所述OMV应保留含有一种或多种下述氨基酸序列的蛋白质：SEQID 3、SEQ ID 5、SEQ ID 7、SEQ ID 9、SEQ ID 11、SEQ ID 13〔或者(i)与SEQ ID3、SEQ ID 5、SEQ ID 7、SEQ ID 9、SEQ ID 11、SEQ ID 13具有序列同一性的蛋白质——根据具体的序列，序列同一性的程度较佳大于50％(如60％、70％、80％、90％、95％、99％或以上)，该蛋白质包括突变体和等位基因变异体，或者(ii)含有SEQ ID 1、SEQ ID 3、SEQ ID 5、SEQ ID 7、SEQ ID 9、SEQ ID 11或SEQ ID13的免疫原性片段的蛋白质——该片段应含有对应序列上的至少n个连续的氨基酸，根据具体的序列，n是7或以上(如8、10、12、14、16、18、20或以上)〕。

将组分(a)和(b)混合

通过使组分(a)与外膜制剂简单地混合〔如通过使ORF4与挪威(Norwegian)OMV混合〕可混合组分(a)和(b)。

或者，以细菌在其外膜产生(较佳高产量)组分(a)的方式对细菌进行处理而将这两种组分混合——从这种重组细菌获得的外膜制剂将同时含有组分(a)和组分(b)。

在此方法中用于处理的合适细菌包括脑膜炎奈瑟球菌(任何血清群或菌株)、乳酰胺奈瑟球菌(Neisseria lactamica)、灰色奈瑟球菌(Neisseria cinerea)或任何其它未定型的奈瑟球菌。也可使用其它革兰氏阴性菌，如大肠埃希杆菌、沙门菌属(Salmonella)、志贺菌属(Shigella)、博代杆菌属(Bordetella)、耶尔森氏菌属(Yersinia)、螺杆菌属(Helicobacter)等等。转化方法在本领域中是周知的。

多价疫苗

视需要，本发明的组合物还可含有一种或多种下述组分：

·抗脑膜炎奈瑟球菌A血清群的保护性抗原；

·抗脑膜炎奈瑟球菌C血清群的保护性抗原；

·抗脑膜炎奈瑟球菌Y血清群的保护性抗原；

·抗脑膜炎奈瑟球菌W血清群的保护性抗原；

·抗流感嗜血杆菌的保护性抗原；

·抗肺炎球菌(pneumococcus)的保护性抗原；

·抗白喉的保护性抗原；

·抗破伤风的保护性抗原；

·抗百日咳的保护性抗原；

·抗幽门螺杆菌的保护性抗原；

·抗脊髓灰质炎的保护性抗原；和/或

·抗B型肝炎病毒的保护性抗原。

这些任选的成分的较佳例子是：

·抗脑膜炎奈瑟球菌A血清群的多糖抗原；

·抗脑膜炎奈瑟球菌C血清群的多糖抗原，如Costantino等人(1992) Vaccine，10：691-698中所述；

·抗脑膜炎奈瑟球菌Y血清群的多糖抗原；

·抗脑膜炎奈瑟球菌W血清群的多糖抗原；

·抗流感嗜血杆菌的多糖抗原；

·抗肺炎球菌的多糖抗原；

·抗白喉的保护性抗原，由白喉毒素组成，如CRM197突变体〔如Del Guidice等人(1998)，MolecularAspects of Medicine，19：1-70〕；

·抗破伤风保护性抗原，由破伤风毒素组成〔如Wassilak和Orenstein，Vaccines(Plotkin和Mortimer编辑)的第4章，1988〕；

·抗百日咳的保护性抗原，含有百日咳全毒素(PT)和丝状血细胞凝集素(FHA)，视需要还可含有pertactin和/或凝集原2和凝集原3〔如Gustafsson等人(1996)，N.Engl.J.Med.，334：349-355；Rappuoli等人(1991)，TIBTECH，9：232-238〕；

·抗幽门螺杆菌的保护性抗原，含有一种或多种CagA(如WO93/18150)、VacA(如WO93/18150)、NAP(如WO99/53310)、HopX(如WO98/04702)、HopY(如WO98/04702)、脲酶；

·抗B型肝炎病毒的保护性抗原，由HBV表面抗原和/或HBV核心抗原组成。

当组合物含有抗白喉的抗原时，这种组合物宜含有抗破伤风和脊髓灰质炎的抗原。当组合物含有抗破伤风的抗原时，该组合物宜含有抗白喉和脊髓灰质炎的抗原。当组合物含有抗脊髓灰质炎的抗原时，该组合物宜含有抗白喉和破伤风的抗原。

百日咳毒素是毒素蛋白，当存在于组合物中时，宜将其去毒。去毒化可通过化学和/或遗传方法进行。优选的去过毒的突变体是9K/129G双突变体〔如，Rappuoli(1997)Nature Medicine 3：374-376〕。

当组合物含有以不同新生和成熟形式存在的蛋白质时，宜选用该蛋白质的成熟形式。例如，当含有NspA时，(WO96/29412；还可参见Martin等人(1997)J.Exp.med1851173-1183)宜选用没有信号肽的蛋白质成熟形式。

当组合物含有多糖抗原时，宜将多糖偶联于载体蛋白。

治疗、预防和诊断

本发明的组合物较佳是一种疫苗。本发明的疫苗可以是预防性的(即预防感染)或治疗性的(即感染后治疗疾病)。

本发明还提供了用作药剂(宜为疫苗)或作为诊断试剂的本发明的组合物。本发明还提供了本发明的组合物在生产下列物质中的应用：(i)用于治疗或预防奈瑟球菌属细菌感染的药剂；(ii)用于检测奈瑟球菌属细菌或检测抗奈瑟球菌属细菌抗体是否存在的诊断试剂；和/或(iii)用于产生抗奈瑟球菌属细菌的抗体的试剂。所述奈瑟球菌属细菌可以是任何物种或菌株(例如淋病奈瑟球菌，N.gonorrhoeae)，但优选脑膜炎奈瑟球菌，尤其是血清群B。

本发明还提供了一种治疗患者的方法，该方法包括给予患者治疗有效量的本发明的组合物。该方法宜为免疫法。

方法

根据另一方面，本发明提供各种方法。

给出生产本发明组合物的一种方法，包括从脑膜炎奈瑟球菌抽提(如脱氧胆酸盐抽提)出OMV。

                            序列表

序列表中的序列如下：

                      实施本发明的方式

以下是为了实施本发明(如将公开的序列用于免疫接种或诊断)而可能使用到的标准技术和方法的归纳。这一归纳并不是对本发明进行限制，而是给出可能使用到而非必需的实施例。

纲要

除非另有说明，否则本发明的实施将使用分子生物学、微生物学、重组DNA和免疫学的常规技术，这些技术都是本领域熟练的技术人员所掌握的。这些技术在下述文献中有充分的描述：如Sambrook的Molecular Cloning；A LaboratoryManual，第二版(1989)；DNA Cloning，第I和II卷(D.N Glover编辑，1985)；Oligonucleotide Synthesis(M.J.Gait编辑，1984)；Nucleic Acid Hybridization(B.D.Hames和S.J.Higgins编辑，1984)；Transcription and Translation(B.D.Hames和S.J.Higgins编辑，1984)；Animal Cell Culture(R.I.Freshney编辑，1986)；ImmobilizedCells and Enzymes(IRL出版社，1986)；B.Perbal，A Practical Guide to MolecularCloning(1984)；the Methods in Enzymology series(Academic Press，Inc.)，尤其是第154和155卷；Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells(J.H.Miller和M.P.Calos编辑，1987，Cold Spring Harbor Laboratory)；Mayer和Walker编辑(1987)，Immunochemical Methods in Cell and Molecular Biology(Academic Press，London)；Scopes，(1987)Protein Purification：Principles and Practice，第二版(Springer-Verlag，N.Y.)和Handbook of Experimental Immunology，第I-IV卷(D.M.Weir和C.C.Blackwell编辑，1986)。

在本说明书中使用核苷酸和氨基酸的标准缩写。

可采用各种方法制备本发明使用的蛋白质(如重组表达、从细胞培养物中纯化、化学合成等)，并将其制成各种形式(如天然的、融合的等)。较佳的是以基本纯净的形式制备(即基本上没有其它奈瑟球菌或其它宿主细胞的蛋白质)。

可采用许多方法制备用于本发明的核酸(如化学合成、从基因组或cDNA库获得、从生物体自身获得等)，并且所制得的核酸可以成各种形式(如单链、双链、载体、探针等)。术语“核酸”包括DNA和RNA，还有它们的类似物(如那些含有修饰的骨架的核酸)，以及肽核酸(PNA)等。

定义

当组合物中X+Y总重量的至少85％是X时，则称含有X的组合物“基本无Y”。较佳地，X占组合物中X+Y总重量的至少约90％，更佳地为至少约95％或者甚至99％(重量)。

术语“包含”指“含有”和“由......构成”，例如“包含”X的组合物可以完全由X构成，或者可以含有X之外的物质，例如X+Y。

术语“异源”指在自然界中发现不在一起的两种生物学组分。这种组分可以是宿主细胞、基因、或调控区如启动子。尽管异源组分在自然界中发现不在一起，但是它们能一起起作用，例如当与某基因异源的一种启动子与该基因操作性相连时。另一个例子是奈瑟球菌序列与小鼠宿主细胞异源。另一例子是来自相同或不同蛋白质的两个表位，它们已经以自然界没有的排列方式组装在一个蛋白质中。

“复制起点”是启动和调节多核苷酸(例如表达载体)复制的一种多核苷酸序列。复制起点可作为细胞内多核苷酸复制的自主性单位，能在其自身的控制下进行复制。复制起点是载体在特定宿主细胞中复制所需要的。有了某一复制起点，表达载体就能在细胞中合适蛋白的存在下高拷贝数地复制。这些起点的例子是在酵母中有效的自主复制序列；以及在COS-7细胞中有效的病毒性T-抗原。

较佳采用在MPSRCH程序(Oxford Molecular)中执行的Smith-Waterman同一性检索算法测定蛋白质间的同一性，使用参数缺口罚分(gap open penalty)＝12和缺口延伸罚分(gap extension penalty)＝1进行缺口仿射搜索(affine gap search)。通常，两个蛋白质有50％以上的同一性即可认为它们在功能上相当。

核酸分子或提供核酸序列的区域的“等位基因变异体”在本文中指基本上在另一基因组或第二种分离物的基因组中的相同位置产生、并且由于天然变异(如突变或重组)而产生与所述基因组具有类似而非相同的核酸序列的核酸分子或区域。编码区域的等位基因变异体一般编码活性与由与它比较的基因编码的蛋白质类似的蛋白质。等位基因变异体还可在基因的5＇或3＇不翻译区域(如调节控制区域)有改变(如美国专利第5753/235号)。

表达系统

奈瑟球菌属细菌的核苷酸序列可在各种不同的表达系统中表达；例如那些使用哺乳动物细胞、杆状病毒、植物、细菌和酵母的系统。

i.哺乳动物系统

哺乳动物表达系统是本领域中已知的。哺乳动物启动子是能结合哺乳动物RNA聚合酶并启动编码序列(如结构基因)的下游(3＇)转录成mRNA的任何DNA序列。启动子具有一个转录起始区，它通常邻近编码序列的5＇端，还具有一个TATA盒，这个框通常位于转录起始位点上游25-30个碱基对(bp)处。认为TATA盒指导RNA聚合酶II在正确位点开始RNA合成。哺乳动物启动子还含有一个上游启动子元件，它通常位于TATA盒上游100至200bp内。该上游启动子元件决定了转录启动的速度，并可在两个方向之一上起作用〔Sambrook等人(1989)“克隆基因在哺乳动物细胞中的表达”，Molecular Cloning：ALaboratory Manual，第2版〕。

哺乳动物病毒基因通常是高表达的，具有广泛的宿主范围；因此，编码哺乳动物病毒基因的序列提供了特别有用的启动子序列。例子包括SV40早期启动子、小鼠乳腺肿瘤病毒LTR启动子、腺病毒主要晚期启动子(Ad MLP)以及单纯疱疹病毒启动子。另外，从非病毒基因(如鼠金属硫蛋白基因)衍生的序列也提供了有用的启动子序列。表达可以是组成型的或受调控的(诱导型)，取决于启动子能否在激素反应性细胞中用促糖皮质激素诱导。

增强元件(增强子)的存在，联合上述启动子元件时通常会提高表达水平。增强子是这样一种调控性DNA序列，当它与同源或异源启动子相连，合成在正常的RNA起始位点开始时，它能刺激转录提高1000倍。当增强子位于转录起始位点的上游或下游，处于正常或翻转方向，或距离启动子1000个核苷酸以上的距离时，它均具有活性〔Maniatis等人(1987)Science 236：1237；Alberts等人(1989)《细胞分子生物学》，第2版〕。从病毒衍生的增强子元件可能是特别有用的，因为它们通常具有较宽的宿主范围。例子包括SV40早期基因增强子〔Dijkema等人(1985)EMBO J.4：761〕以及衍生自Rous肉瘤病毒的长末端重复序列(LTR)的增强子/启动子〔Gorman等人(1982b)Proc.Natl.Acad.Sci.79：6777〕以及来自人巨细胞病毒的增强子/启动子〔Boshart等人(1985)Cell 41：521〕。另外，一些增强子仅仅在诱导物(例如激素或金属离子)的存在下是具有活性〔Sassone-Corsi和Borelli(1986)Trends Genet.2：215；Maniatis等人(1987)Science 236：1237〕。

DNA分子可在哺乳动物细胞中胞内表达。启动子序列可以和DNA分子直接相连，在这种情况下，重组蛋白N端的第一个氨基酸始终是甲硫氨酸，它由ATG起始密码子编码。如果需要，可通过和溴化氰体外培育来从蛋白上切下此N端。或者，外来蛋白也可从细胞中分泌到生长培养基中，方法是产生嵌合的DNA分子，该DNA分子编码的融合蛋白包括一前导序列片段，该片段在哺乳动物细胞中提供了外源蛋白的分泌。较佳的是，在前导序列片段和外源基因之间可以有能在体内或体外断裂的加工位点。前导序列片段通常编码一种由疏水性氨基酸组成的信号肽，该信号肽指导蛋白质从细胞中分泌。腺病毒三联前导序列是哺乳动物细胞中分泌外来蛋白的一个前导序列的例子。

通常，哺乳动物细胞识别的转录终止和聚腺苷酸化序列是位于翻译终止密码子3＇的调控区域，因此它和启动子元件一起侧接于编码序列。成熟mRNA的3＇端由定点的转录后断裂和聚腺苷酸化形成〔Bimstiel等人(1985)Cell 41：349；Proudfoot和Whitelaw(1988)＂真核RNA的终端和3＇端加工＂，Transcription and splicing(B.D.Hames和D.M.Glover编)；Proudfoot(1989)Trends Biochem.Sci.14：105〕。这些序列指导mRNA的转录，mRNA能被翻译成该DNA编码的多肽。转录终止子/聚腺苷酸化信号的例子包括从SV40衍生的那些〔Sambrook等人(1989)“克隆基因在培养的哺乳动物细胞中的表达”，Molecular Cloning：A Laboratory Manual〕。

通常，上述组件，包括启动子、聚腺苷酸化信号以及转录终止序列被一起放入表达构建物中。如果需要，表达构建物中还包括增强子、具有功能性剪接供体和受体位点的内含子以及前导序列。构建物的表达通常以复制子形式维持，例如是能在宿主(如哺乳动物细胞或细菌)中稳定维持的染色体外元件(如质粒)。哺乳动物复制系统包括从动物病毒衍生的那些系统，其需要反式作用因子来进行复制。例如，含有乳多空病毒复制系统的质粒，如SV40〔Gluzman(1981)Cell，23：175〕或多瘤病毒，在合适的病毒T抗原的存在下复制出极高的拷贝数。哺乳动物复制子的其它例子包括衍生自牛乳头瘤病毒和EB病毒的复制子。另外，复制子可以有两个复制系统，从而使其能维持在例如哺乳动物细胞中进行表达并能在原核宿主中克隆和扩增。这些哺乳动物细菌穿梭载体的例子包括pMT2〔Kaufman等人(1989)Mol.Cell.Biol.9：946〕和pHEBO〔Shimizu等人(1986)Mol.Cell.Biol.6：1074〕。

所用的转化步骤取决于待转化的宿主。将异源多核苷酸导入哺乳动物细胞中的方法是本领域所知的，其包括葡聚糖介导的转染、磷酸钙沉淀、Polybrene(1，5-二甲基-1，5-二氮十一亚甲基聚甲溴化物)介导的转染、原生质体融合、电穿孔、将多核苷酸包裹在脂质体中以及将DNA直接显微注射到胞核中。

可作为宿主进行表达的哺乳动物细胞系是本领域中已知的，其包括许多从美国典型培养物保藏中心(ATCC)获得的无限增殖的细胞系，包括但不局限于，中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、海拉细胞、乳仓鼠肾(BHK)细胞、猴肾细胞(COS)、人肝细胞癌细胞(如Hep G2)和其它许多细胞系。

ii.杆状病毒系统

也可将编码蛋白质的多核苷酸插入合适的昆虫表达载体中，并与该载体中的控制元件操作性相连。载体构建采用本领域已知的技术。通常，表达系统的组分包括一种转移载体，通常是细菌质粒，它含有杆状病毒基因组片段以及便于插入待表达异源基因的限制性位点；野生型杆状病毒，它的序列与转移载体中的杆状病毒特异性片段同源(这使得异源基因能同源重组到杆状病毒基因组中)；以及合适的昆虫宿主细胞和生长培养基。

将编码蛋白质的DNA序列插入转移载体中后，将载体和野生型病毒基因组转染到昆虫宿主细胞中，使载体和病毒基因组重组。表达包装的重组病毒，鉴定并纯化重组噬斑。杆状病毒/昆虫细胞表达系统材料及其方法，除别的以外，可以试剂盒形式购自Invitrogen，San Diego CA(＂MaxBac＂试剂盒)。这些技术通常是本领域技术人员所知的，在Summers和Smith的Texas Agricultural Experiment StationBulletin No.1555(1987)(后称“Summer和Smith的文章”)中有充分描述。

在将编码蛋白质的DNA序列插入杆状病毒基因组之前，通常将上述组件，包括启动子、前导序列(如果需要)、感兴趣的编码序列以及转录终止序列装配在中间置换型构建物(转移载体)中。该构建物可含有单个基因以及操作性相连的调控元件；多个基因，每个基因有其自己的一套操作性相连调控元件；或是由同一组调控元件调控的多个基因。中间置换型构建物通常保持在一个复制子中，例如能在宿主(如细菌)内稳定保持的染色体外元件(如质粒)。复制子将具有一个复制系统，从而使其能保持在合适的宿主中进行克隆和扩增。

目前，用来将外源基因导入AcNPV的最常用的转移载体是pAc373。还可设计本领域技术人员已知的其它许多载体。这些载体包括如pVL985(其将多角体蛋白的起始密码子从ATG变为ATT，并在ATT下游32个碱基对处引入一个BamHI克隆位点；见Luckow和Summers，Virology(1989)，17：31)。

质粒通常还含有多角体蛋白聚腺苷酸化信号(Miller等人(1988〕Ann.Rev.Microbiol.，42：177)以及用来在大肠杆菌中选择和繁殖的原核氨苄青霉素抗性(amp)基因和复制起点。

杆状病毒转移载体通常含有杆状病毒启动子。杆状病毒启动子是能结合杆状病毒RNA聚合酶并启动编码序列(如结构基因)下游(5＇到3＇)转录成mRNA的任何DNA序列。启动子具有一个转录起始区，该区通常邻近编码序列的5＇端。该转录起始区通常包括一个RNA聚合酶结合位点以及一个转录起始位点。杆状病毒转移载体还可能具有称为增强子的第二区，如果该区域存在，它通常远离结构基因。表达可以是调控型或组成型的。

在病毒感染周期晚期大量转录的结构基因提供了特别有用的启动子序列。例子包括从编码病毒多角体蛋白的基因衍生获得的序列，Friesen等人(1986)“杆状病毒基因表达的调控”，The Molecular Biology of Baculoviruses(Walter Doerfler编辑)；EPO公开号127 839和155 476；以及编码p10蛋白的基因，Vlak等人(1988)，J.Gen.Virol.，69：765。

编码合适的信号序列的DNA可以衍生自分泌的昆虫或杆状病毒蛋白的基因(如杆状病毒多角体蛋白基因)(Carbonell等人，(1988)Gene，73：409)。另外，由于哺乳动物细胞翻译后修饰(如信号肽断裂、蛋白水解断裂和磷酸化)的信号看来可被昆虫细胞识别，且分泌和胞核积累所需的信号看来在无脊椎动物细胞和脊椎动物细胞之间是保守的，因此也可用非昆虫来源的前导序列来提供昆虫中的分泌，这些前导序列例如是从编码人α-干扰素(Maeda等人(1985)，Nature 315：592)、人胃泌素释放的肽(Lebacq-Verheyden等人(l988)，Molec.Cell.Biol.8：3129)、人IL-2(Smith等人(1985)Proc.Nat’l.Acad Sci.USA，82：8404)、小鼠IL-3(Miyajima等人(1987)Gene 58：273)和人葡糖脑苷脂酶(Martin等人(1988)DNA，7：99)的基因衍生获得的。

重组多肽或聚蛋白可以在胞内表达，或如果它是用合适的调控序列表达的，就可被分泌。非融合的外源蛋白良好的胞内表达通常需要理想地具有短前导序列的异源基因在ATG起始信号前有合适的翻译起始信号。如果需要，可通过和溴化氰体外培育，从成熟蛋白上切下N端甲硫氨酸。

另外，通过产生嵌合的DNA分子将非天然分泌的重组聚蛋白或蛋白从昆虫细胞中分泌出来，该嵌合的DNA分子所编码的融合蛋白包含一前导序列片段，该片段提供了从昆虫中分泌外源蛋白的作用。该前导序列片段通常编码一种信号肽，该信号肽包含的疏水性氨基酸引导蛋白质转移到内质网中。

在插入了编码该蛋白表达产物前体的DNA序列和/或基因后，用转移载体的异源DNA和野生型杆状病毒的基因组DNA共同转化(通常是共转染)昆虫细胞宿主。此构建物的启动子和转录终止序列通常包含杆状病毒基因组2-5kb片段。将异源DNA引入杆状病毒中所需位点内的方法是本领域所知的。(见Summers和Smith的文章，同上；Ju等人(1987)；Smith等人，Mol.Cell.Biol.(1983)3：2156；和Luckow和Summers(1989))。例如，插入可以是通过同源双交换重组来插入一个基因如多角体蛋白基因中；插入还可以是插入构建的所需杆状病毒基因内的限制性酶切位点中。Miller等人(1989)，Bioessays 4：91。当DNA序列被克隆在表达载体多角体蛋白基因位置中时，其5＇和3＇均侧接了多角体蛋白特异性序列，并位于多角体蛋白启动子的下游。

随后将新形成的杆状病毒表达载体包装到感染性重组杆状病毒中。发生频率很低(在约1％和5％之间)的同源重组；因此，共转染后产生的大多数病毒仍是野生型病毒。因此，需要用一种方法来鉴别重组病毒。该表达系统的一个优点是肉眼筛选能区分重组病毒。在病毒感染后期，天然病毒产生的多角体蛋白在受其感染细胞的胞核中产生的水平非常高。累积的多角体蛋白形成的包涵体，其还含有包埋颗粒。这些大小至多为15微米的包涵体具有高度的折光性，从而使它们呈现明亮的发光外观，在光学显微镜下很容易观察。感染了重组病毒的细胞缺少包涵体。为了区分重组病毒和野生型病毒，用本领域已知的技术将转染上清接种到单层昆虫细胞上形成噬斑。即，在光学显微镜下筛选存在(表明是野生型病毒)或不存在(表明是重组病毒)包涵体的噬斑。“Current Protocols in Microbiology”，第2卷(Ausubel等人编辑)，16.8(增补10，1990)；Summers和Smith的文章，同上；Miller等人(1989)。

已经开发出感染进入几种昆虫细胞的重组杆状病毒表达载体。例如，已经开发出用于感染以下昆虫细胞的重组杆状病毒：埃及伊蚊(Aedes aegypti)、苜蓿丫纹夜蛾(Autographa californica)、家蚕(Bombyx mori)、黑腹果蝇(Drosophilamelanogaster)、草地夜蛾(Spodoptera frugiperda)和粉纹夜蛾(Trichoplusia ni)(WO89/046699；Carbonell等人(1985)，J.Virol.56：153；Wright(1986)Nature 321：718；Smith等人(1983)Mol.Cell.Biol.3：2156；综述见Fraser等人(1989)In Vitro Cell.Dev.Biol.25：225)。

可以购得细胞和细胞培养基用于在杆状病毒/表达系统中直接表达和融合表达异源多肽；细胞培养技术是本领域技术人员通常所知的。参见Summers和Smith的文章，同上。

然后，经修饰的昆虫细胞可以生长在合适的营养培养基中，该培养基能稳定地保持该质粒于修饰的昆虫宿主中。当表达产物的基因处于可诱导的控制下时，可以使宿主生长至高密度，并诱导表达。另外，当表达是组成型时，产物将被连续表达到培养基中，营养性培养基必需不断循环，取出感兴趣的产物同时补充消耗的营养物。产物可用以下这些技术来纯化：例如层析，如HPLC、亲和层析、离子交换层析等；电泳；密度梯度离心；溶剂抽提等。产物可按需作进一步纯化，以基本上除去所有也分泌到培养基中或由昆虫细胞裂解而产生的昆虫蛋白，以提供一种至少基本上不含宿主碎片如蛋白质、脂质和多糖的产物。

为了获得蛋白质的表达，将从转化子衍生获得的重组宿主细胞培育在允许重组蛋白的编码序列表达的条件下。这些条件将随所选定的宿主细胞而变。然而，本领域技术人员容易根据本领域已知的知识来确定该条件。

iii.植物系统

本领域已知有许多植物细胞培养系统和全植物遗传表达系统。典型的植物细胞基因表达系统包括在以下专利中描述的那些，如：US5,693,506；US5,659,122；和US5,608,143。Zenk，Phytochemistry 30：3861-3863(1991)中描述了在植物细胞培养物中遗传表达的其它例子。除上述参考文献外，关于植物蛋白信号肽的描述还可在下列文献中找到：Vaulcombe等人，Mol.Gen.Genet.209：33-40(1987)；Chandler等人，Plant Molecular Biology 3：407-418(1984)；Rogers，J.Biol.Chem.260：3731-3738(1985)；Rothstein等人，Gene 55：353-356(1987)；Whittier等人，NucleicAcids Research 15：2515-2535(1987)；Wirsel等人，Molecular Microbiology 3：3-14(1989)；Yu等人，Gene 122：247-253(1992)。关于用植物激素、赤霉素酸和赤霉素酸诱导分泌的酶调节植物基因表达的描述可在R.L.Jones和J.MacMillin，Gibberellins，Advanced Plant Physiology，Malcolm B.Wilkins编辑，1984 PitmanPublishing Limited，London，21-52页中找到。描述其它调节代谢的基因的参考文献参见：Sheen，Plant Cell，2：1027-1038(1990)；Maas等人，欧洲分子生物学协会杂志(EMBO J.)9：3447-3452(1990)；Benkel和Hickey，美国科学院院报(Proc.Natl.Acad.Sci.).84：1337-1339(1987)。

通常，利用本领域已知的技术，将所需的多核苷酸序列插入一表达盒中，该表达盒含有为在植物中操作而设计的基因调控元件。将该表达盒插入所需的表达载体中，表达盒的上游和下游有适合在植物宿主中表达的伴随序列。这些伴随序列可来自质粒或病毒，并为载体提供所需的性能，以允许载体将DNA从起初的克隆宿主(如细菌)中移动到所需植物宿主中。基础的细菌/植物载体构建物最好能提供宽的宿主范围原核复制起点；原核可选择的标记；以及，对于农杆菌转化而言，宜提供T DNA序列用于农杆菌介导的转移至植物染色体。当异源基因不易检测时，该构建物最好还具有一个适用于确定植物细胞是否已经转化的可选择标记基因。关于合适标记(例如对于禾草类家族成员)的综述可在Wilmink和Dons，1993，Plant Mol.Biol.Reptr，11(2)：165-185中找到。

还建议采用适合将异源序列整合到植物基因组中的序列。这些序列可能包括用于同源重组的转座子序列以及允许将异源表达盒随机插入植物基因组中的Ti序列。合适的原核可选择标记包括抗生素(如氨苄青霉素或四环素)抗性标记。编码其它功能的其它DNA序列也可存在于载体中，这是本领域所知的。

本发明的核酸分子可包括在一个表达盒中来表达感兴趣的蛋白质。通常只要一个表达盒，但是两个或多个表达盒也是可行的。除了编码异源蛋白的序列外，重组表达盒还含有下列元件：启动子区域、植物5＇非翻译序列、起始密码子(根据结构基因原来是否具有而定)、以及转录和翻译终止序列。表达盒5＇和3＇端的独特限制性酶位点能使表达盒方便地插入预先存在的载体中。

异源编码序列可以用于任何与本发明有关的蛋白。编码感兴趣的蛋白的序列将编码出一个信号肽，该信号肽能适当地加工和转运蛋白质，并且通常缺少可能会导致本发明的所需蛋白与膜结合的序列。由于对于大部分来说，转录起始区将针对发芽期间表达和转运的基因，采用提供转运的信号肽，也可提供转运感兴趣的蛋白质。通过这种方式，感兴趣的蛋白将从表达该蛋白的细胞中转运出来，并能被有效地收获。通常，种子中的分泌是通过糊粉或小盾体上皮层进入种子的胚乳。尽管不需要使蛋白从产生该蛋白的细胞中分泌出来，但是这种分泌有利于重组蛋白的分离和纯化。

由于所需基因产物的最终表达将在真核细胞中进行，因此需要确定克隆的基因部分是否含有作为内含子被宿主剪接体机制加工的序列。如果是这样，需要对“内含子”区进行定点诱变，以防止一部分遗传信息作为错误的内含子密码而丧失，Reed和Maniatis，Cell 41：95-105，1985。

可用微量移液管以机械方式转移重组DNA，将载体直接显微注射到植物细胞中。Crossway，Mol.Gen.Genet，202：179-185。还可用聚乙二醇将遗传物质转移到植物细胞中，Krens等人，Nature，296，72-74，1982。导入核酸片段的另一种方法是用小颗粒进行高速弹道贯穿，在这些小珠或颗粒的基质中或表面上带有核酸，Klein等人，Nature，327，70-73，1987，Knudsen和Muller，1991，Planta，185：330-336提出用颗粒轰击大麦胚乳以产生转基因大麦。还有一种导入方法是使原生质体和其它实体〔微细胞(minicell)、细胞、溶酶体或其它可融合的脂质表面体〕融合，Fraley等人，美国科学院院报(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)，79，1859-1863，1982。

载体也可通过电穿孔导入植物细胞中。(Fromm等人，PNAS 82：5824，1958)。在该技术中，在含有基因构建物的质粒存在下电穿孔植物原生质体。高电场强度的电脉冲使生物膜可逆地被通透，从而允许导入质粒。电穿孔的植物原生质体重新形成细胞壁，分裂并形成植物愈伤组织。

能分离出原生质体并能培育成全再生植物的所有植物，都能用本发明进行转化，从而回收得到含有转基因的全植物。已经知道实际上可以从培育的细胞或组织再生所有的植物，其包括但不局限于，甘蔗、甜菜、棉花、果实和其它树、豆科植物和蔬菜的所有主要种类。合适的植物包括如从草莓属(Fragaria)、莲属(Lotus)、苜蓿属(Medicago)、驴喜豆属(Onobrychis)、三叶草属(Trifolium)、胡芦巴属(Trigonella)、豇豆属(Vigna)、柑橘属(Citrus)、亚麻属(Linum)、牻牛儿属(Geranium)、木薯属(Manihot)、胡萝卜属(Daucus)、拟南芥属(Arabidopsis)、芸苔属(Brassica)、萝卜属(Raphanus)、芥属(Sinapis)、颠茄属(Atropa)、辣椒属(Capsicum)、曼陀罗属(Datura)、莨菪属(Hyoscyamus)、番茄属(Lycopersicon)、烟草属(Nicotiana)、茄属(Solanum)、矮牵牛属(Petunia)、毛地黄属(Digitalis)、马约喇纳属(Majorana)、菊苣属(Cichorium)、向日葵属(Helianthus)、莴苣属(Lactuca)、雀麦属(Bromus)、天门冬属(Asparagus)、金鱼草属(Antirrhinum)、Hererocallis、龙面花属(Nemesia)、天竺葵属(Pelargonium)、黍属(Panicum)、狼尾属(Pennisetum)、毛莨属(Ranunculus)、千里光属(Senecio)、蛾蝶属(Salpiglossis)、黄瓜属(Cucumis)、Browaalia、大豆属(Glycine)、毒麦属(Lolium)、玉米属(Zea)、小麦属(Triticum)、高粱属(Sorghum)和曼陀罗属(Datura)。

再生方式随各种植物而有所不同，但是通常是首先提供含有异源基因拷贝的转化的原生质体悬液。形成愈伤组织，从愈伤组织中诱生出枝条，随后是根。另外，从原生质体悬液可以诱生形成胚。这些胚象天然的胚那样发芽形成植物。培养基通常含有各种氨基酸和激素，如植物生长素和细胞分裂素。尤其是对于玉米和苜蓿属来说，在培养基中加入谷氨酸和脯氨酸也是很有利的。枝条和根通常同时发育。有效的再生取决于培养基、基因型以及培养史。如果控制了这三个变量，那么再生能完全再现和重复。

在一些植物细胞培养系统中，本发明所需的蛋白可能被分泌出来，或者蛋白可从全植物中提取出来。当本发明所需的蛋白被分泌到培养基中后，就可进行收集。或者，可以用机械方式破碎胚以及无胚-半种子或其它植物组织，以释放出分泌到细胞和组织之间的蛋白。将该混合物悬于缓冲液中，以收回可溶性蛋白。然后用常规的蛋白分离和纯化方法纯化重组蛋白。用常规方法调节时间、温度、pH、氧和体积等参数，以优化异源蛋白的表达和回收。

iv.细菌系统

细菌表达技术是本领域已知的。细菌启动子是能结合细菌RNA聚合酶并启动下游(3＇)编码序列(如结构基因)转录成mRNA的DNA序列。启动子具有一个转录起始区，其通常位于编码序列的5＇端附近。该转录起始区通常包括RNA聚合酶结合位点以及一个转录起始位点。细菌启动子可能还有第二个功能区域称为操纵子，它可能与毗邻的RNA合成开始的RNA聚合酶结合位点重叠。该操纵子允许负调节(可诱导)的转录，因为基因阻遏蛋白可能结合操纵子并因而抑制特定基因的转录。在负调节元件(如操纵子)不存在时，可能发生组成型表达。另外，正调节可通过基因激活蛋白结合序列来实现，如果有的话，该结合序列通常邻近RNA聚合酶结合序列的(5＇)。基因激活蛋白的例子是分解代谢物激活剂蛋白(CAP)，它帮助启动大肠杆菌(E.coli)中的lac操纵子的转录〔Raibaud等人(1984)Annu.Rev.Genet.18：173〕。因此，表达的调控可能是正作用或负作用，从而增强或减弱转录。

编码代谢途径中的酶的序列提供了特别有用的启动子序列。例子包括衍生自糖(如半乳糖、乳糖(lac)〔Chang等人(1977)Nature 198：1056〕和麦芽糖)代谢酶的启动子序列。其它例子包括衍生自生物合成酶(如色氨酸(trp))〔Goeddel等人(1980)Nuc.Acids Res.8：4057；Yelverton等人(1981)Nucl.Acids Res.9：731；美国专利4,738,921；EP-A-0036776和EP-A-0121775〕的启动子序列。β-内酰胺酶(bla)启动子系统〔Weissmann(1981)＂干扰素的克隆和其它错误＂《干扰素3》(I.Gresser编辑)〕，λ噬菌体PL〔Shimatake等人(1981)Nature 292：128〕和T5〔美国专利4,689,406〕启动子系统也提供了有用的启动子序列。

另外，非天然存在的合成的启动子也可象细菌启动子一样起作用。例如，一种细菌或噬菌体启动子的转录激活序列可以和另一种细菌或噬菌体启动子的操纵子序列连接在一起，形成合成的杂交启动子〔美国专利4,551,433〕。例如，tac启动子是杂合的trp-lac启动子，它由trp启动子以及受lac阻遏蛋白调节的lac操纵子序列组成〔Amann等人(1983)Gene 25：167；de Boer等人，(1983)Proc.Natl.Acad.Sci.80：21〕。另外，细菌启动子可包括非细菌来源但能结合细菌RNA聚合酶并启动转录的天然存在的启动子。天然存在的非细菌来源的启动子还能和相容的RNA聚合酶偶联在一起，从而在原核细胞中高水平地表达某些基因。噬菌体T7RNA聚合酶/启动子系统就是一种偶联的启动子系统〔Studier等人(1986)J.Mol.Biol.189：113；Tabor等人(1985)Proc.Natl.Acad.Sci.82：1074〕。另外，杂合的启动子还可由噬菌体启动子以及大肠杆菌操纵子区域组成(EP-A-0267 851)。

除了有功能的启动子序列外，有效的核糖体结合位点对于外来基因在原核细胞中的表达也是有用的。在大肠杆菌中，核糖体结合位点称为Shine-Dalgarno(SD)序列，其包括起始密码子(ATG)以及在起始密码子上游3-11个核苷酸处的长度为3-9个核苷酸的序列〔Shine等人(1975)Nature 254：34〕。认为SD序列是通过SD序列和大肠杆菌16S rRNA的3＇端之间碱基配对来促进mRNA与核糖体结合的〔Steitz等人(1979)，“信使RNA中的遗传信号和核苷酸序列”，《生物学调节和发育：基因表达》，R.F.Goldberger编辑〕。为了表达具有弱的核糖体结合位点的原核基因和真核基因〔Sambrook等人(1989)，“克隆基因在大肠杆菌中的表达”，《分子克隆实验手册》〕。

DNA分子可以在胞内表达。启动子序列可以直接与DNA分子相连，在这种情况下，N端的第一个氨基酸始终是甲硫氨酸，其由ATG起始密码子编码。如果需要，可通过和溴化氰体外培育或通过和细菌甲硫氨酸N-端肽酶体内或体外培育，将N端的甲硫氨酸从蛋白质上切下(EP-A-0219237)。

融合蛋白为直接表达提供了另一种方法。通常，将编码内源细菌蛋白或其它稳定的蛋白之N端部分的DNA序列与异源编码序列的5＇端融合。在表达时，该构建物将提供这两个氨基酸序列的融合物。例如，λ噬菌体细胞基因可以和外源基因的5＇端相连并在细菌中表达。所得融合蛋白宜保留一个酶(因子Xa)加工位点，以便将噬菌体蛋白与外源基因切开〔Nagai等人(1984)Nature 309：810〕。融合蛋白也可用lacZ〔Jia等人(1987)Gene 60：197〕，trpE〔Allen等人(1987)J.Biotechnol.5：93；Makoff等人(1989)，J.Gen.Microbiol.135：11〕以及Chey〔EP-A-0324 647〕基因的序列组成。两个氨基酸序列连接处的DNA序列可以编码或不编码一可切割的位点。另一个例子是遍在蛋白融合蛋白。这种融合蛋白由遍在蛋白区域组成，该区域宜保留一个酶(例如遍在蛋白特异性加工蛋白酶)加工位点，以便将外源蛋白和遍在蛋白切开。通过这种方法，可以分离获得天然的外源蛋白〔Miller等人(1989)，Bio/Technology 7：698〕。

另外，还可通过产生嵌合的DNA分子来将外源蛋白分泌出细胞，该嵌合的DNA分子编码的融合蛋白含有一个信号肽序列片段，该序列片段能使细菌中的外源蛋白分泌出来〔美国专利4,336,336〕。信号序列片段通常编码一个信号肽，该信号肽含有疏水性氨基酸，能指引蛋白分泌出细胞。蛋白质被分泌到生长培养基(革兰阳性菌)中或细胞内膜和外膜之间的周质间隙内(革兰阴性菌)。在编码的信号肽片段和外源基因之间宜具有能在体内或体外切割的加工位点。

编码合适信号序列的DNA可以从分泌性细菌蛋白的基因衍生获得，这些基因例如是大肠杆菌外膜蛋白基因(ompA)〔Masui等人(1983)，《基因表达的实验操作》；Ghrayeb等人(1984)EMBO J.3：2437〕以及大肠杆菌碱性磷酸酶信号序列(phoA)〔Oka等人(1985)Proc.Natl.Acad.Sci.82：7212〕。另一个例子是，可采用各种芽孢杆菌菌株的α淀粉酶基因的信号序列将异源蛋白分泌出枯草芽孢杆菌〔Palva等人(1982)，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 79：5582；EP-A-0244042〕。

通常，细菌所识别的转录终止序列是位于翻译终止密码子3＇的调控区，它和启动子一起侧接在编码序列的两侧。这些序列指导mRNA的转录，而mRNA能被翻译成该DNA所编码的多肽。转录终止序列通常包括约50个核苷酸的DNA序列，该序列能形成帮助终止转录的茎环结构。例子包括衍生自具有强启动子的基因(如大肠杆菌中的trp基因以及其它生物合成的基因)的转录终止序列。

上述组件，包括启动子、信号序列(如果需要)、感兴趣的编码序列以及转录终止序列通常一起被放在表达构建物中。表达构建物通常以复制子的形式维持，例如能在宿主(如细菌)中稳定维持的染色体外元件(如质粒)。复制子具有一个复制系统，从而允许其维持在原核宿主中或进行表达或进行克隆和扩增。另外，复制子可以是高拷贝数或低拷贝数的质粒。高拷贝数质粒的拷贝数大致在约5至200之间，通常在约10至150之间。含有高拷贝数质粒的宿主宜含有至少约10个质粒，更佳的含有至少约20个质粒。根据载体以及外源蛋白对宿主的影响，可以选择高拷贝数或低拷贝数的载体。

另外，表达构建物可以和一个整合载体一起整合入细菌基因组中。整合载体通常含有至少一个序列与细菌染色体同源，从而允许该载体整合。整合看来是载体和细菌染色体中的同源DNA之间重组的结果。例如，用不同芽孢杆菌菌株的DNA构建的整合载体整合到芽孢杆菌染色体中(EP-A-0127328)。整合载体还可包含噬菌体或转座子序列。

通常，染色体外构建物以及整合的表达构建物可含有可选择的标记，以便选择已经转化的菌株。可选择标记可在细菌宿主中表达，其包括赋予细菌对药物(如氨苄青霉素、氯霉素、红霉素、卡那霉素(新霉素)和四环素)抗性的基因〔Davies等人(1978)Annu.Rev.Microbiol.32：469〕。可选择标记还可包括生物合成性基因，如在组氨酸、色氨酸以及亮氨酸生物合成途径中的那些基因。

另外，上述某些组件可以一起放在转化载体中。转化载体通常包含一个可选择标记，如上所述，该载体以复制子形式维持或发展成一个整合载体。

已经开发出了用于转化到许多细菌中的表达和转化载体(无论是染色体外复制子还是整合载体)。例如，已经开发出了用于下列细菌的表达载体：枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)〔Palva等人，(1982)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 79：5582；EP-A-0036259和063953；WO84/04541〕，大肠杆菌(Escherichia coli)〔Shimatake等人，(1981)Nature 292：128；Amann等人，(1985)Gene 40：183；Studier等人，(1986)J.Mol.Biol.189：113；EP-A-0036776、136829和136907〕，乳脂链球菌(Streptococcus cremoris)〔Powell等人，(1988)Appl.Environ.Microbiol.54：655〕；浅青紫链球菌(Streptococcus lividans)〔Powell等人，(1988)Appl.Environ.Microbiol.54：655〕，浅青紫链霉菌(Streptomyces lividans)〔美国专利4,745,056〕。

将外源DNA导入细菌宿主的方法是本领域熟知的，通常包括用氯化钙或其它试剂(如二价阳离子和二甲亚砜)处理对细菌进行转化。DNA还可通过电穿孔方法导入细菌细胞。转化程序通常因待转化的细菌种类而不同。〔例如参见，例如使用杆菌：Masson等人，(1989)FEMSMicrobiol.Lett.60：273；Palva等人，(1982)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 79：5582；EP-A-0036259和063953；WO84/04541；使用弯曲杆菌：Miller等人，(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.85：856；和Wang等人，(1990)J.Bacteriol.172：949；使用埃希氏大肠杆菌：Cohen等人，(1973)Proc.Natl.Acad.Sci.69：2110；Dower等人，(1988)NucleicAcids Res.16：6127；Kushner (1978)＂用ColE1-衍生质粒转化大肠杆菌的改进方法＂Genetic Engineering：Proceedings ofthe International Symposium on Genetic Engineering(H.W.Boyer和S.Nicosia编辑)；Mandel等人，(1970)J.Mol.Biol.53：159；Taketo(1988)Biochim.Biophys.Acta949：318；使用乳酸杆菌：Chassy等人，(1987)FEMSMicrobiol.Lett.44：173；使用假单胞菌：Fiedler等人，(1988)Anal.Biochem170：38；使用葡萄球菌：Augustin等人，(1990)FEMS Microbiol.Lett.66：203；使用链球菌：Barany等人，(1980)J.Bacteriol.144：698；Harlander(1987)＂用电穿孔转化链球菌产乳酸微生物＂Streptococcal Genetics(J.Ferretti和R.Curtiss III编辑)；Perry等人，(1981)Infect.Immun.32：1295；Powell等人，(1988)Appl.Environ.Microbiol.54：655；Somkuti等人，(1987)Proc.4th Evr.Cong.Biotechnology 1：412〕。

v酵母表达

酵母表达系统也是本领域技术人员所知的。酵母启动子是能结合酵母RNA聚合酶并启动下游(3＇)编码序列(如结构基因)转录成mRNA的DNA序列。启动子具有一个转录起始区，它通常位于编码序列的5＇端附近。该转录起始区通常包括RNA聚合酶结合位点(＂TATA盒＂)以及一个转录起始位点。酵母启动子可能还有第二个功能区域称为上游激活序列(UAS)，如果存在的话，它通常远离结构基因。UAS允许调节(可诱导)的表达。在UAS不存在时，发生组成型表达。表达的调控可能是正作用或负作用的，从而增强或减弱转录。

酵母是一种发酵生物体，具有活泼的代谢途径，因此编码代谢途径中的酶的序列提供了特别有用的启动子序列。例子包括醇脱氢酶(ADH)(EP-A-0284044)、烯醇酶、葡萄糖激酶、葡萄糖-6-磷酸异构酶、甘油醛-3-磷酸-脱氢酶(GAP或GAPDH)、己糖激酶、磷酸果糖激酶、3-磷酸甘油酸变位酶、以及丙酮酸激酶(PyK)(EP-A-0329203)。编码酸性磷酸酶的酵母PHO5基因也提供了有用的启动子序列〔Myanohara等人(1983) Proc.Natl.Acad.Sci.USA 80：1〕。

另外，非天然存在的合成的启动子也可象酵母启动子一样起作用。例如，一种酵母启动子的UAS序列可以和另一种酵母启动子的转录激活区连接在一起，形成合成的杂合启动子。这种杂合启动子的例子包括与GAP转录激活区相连的ADH调控序列(美国专利No.4,876,197和4,880,734)。杂合启动子的其它例子包括由ADH2、GAL4、GAL10或PHO5基因的调控序列组成的启动子与糖酵解酶基因如GAP或PyK的转录激活区的组合(EP-A-0164556)。另外，酵母启动子可包括非酵母来源但能结合酵母RNA聚合酶并启动转录的天然存在的启动子。这些启动子的例子包括，尤其是，〔Cohen等人，(1980)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77：1078；Henikoff等人，(1981)Nature 283：835；Hollenberg等人，(1981)Curr.TopicsMicrobiol.Immunol.96：119；Hollenberg等人，(1979)＂细菌抗生素抗性基因在酿酒酵母中的表达＂，Plasmids of Medical，Environmental and Commercial Importance(K.N.Timmis和A.Puhler编辑)；Mercerau-Puigalon等人，(1980)Gene 11：163；Panthier等人，(1980)Curr.Genet.2：109〕。

DNA分子可以在酵母菌胞内表达。启动子序列可以直接与DNA分子相连，在这种情况下，重组蛋白N端的第一个氨基酸始终是甲硫氨酸，其由ATG起始密码子编码。如果需要，可通过和溴化氰体外培育将N端的甲硫氨酸从蛋白质上切下。

象在哺乳动物、杆状病毒以及细菌表达系统中一样，融合蛋白为酵母表达系统提供了另一种方法。通常，将编码内源酵母蛋白或其它稳定的蛋白之N端部分的DNA序列与异源编码序列的5＇端融合。在表达时，该构建物将提供这两个氨基酸序列的融合物。例如，酵母或人超氧化物歧化酶(SOD)基因可以和外源基因5＇端相连并在酵母中表达。两个氨基酸序列连接处的DNA序列可以编码或不编码可切割的位点。例如参见EP-A-0196056。另一个例子是遍在蛋白融合蛋白。这种融合蛋白由遍在蛋白区域组成，该区域宜保留一个酶(例如遍在蛋白特异性加工蛋白酶)加工位点，以便将外源蛋白和遍在蛋白切开。因此，通过这种方法，可以分离获得天然的外源蛋白(例如WO88/024066)。

另外，还可通过产生嵌合的DNA分子来将外源蛋白从细胞分泌到生长培养基中，该嵌合的DNA分子编码的融合蛋白含有一个前导序列片段，该前导序列片段能使酵母中的外源蛋白分泌出来。较佳的是，在编码的前导片段和外来基因之间宜具有能在体内或体外切割的加工位点。该前导序列片段通常编码了含有疏水性氨基酸的信号肽，其引导蛋白从细胞分泌出来。

编码合适信号序列的DNA可以从分泌性酵母蛋白的基因衍生获得，这些基因例如有酵母转化酶基因(EP-A-0012873；JPO 62：096，086)以及A-因子基因(美国专利4,588,684)。另外，非酵母来源的前导序列(如干扰素前导序列)的存在也能提供分泌出酵母的作用(EP-A-0060057)。

较佳的一类分泌前导序列采用了酵母α-因子基因的片段，其含有＂pre＂信号序列和＂pro＂区。可采用的α因子片段的类型包括全长pre-pro α因子前导序列(约83个氨基酸残基)以及截短的α-因子前导序列(通常约25至50个氨基酸残基)(美国专利4,546,083和4,870,008；EP-A-0324274)。采用α-因子前导片段提供分泌作用的其它前导序列包括杂合的α-因子前导序列，其由第一个酵母的pre序列以及第二个酵母α因子的pro区域组成(例如见WO89/02463)。

通常，酵母识别的转录终止序列是位于翻译终止密码子3＇的调控区，其和启动子一起侧接在编码序列的两侧。这些序列指导mRNA的转录，而mRNA能被翻译成该DNA所编码的多肽。转录终止序列和其它酵母识别的终止序列的例子是编码糖酵解酶的那些转录终止序列。

上述组件，包括启动子、前导序列(如果需要时)、感兴趣的编码序列以及转录终止序列，通常被一起放在表达构建物中。表达构建物通常以复制子的形式保持，例如能在宿主(如酵母或细菌)中稳定保持的染色体外元件(如质粒)。复制子可能具有两个复制系统，从而允许其能维持在例如酵母中进行表达，并能维持在原核宿主进行克隆和扩增。这些酵母-细菌穿梭载体的例子包括YEp24〔Botstein等人(1979)Gene 8：17-24〕，pCL/1〔Brake等人，(1984)Proc.Natl.Acad.Sci.USA81：4642-4646〕和YRp17〔Stinchcomb等人(1982)J.Mol.Biol.158：157〕。另外，复制子可以是高拷贝数或低拷贝数的质粒。高拷贝数质粒的拷贝数大致在约5至200之间，通常在约10至150之间。含有高拷贝数质粒的宿主宜含有至少约10个质粒，更佳的含有至少约20个质粒。根据载体以及外源蛋白对宿主的影响，可以选择高拷贝数或低拷贝数的载体。例如参见Brake等人，同上。

另外，表达构建物可以和一个整合载体一起整合入酵母基因组中。整合载体通常含有至少一个序列与酵母染色体同源，从而允许该载体整合，最好含有两个同源序列侧接该表达构建物。整合看来是载体和酵母染色体中同源DNA之间重组的结果〔Orr-Weaver等人(1983)，Methods in Enzymol.101：228-245〕。通过选择合适的同源序列插入载体中，可将整合载体导入酵母中某一特定的基因座。见Orr-Weaver等人，同上。可以整合入一个或多个表达构建物，这可能会影响重组蛋白产生的水平(Rine等人(1983)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 80：6750〕。载体中的染色体序列可以载体中的单个片段形式存在(从而导致整个载体的整合)，或是与染色体中的相邻片段同源的两个片段，这两个片段在载体中侧接在表达构建物两侧，从而可导致仅表达构建物的稳定性整合。

通常，染色体外构建物以及整合的表达可建物均含有可选择的标记，以便选择已经转化的酵母菌株。可选择标记可包括能在酵母宿主中表达的生物合成基因(如ADE2、HIS4、LEU2、TRP1和ALG7以及G418抗性基因)，这些基因分别赋予酵母细胞对衣霉素以及G418的抗性。另外，合适的可选择标记还可能为酵母在毒性化合物(如金属)存在下提供生长能力。例如，CUP1的存在使酵母能在铜离子存在下生长〔Butt等人，(1987) Microbiol.Rev.51：351〕。

另外，上述某些组件可以一起放在转化载体中。转化载体通常包含一个可选择标记，如上所述，该载体以复制子形式维持或发展成一个整合载体。

已经开发出了用于转化入许多酵母中的表达和转化载体(无论是染色体外复制子还是整合载体)。例如，已经开发出用于下列酵母菌的表达载体：白色念珠菌(Candida albicans)〔Kurtz，等人，(1986)Mol.Cell.Biol.6：142〕，麦芽糖念珠菌(Candida maltosa)〔Kunze，等人，(1985)J.Basic Microbiol.25：141〕，多形汉逊酵母(Hansenula polymorpa)〔Gleeson，等人，(1986)J.Gen.Microbiol.132：3459；Roggenkamp等人，(1986)Mol.Gen.Genet.202：302〕，脆壁克鲁维酵母(Kluyveromyces fragilis)〔Das，等人，(1984)J.Bacteriol.158：1165〕，乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis)〔De Louvencourt等人，(1983)J.Bacteriol.154：737；Vanden Berg等人，(1990)Bio/Technology 8：135〕，季也蒙毕赤酵母(Pichia guillerimondii)〔Kunze等人，(1985)J.BasicMicrobiol.25：141〕，巴斯德毕赤酵母(pichiapastoris)〔Cregg，等人，(1985)Mol.Cell. Biol.5：3376；美国专利No.4,837,148和4,929,555〕，酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)〔Hinnen等人，(1978)Proc.Natl.Acad.Sci.USA75：1929；Ito等人，(1983)J.Bacteriol.153：163〕，栗酒裂植酵母(Schizosaccharomycespombe)〔Beach和Nurse(1981)Nature 300：706〕，以及Yarrowia lipolytica〔Davidow，等人，(1985)Curr.Genet.10：380471 Gaillardin，等人，(1985)Curr.Genet.10：49〕。

将外源DNA导入酵母宿主的方法是本领域熟知的，通常包括用碱阳离子处理转化原生质球或完整酵母细胞。转化程序通常因待转化的酵母种类而不同。例如参见，〔Kurtz等人，(1986)Mol.Cell.Biol.6：142；Kunze等人，(1985)J.BasicMicrobiol.25：141；念珠菌〕；〔Gleeson等人，(1986)J.Gen.Microbiol.132：3459；Roggenkamp等人，(1986)Mol.Gen.Genet.202：302；汉逊酵母〕；〔Das等人，(1984)J.Bacteriol.158：1165；De Louvencourt等人，(1983)J.Bacteriol.154：1165；Van denBerg等人，(1990)Bio/Technology8：135；克鲁维酵母〕；〔Cregg等人，(1985)Mol.Cell.Biol.5：3376；Kunze等人，(1985)J.Basic Microbiol.25：141；美国专利No.4,837,148和4,929,555；毕赤酵母〕；〔Hinnen等人，(1978)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 75；1929；Ito等人，(1983)J.Bacteriol.153：163酿酒酵母〕；〔Beach和Nurse(1981)Nature 300：706；裂殖酵母〕；〔Davidow等人，(1985)Curr.Genet.10：39；Gaillardin等人，(1985)Curr.Genet.10：49；Yarrowia〕。

抗体

本文所用的术语“抗体”指由至少一个抗体结合位点组成的一个或一组多肽。“抗体结合位点”是一个三维结合空间，其内表面形状和电荷分布与抗原表位的特征互补，从而使抗体与抗原结合。“抗体”例如包括，脊椎动物抗体、杂合抗体、嵌合抗体、人源化抗体、经修饰的抗体、单价抗体、Fab蛋白以及单结构域抗体。

针对本发明蛋白的抗体可用于亲和层析、免疫试验以及区别/鉴定奈瑟球菌蛋白。

针对本发明蛋白的多克隆和单克隆抗体可用常规方法制得。通常，首先用蛋白来免疫合适的动物，较佳的是小鼠、大鼠、家兔或山羊。由于可获得的血清体积多，能获得标记的抗家兔和抗山羊抗体，因此对于制备多克隆抗血清来说，家兔和山羊是较佳的。免疫通常这样进行：将蛋白以盐水(较佳的以佐剂如弗氏完全佐剂)混合或乳化，然后肠胃外(通常是皮下或肌内)注射该混合物或乳剂。每次注射50-200微克的剂量就足够了。2-6周后用盐水(较佳的是用弗氏不完全佐剂)配的蛋白质注射一次或多次以强化免疫。另外可以用本领域已知的方法进行体外免疫来产生抗体，从本发明的目的来看，认为其与体内免疫等效。将免疫后的动物血液抽取到玻璃或塑料容器中，25℃培育该血液1小时，然后4℃培育2-18小时，获得多克隆抗血清。离心(例如1000g 10分钟)回收血清。家兔每次取血可获得约20-50毫升。

用Kohler和Milstein的标准方法〔Nature(1975)256：495-96〕或其改进方法制得单克隆抗体。通常，如上所述对小鼠或大鼠免疫。然而，并非是对动物取血然后抽提血清，而是取出脾脏(以及任选地取出几个大的淋巴结)，将其分散成单细胞。如果需要，可将细胞悬液(在除去非特异性粘附的细胞后)加入包被了蛋白质抗原的板或孔中，对脾细胞进行筛选。表达抗原特异性的膜结合免疫球蛋白的B细胞结合到板上，不象悬液其它物质那样被洗去。然后对所得B细胞或所有解离的脾细胞进行诱导，使其与骨髓瘤细胞融合形成杂交瘤，培养在选择性培养基(如次黄嘌呤、氨基蝶呤、胸苷培养基，“HAT”)中。通过有限稀释接种所得杂交瘤，并测定特异性结合免疫抗原(且不结合无关抗原)的抗体的产生。然后，体外(例如在组织培养瓶或中空纤维反应器中)或体内(如小鼠腹水中)培养所选的分泌单克隆抗体的杂交瘤。

如果需要，抗体(无论是多克隆还是单克隆抗体)可用常规技术来标记。合适的标记包括荧光团、发色团、放射活性原子(尤其是³²P和¹²⁵I)、密电子试剂、酶、以及具有特异性结合配偶的配体。酶通常靠其活性来检测。例如，辣根过氧化物酶通常是检测其将3，3＇，5，5＇-四甲基联苯胺(TMB)转变成蓝色的能力，可用分光光度计定量测定。“特异性结合配偶”指能以高特异性结合配体分子的蛋白质，例如抗原以及对其有特异性的单克隆抗体。其它特异性结合配偶包括生物素和亲和素或链亲和素，IgG和蛋白A，以及本领域已知的许多受体-配体对。应理解，上述内容并非要将各种标记分成不同的类，因为同一标记可在几种不同的模型中起作用。例如，¹²⁵I可作为放射活性标记，或作为密电子试剂。HRP可作为酶或单抗的抗原。另外，一种物质可以和各种标记组合以获得所需的效果。例如，在实施本发明中，单抗和亲和素也需要标记，因此，可以用生物素标记单抗，并用标记了¹²⁵I的亲和素检测其存在，或用标记HRP的抗生物素单抗检测其存在。其它替换和可能性对于本领域普通技术人员来说是显而易见的，所以应认作属于本发明范围内的等价物。

药物组合物

药物组合物可包含本发明的多肽、抗体或核酸。该药物组合物将包含治疗有效量的本发明的多肽、抗体或多核苷酸。

本文所用的术语“治疗有效量”指治疗剂治疗、缓解或预防目标疾病或状况的量，或是表现出可检测的治疗或预防效果的量。该效果例如可通过化学标记或抗原水平来检测。治疗效果也包括生理性症状的减轻，例如导致体温降低。对于某一对象的精确有效量取决于该对象的体型和健康状况、病症的性质和程度、以及选择给予的治疗剂和/或治疗剂的组合。因此，预先指定准确的有效量是没用的。然而，对于某给定的症状而言，可以用常规实验来确定该有效量，临床医师是能够判断出来的。

为了本发明的目的，有效的剂量为给予个体约0.01毫克/千克至50毫克/千克或0.05毫克/千克至10毫克/千克的DNA构建物。

药物组合物还可含有药学上可接受的载体。术语“药学上可接受的载体”指用于治疗剂(例如抗体、多肽、基因或其它治疗剂)给药的载体。该术语指这样一些药剂载体：它们本身不诱导产生对接受该组合物的个体有害的抗体，且给药后没有过分的毒性。合适的载体可能是大的、代谢缓慢的大分子，如蛋白质、多糖、聚乳酸(polylactic acid)、聚乙醇酸、氨基酸聚合物、氨基酸共聚物以及无活性的病毒颗粒。这些载体是本领域普通技术人员所熟知的。

本文可用的药学上可接受的盐例如有：无机酸盐，如盐酸盐、氢溴酸盐、磷酸盐、硫酸盐等；以及有机酸盐，如乙酸盐、丙酸盐、丙二酸盐、苯甲酸盐等。在Remington＇s Pharmaceutical Sciences(Mack Pub.Co.，N.J.1991)中可找到关于药学上可接受的赋形剂的充分讨论。治疗性组合物中药学上可接受的载体可含有液体，如水、盐水、甘油和乙醇。另外，这些载体中还可能存在辅助性的物质，如润湿剂或乳化剂、pH缓冲物质等。通常，可将治疗性组合物制成可注射剂，例如液体溶液或悬浮液；还可制成在注射前适合配入溶液或悬液中、液体载体的固体形式。脂质体也包括在药学上可接受的载体的定义中。

给药方法

一旦配成本发明的组合物，可将其直接给予对象。待治疗的对象可以是动物；尤其可以治疗人对象。

直接输送该组合物通常可通过皮下、腹膜内、静脉内或肌内注射或输送至组织间隙来实现。组合物也可输送至病灶区。其它给药方式包括口服和肺给药、栓剂和透皮或经皮肤施用(参见例如WO98/20734)、用针、基因枪或手持无针注射器(hypospray)。治疗剂量方案可以是单剂份方案或多剂份方案。

疫苗

疫苗包含免疫性抗原、免疫原、多肽、蛋白或核酸，通常与“药学上可接受的载体”组合，这些载体包括本身不诱导产生对接受该组合物的个体有害的抗体的任何载体。合适的载体通常是大的、代谢缓慢的大分子，如蛋白质、多糖、聚乳酸、聚乙醇酸、氨基酸聚合物、氨基酸共聚物、脂质凝集物(如油滴或脂质体)以及无活性的病毒颗粒。这些载体是本领域普通技术人员所熟知的。另外，这些载体可起免疫刺激剂(“佐剂”)作用。另外，抗原或免疫原可以和细菌类毒素(如白喉、破伤风、霍乱、幽门螺杆菌等病原体的类毒素)偶联。

增强组合物效果的较佳的佐剂包括但不局限于：(1)铝盐(alum)，如氢氧化铝、磷酸铝、硫酸铝等；(2)水包油型乳剂配方(有或没有其它特异性的免疫刺激剂，如胞壁酰肽(见下文)或细菌细胞壁成分)，例如，(a)MF59^TM(WO90/14837；第10章“疫苗设计：亚基和佐剂方法”，Powell和Newman编，Plenum Press，1995)，其含有5％鲨烯、0.5％吐温80和0.5％Span85(任选地含有不同量的MTP-PE(见下文)，虽然并不需要)，用微量流化器(如110Y型微量流化器(Microfluidics，Newton，MA))制成亚微米级颗粒；(b)SAF，其含有10％鲨烯、0.4％吐温80、5％普卢兰尼克(pluronic)嵌段聚合物L121以及thr-MDP(见下文)，微量流化成亚微米级乳剂或涡流振荡产生粒径较大的乳剂，和(c)Ribi^TM佐剂系统(RAS)(Ribi Immunochem，Hamilton，MT)，其含有2％鲨烯、0.2％吐温80以及选自单磷酰脂A(MPL)、二霉菌酸海藻糖酯(TDM)、和细胞壁骨架(CWS)的一种或多种细菌细胞壁组分，较佳的是MPL+CWS(Detox^TM)；(3)皂素佐剂，例如可采用Stimulon^TM(Cambridge Bioscience，Worcester，MA)或从其产生的颗粒，如ISCOM(免疫刺激性复合物)；(4)弗氏完全佐剂(CFA)和弗氏不完全佐剂(IFA)；(5)细胞因子，如白介素(如IL-1、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-12等)、干扰素(如γ干扰素)、巨噬细胞集落刺激因子(M-CFS)、肿瘤坏死因子(TNF)等；以及(6)作为免疫刺激剂来增强组合物效果的其它物质。Alum和MF59^TM是较佳的。

如上所述，胞壁酰肽包括但不局限于，N-乙酰-胞壁酰-L-苏氨酰-D-异谷氨酰胺(thr-MDP)、N-乙酰-去甲基胞壁酰-L-丙氨酰-D-异谷氨酰胺(nor-MDP)、N-乙酰胞壁酰-L-丙氨酰-D-异谷氨酰氨酰基-L-丙氨酸-2-(1＇-2＇-二棕榈酰-sn-甘油-3-羟基磷酰氧)-乙胺(MTP-PE)等。

免疫原性组合物(如用于免疫的抗原/免疫原/多肽/蛋白/核酸，药学上可接受的载体以及佐剂)，通常含有稀释剂，如水，盐水，甘油，乙醇等。另外，辅助性物质，如润湿剂或乳化剂、pH缓冲物质等可存在于这类运载体中。

通常，可将免疫原性组合物制成可注射剂，例如液体溶液或悬液；还可制成在注射前适合配入溶液或悬液、液体赋形剂的固体形式。该制剂还可乳化或包封在脂质体中，在上述药学上可接受的载体下增强佐剂效果。

用作疫苗的免疫原性组合物，包含免疫学有效量的抗原性或免疫原性多肽以及上述其它所需的组分。“免疫学有效量”指以单剂或连续剂一部分给予个体的量对治疗或预防是有效的。该用量根据所治疗个体的健康状况和生理状况、所治疗个体的类别(如非人灵长类、灵长类等)、个体免疫系统合成抗体的能力、所需的保护程度、疫苗的配制、治疗医师对医疗状况的评估、及其它的相关因素而定。预计该用量将在相对较宽的范围内，可通过常规实验来确定。

常规方法是从肠胃外途径通过注射给予免疫原性组合物，例如皮下、肌内或皮下/透皮给药(例如WO98/20734)。适合其它给药方式的其它配方包括口服和肺制剂、栓剂和透皮施药。治疗剂量可以是单剂份方案或多剂份方案。疫苗可以结合其它免疫调节剂一起给予。

作为以蛋白质为基础的疫苗的一种替代方案是，可以采用DNA疫苗接种〔例如，Robinson和Torres(1997)Seminars in Immunology 9：271-283；Donnelly等人(1997)Annu Rev.Immunol 15：617-648；见下文〕。

基因传送工具

可局部或全身向哺乳动物给予用于传送含有本发明治疗剂的编码序列的构建物的基因治疗工具，以使其在该哺乳动物中表达。这些构建物可利用体内或体外形式的病毒或非病毒载体方法。可使用内源哺乳动物启动子或异源启动子诱导这种编码序列的表达。该编码序列的体内表达可以是组成型的或调节型的。

本发明包括能表达预期的核酸序列的基因传送工具。该基因传送工具较佳是病毒载体，更佳是逆转录病毒、腺病毒、腺伴随病毒(AAV)、疱疹病毒或甲病毒载体。病毒载体还可以是星状病毒、冠状病毒、正粘病毒、乳多空病毒、副粘病毒、细小病毒、细小核糖核酸病毒、痘病毒或者披膜病毒载体。通常可参见Jolly(1994)，Cancer Gene Therapy，1：51-64；Kimura(1994)，Human Gene Therapy，5：845-852；Connelly(1995)，Human Gene Therapy，6：185-193；和Kaplitt1994)，Nature Genetics，6：148-153。

逆转录病毒载体在本领域中是周知的，我们认为任何逆转录基因治疗载体都可用在本发明中，包括B、C和D型逆转录病毒、异嗜性逆转录病毒〔例如，NZB-X1、NZB-X2和NZB9-1(参见O＇Neill(1985)，J.Viro1.，53：160)〕、多嗜性逆转录病毒如MCF和MCF-MLV〔参见Kelly(1983)，J.Virol.，45：291〕、泡沫病毒和慢病毒。参见RNA Tumor Viruses，第二版，Cold Spring Harbor Laboratory，1985。

可从不同的逆转录病毒获得逆转录病毒基因治疗载体的各个部分。例如，可从鼠肉瘤病毒获得逆转录病毒载体的LTR、从劳氏肉瘤病毒获得tRNA结合位点、从鼠白血病毒获得包装信号、从鸟类白血病毒得到第二条链的合成来源。

通过将这些重组的逆转录病毒载体导入适当的包装细胞系中，可使它们产生转导竞争性逆转录病毒载体粒子(参见美国专利第5,591,624号)。通过将嵌合型整合酶结合到该逆转录病毒粒子中，可构建可以位点特异性整合到宿主细胞DNA中的逆转录病毒载体(参见WO96/37626)。较佳的是，该重组病毒载体是复制缺陷性重组病毒。

适合用于上述逆转录病毒载体的包装细胞系在本领域中是周知的，并且易于制备(参见WO95/30763和WO92/05266)，并且，这些细胞系可用于产生用于生产重组载体粒子的生产性细胞系(也称为载体细胞系或“VCL”)。较佳的是，这些包装细胞系由人的亲本细胞(如HT1080细胞)或水貂的亲本细胞系(在人血清中可恢复活性)制得。

用于构建逆转录病毒基因治疗载体的较佳逆转录病毒包括鸟类白血病毒、牛白血病毒、鼠类白血病毒、水貂细胞病灶诱导性病毒、鼠类肉瘤病毒、网状内皮组织增殖病毒和劳氏肉瘤病毒。特别优选的鼠类白血病毒包括4070A和1504A〔Hartley和Rowe(1976)，J Virol，19：19-25〕、Abelson(ATCC第VR-999号)、Friend(ATCC第VR-245号)、Graffi、Gross(ATCC第VR-590号)、Kirsten、Harvey肉瘤病毒和Rauscher(ATCC第VR-998号)和莫洛尼鼠类白血病毒(ATCC第VR-190号)。可从收藏处或保藏所如在马里兰Rockville的美国典型培养物保藏所(“ATCC”)获得这些逆转录病毒，或者使用通常可获得的技术从已知的来源中分离得到。

可用在本发明中的已知逆转录病毒基因治疗载体的例子包括那些在下述专利申请中描述的载体：GB2200651、EP0415731、EP0345242、EP0334301、WO89/02468、WO89/05349、WO89/0927l、WO90/02806、WO90/07936、WO94/03622、WO93/25698、WO93/25234、WO93/11230、WO93/10218、WO91/02805、WO91/02825、WO95/07994、US5,219,740、US4,405,712、US4,861,719、US4,980,289、US4,777,127、US5,591,624。还可参见Vile(1993)，CancerRes，53：3860-3864；Vile(1993)，CancerRes，53：962-967；Ram(1993)，CancerRes 53(1993)，83-88；Takamiya(1992)，J Neurosci Res，33：493-503；Baba(1993)，J Neurosurg，79：729-735；Mann(1983)，Cell，33：153；Cane(1984)，Proc Natl AcadSci，81：6349；和Miller(1990)，Human Gene Therapy 1。

人的腺病毒基因治疗载体在本领域中也是已知的，并可用在本发明中。例如可参见Berkner(1988)，Biotechniques，6：616和Rosenfeld(1991)，Science，252：431；和WO93/07283、WO93/06223和WO 93/07282。可用在本发明的已知的腺病毒基因治疗载体的例子包括上述文献所述的载体以及下述文献中描述的载体：WO94/12649、WO93/03769、WO93/19191、WO94/28938、WO95/11984、WO95/00655、WO95/27071、WO95/29993、WO95/34671、WO96/05320、WO94/08026、WO94/11506、WO93/06223、WO94/24299、WO95/14102、WO95/24297、WO95/02697、WO94/28152、WO94/24299、WO95/09241、WO95/25807、WO95/05835、WO94/18922和WO95/09654。或者，可使用Curiel(1992)，Hum.Gene Ther.，3：147-154所述给予连接于被杀死的腺病毒的DNA。本发明的基因传送工具还可包括腺伴随病毒(AAV)载体。用于本发明的这些载体的主要和较佳的例子是Srivastava的WO93/09239中公开的以AAV-2为基础的载体。大多数较佳的AAV载体含有这两个AAV反向末端重复单元，在该单元中，天然的D-序列经核苷酸的取代而被修饰，这样至少5个天然核苷酸到18个天然核苷酸、较佳至少10个到18个、最佳10个天然核苷酸被保留，该D-序列的其余核苷酸则被删除或被非天然核苷酸取代。这些AAV反向末端重复单元的天然D-序列是在各AAV反向末端重复单元(即每端各有一条序列)有20个连续的核苷酸的序列，这些序列不参与HP的形成。非天然取代核苷酸可以是除了在天然D-序列的相同位置上发现的核苷酸以外的任何核苷酸。其它可使用的AAV载体的例子是pWP-19、pWN-1，这两个载体已在Nahreini(1993)，Gene，124：257-262中公开。这种AAV载体的另一例子是psub201〔参见Samulski(1987)，J.Virol.，61：3096〕。AAV载体的另一例子是Double-D ITR载体。Double-D ITR载体的构建已在美国专利第5,478,745中公开。还有其它的例子在Carter的美国专利第4,797,368号和Muzyczka的美国专利第5,139,941号、Chartejee的美国专利第5,474,935号和Kotin的WO94/288157中公开。可用在本发明中的AAV载体又一例子是SSV9AFABTKneo，它含有AFP增强子和清蛋白启动子，它主要在肝中指导表达。它的结构和构造在Su(1996)，Human Gene Therapy，7：463-470中公开。另外一些AAV基因治疗载体已在US5,354,678、US5,173,414、US5,139,941和US5,252,479中公开。

本发明的基因治疗载体还包括疱疹载体。主要的和较佳的例子是含有编码胸苷激酶多肽的序列的单纯疱疹病毒载体，如US5,288,641和EP0176170(Roizman)中公开的那些载体。单纯疱疹病毒载体的另外的例子包括WO95/04139(WistarInstitute)中公开的HFEM/ICP6-LacZ、Geller(1998，Science，241：1667-1669)和WO99/0944 1以及WO92/07945中描述的pHSVlac、Fink(1992，Human GeneTherapy，3：11-19)描述的HSV：：pgC-lacZ和EP0453242(Breakefield)中所述的HSV7134、2 RH 105和GAL4，以及那些保藏在ATCC中登记号为ATCC VR-977和ATCC VR-260的载体。

还考虑的是甲病毒基因治疗载体，这种载体也可用在本发明中。较佳的甲病毒载体是新培斯病毒载体。披膜病毒、Semliki Forest病毒(ATCC VR-67、ATCCVR-1247)、Middleberg病毒(ATCC VR-370)、Rose River病毒(ATCC VR-373、ATCCVR-1246)、委内瑞拉马脑炎病毒(ATCC VR923；ATCC VR-1250、ATCC VR-1249、ATCC VR-532)和在美国专利第5,091,309号、第5,217,879号和WO92/10578中描述的那些载体。更具体而言，在美国系列号08/405627(1995年3月15日提交)、WO94/21792、WO92/10578、WO95/07994、US5,091,309和US5,217,879中所述的那些甲病毒载体也可在本发明中使用。可从如马里兰Rockville的ATCC中获得这类甲病毒，或者使用常规可获得的技术从已知的来源中分离获得。较佳是使用减弱的细胞毒性的甲病毒载体(参见USSN08/679640)。

还将DNA载体系统(如真核生物分层表达系统)用于本发明的核酸的表达。参见WO95/07994，该文有关于真核生物分层表达系统的详细描述。较佳的是，本发明的真核生物分层表达系统从甲病毒载体中获得，最佳是从新培斯病毒载体获得。

适合用于本发明的其它病毒载体包括，从脊髓灰质炎病毒获得的那些载体(例如ATCC VR-58)；和Evans〔Nature，339(1989)，385〕和Sabin(1973，J.Biol.Standardization，1：115)描述的那些载体；鼻病毒，如ATCC VR-1110和Amold(1990，J Cell Biochem，L401)描述的那些；痘病毒，如金丝雀痘病毒或牛痘病毒，例如ATCC VR-111和ATCC VR-2010和Fisher-Hoch(1989，Proc Natl Acad Sci，86：317)、Flexner(1989，Ann NY Acad Sci，569：86)、Flexner(1990，Vaccine，8：17)、US4,603,112和US4,769,330以及WO89/01973中所述的那些载体；SV40病毒，例如，ATCC VR-305和那些在Mulligan(1979，Nature，277：108)和Madzak(1992，J Gen Virol，73：1533)所述的载体；流感病毒，例如ATCC VR-797和使用如US5,166,057和Enami(1990，Proc Natl Acad Sci，87：3802-3805)、Enami和Palese(1991，J Virol，65：2711-2713)和Luytjes〔1989，Cell，59：110，还可参见McMichael(1983)，NEJ Med，309：13和Yap(1978)，Nature，273：238和Nature(1979)，277：108〕中所述的反向遗传学技术制得的重组流感病毒；EP-0386882和Buchschacher(1992，J.Vrol.，66：2731)中所述的人免疫缺陷病毒；麻疹病毒，如ATCC VR-67和VR-1247和EP-0440219中所述；Aura病毒，例如ATCC VR-368；Bebaru病毒，例如，ATCC VR-600和ATCC VR-1240；Cabassou病毒，例如ATCCVR-922；Chikungunya病毒，例如ATCC VR-64和ATCC VR-1241；Fort Morgan病毒，例如ATCC VR-924；Getah病毒，例如ATCC VR-369和ATCC VR-1243；Kyzylagach病毒，例如ATCC VR-927；Mayaro病毒，例如ATCC VR-66；Mucambo病毒，例如ATCC VR-580和ATCC VR-1244；Ndumu病毒，例如ATCC VR-371；Pixuna病毒，例如ATCC VR-372和ATCC VR-1245；Tonate病毒，例如ATCCVR-925；Triniti病毒，例如ATCC VR-469；Una病毒，例如ATCC VR-374；Whataroa病毒，例如ATCC VR-926；Y-62-33病毒，例如ATCC VR-375；O＇Nyong病毒、东部脑炎病毒，例如ATCC VR-65和ATCC VR-1242；西部脑炎病毒，例如ATCCVR-70、ATCC VR-1251、ATCC VR-622和ATCC VR-1252；和冠状病毒，例如ATCC VR-740和Hamre(1966，Proc Soc Exp Biol Med，121：190)中所述。

并不限于使用上述载体将本发明的组合物传送到细胞中。可使用其它的传送方法和介质，如核酸表达载体、仅连接或未连接被杀死的腺病毒的多阳离子浓缩的DNA〔例如参见美国系列号08/366,787(1994年12月30日提交)和Curiel(1992)，Hum Gene Ther，3：147-154〕、配体连接的DNA〔例如参见Wu(1989)，J Biol Chem，264：16985-16987〕、原核生物细胞传送工具细胞〔如参见美国系列号08/240,030(1994年5月8日提交)和美国系列号08/404,796〕、如美国专利第5,149,655号所述的使光聚合的水凝胶物质沉积和手控基因转移粒子枪、如US5,206,152和WO92/11033中所述的电离辐射、核电荷中和或与细胞膜的融合。其它的方法在Philip(1994)，Mol CellBiol，14：2411-2418和Woffendin(1994)，Proc NatlAcad Sci，91：1581-1585中有所描述。

可使用粒子介导的基因转移，如可参见美国系列号60/023,867。简言之，可将该序列插入含有用于高水平表达的常规控制序列的常规载体中，然后使其与合成的基因转移分子(如聚合的DNA结合阳离子，如聚赖氨酸、鱼精蛋白和清蛋白)，使其连接于细胞靶向配体，如Wu和Wu(1987，J.Biol.Chem.，262：4429-4432)所述的脱唾液酸血清类粘蛋白、Hucked(1990，Biochem Pharmacol，40：253-263)所述的胰岛素、Plank(1992，Bioconjugate Chem，3：533-539)所述的半乳糖、乳糖或运铁蛋白。

也可使用裸DNA。导入裸DNA的方法的例子在WO90/11092和US5,580,859中有所描述。使用生物可降解的胶乳珠可改进摄取的效率。包涂在胶乳珠上的DNA在这些珠启动的胞吞作用后可有效地被输送到细胞中。通过对这些珠进行处理，使它们的疏水性增加，从而促进内涵体的破坏并将DNA释放到细胞质中，这样可进一步改进此方法。

在US5,422,120、WO95/13796、WO94/23697、WO91/14445和EP-524,968中描述了可用作基因传送工具的脂质体。如USSN60/023,867中所述，对于非病毒传送，可将编码多肽的核酸序列插入含有用于高水平表达的常规控制序列的常规载体中，然后使其与合成的基因转移分子培育，如聚合的DNA结合阳离子(如聚赖氨酸、鱼精蛋白和清蛋白)，使其连接于细胞靶向配体，如脱唾液酸血清类粘蛋白、胰岛素、半乳糖、乳糖或运铁蛋白。其它的传送系统包括使用脂质体包被含有在各种组织特异性或普遍存在的活跃的启动子控制之下的基因的DNA。适合使用的非病毒传送系统还包括机械传送系统，如Woffendin等人〔1994，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，91(24)：11581-11585〕所述的方法。此外，可通过光聚合水凝胶物质的沉积作用传送该编码序列或其表达产物。可用于传送编码序列的基因传送的其它常规方法包括，如使用手控基因转移粒子枪(如US5149,655所述)、使用电离辐射以激活转移的基因(如US5,206,152和WO/9211033所述)。

示范性的脂质体和多阳离子基因传送工具是下述文献中描述的那些：US5,422,120和4,762,915，WO95/13796，WO94/23697和WO91/14445，EP-0524968，Stryer〔Biochemistry，第236-240页(1975)〕，W.H.Freeman，洛杉矶；Szoka〔(1980)，Biochem Biophys Acta，600：1〕，Bayer〔(1979)，Biochem Biophys Acta，550：464；Rivnay〔(1987)，Meth Enzymol，149：119〕；Wang〔(1987)，Proc Natl Acad Sci，84：7851〕；Plant〔(1989)，AnalBiochem，176：420〕。

多核苷酸组合物可含有治疗有效量(定义如上)的基因治疗工具。对于本发明的目的，有效的剂量是每个给药个体约0.01mg/kg到50mg/kg或者约0.05mg/kg到约10mg/kg的DNA构建物。

传送方法

一旦配制成药剂，本发明的多核苷酸组合物就可以下述方式给予：(1)直接给予；(2)离体传送给从受试对象获得的细胞；或者(3)体外用于重组蛋白质的表达。要治疗的对象可以是哺乳动物或鸟类。也可治疗人。

通常通过皮下、腹膜内、静脉或肌肉内注射或者传送到组织间隙中，以实现这些组合物的传送。也可将这些组合物施加到病灶中。给药的其它模式包括口服和肺部给药、栓剂和经皮或皮下使用(如参见WO98/20734)、使用针头和基因枪或无针注射器给药。剂量治疗可以是单剂份方案或多剂份方案。

离体传送然后将转化的细胞再移植到受试对象体中的方法在本领域中是已知的，在如WO93/14778中有所描述。用于离体用途的细胞的例子包括，例如干细胞，尤其是造血干细胞、淋巴细胞、巨噬细胞、树突状细胞或者肿瘤细胞。

通常，通过下述方法可实现用于离体和体外用途的核酸的传送，例如，葡聚糖介导的转染作用、磷酸钙沉淀作用、1，5-二甲基-1，5-二氮十一亚甲基聚甲溴化物介导的转染作用、原生质体融合作用、电穿孔作用、将多核苷酸包被在脂质体中和将DNA直接显微注射到细胞核中，这些方法在本领域中都是已知的。

多核苷酸和多肽药物组合物

除了上述的药学上可接受的载体和盐外，多核苷酸和多肽组合物中还可采用下列附加试剂。

A.多肽

一个例子是多肽，其包括但不局限于：脱唾液酸血清类粘蛋白(ASOR)；运铁蛋白；脱唾液酸糖蛋白；抗体；抗体片段；铁蛋白；白介素；干扰素；粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)；粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)、干细胞因子和促红细胞生成素。还可使用病毒抗原，如包膜蛋白。另外，可用来自其它侵袭性生物的蛋白，例如疟原虫恶性疟疾的环孢子蛋白的17个氨基酸的肽(称为RII)。

B.激素，维生素等

其它可包括的种类例如是：激素、类固醇、雄激素、雌激素、甲状腺激素或维生素、叶酸。

C.聚亚烷基、多糖等

另外，聚(亚烷基)二醇可以和所需的多核苷酸或多肽组合在一起。在一个较佳的实施方案中，聚(亚烷基)二醇是聚乙二醇。另外，可以加入单糖、二糖或多糖。在此方面的一个较佳实施方案中，多糖是葡聚糖或DEAE-葡聚糖。另外有脱乙酰壳多糖和聚(丙交酯-共-乙交酯)。

D.脂质和脂质体

所需的多核苷酸或多肽还可在输送给对象或对象衍生的细胞之前包裹在脂质中或包裹在脂质体中。

脂质包裹通常用能稳定结合或捕获并保留核酸的脂质体来实现。浓缩的多核苷酸与脂质制剂之比可以不同，但是通常在约1∶1(毫克DNA∶微摩尔脂质)之间，或脂质更多。关于脂质体作为输送核酸的载体的综述参见Hug和Sleight(1991)Biochim.Biophys.Acta.1097：1-17；Straubinger(1983)Meth.Enzymol.101：512-527。

用于本发明的脂质体制剂包括阳离子(带正电荷)、阴离子(带负电荷)和中性制剂。阳离子脂质体已经显示出能以有功能的形式介导质粒DNA的胞内输送(Felgner(1987)，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84：7413-7416)；mRNA(Malone(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA86：6077-6081)；和纯化的转录因子的胞内输送(Debs(1990)J.Biol.Chem.265：10189-10192)。

阳离子脂质体很容易购得。例如，N〔1-2，3-二油烯基氧)丙基〕-N，N，N-三乙铵(DOTMA)脂质体可以以Lipofectin的商标从GIBCO BRL，Grand Island，NY购得。(另见Felgner，同上)。其它商品脂质体包括transfectace(DDAB/DOPE)和DOTAP/DOPE(Boerhinger)。其它阳离子脂质体可用本领域熟知的方法从易购得的材料制得。例如参见，Szoka(1978)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 75：4194-4198；WO90/11092关于DOTAP(1，2-二(油酰基氧)-3-(三甲基铵溶)丙烷〕脂质体合成的描述。

同样，阴离子和中性脂质体也是容易获得的，例如购自Avanti PolarLipids(birmingham，AL)，或容易用易购得的材料制得。这种材料包括磷脂酰胆碱、胆固醇、磷脂酰乙醇胺、二油酰基磷脂酰胆碱(DOPC)、二油酰基磷脂酰甘油(DOPG)、二油酰基磷脂酰乙醇胺(DOPE)。这些材料还能以合适比例与DOTMA和DOTAP原料混合。用这些材料制备脂质体的方法是本领域熟知的。

脂质体可包含多层脂质体(MLV)，小的单层脂质体(SUV)、或大的单层脂质体(LUV)。各种脂质体-核酸复合物可用本领域已知的方法制得。例如参见Straubinger(1983)Meth.Immunol.101：512-527；Szoka(1978)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 75：4194-4198；Papahadjopoulos(1975)Biochim.Biophys.Acta 394：483；Wilson(1979)Cell 17：77)；Deamer和Bangham(1976)Biochim.Biophys.Acta 443：629；Ostro(1977)Biochem.Biophys.Res.Commun.76：836；Fraley(1979)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 76：3348)；Enoch和Strittmatter(1979)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 76：145；Fraley(1980)J.Biol.Chem.(1980)255：10431；Szoka和Papahadjopoulos(1978)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 75：145；以及Schaefer-Ridder(1982)Science 215：166。

E.脂蛋白

另外，脂蛋白也可加入待输送的多核苷酸或多肽中。采用的脂蛋白的例子包括：乳糜微粒、HDL、IDL、LDL和VLDL。还可采用这些蛋白的突变体、片段或融合蛋白。另外，可采用天然存在的脂蛋白的修饰物，例如乙酰化的LDL。这些脂蛋白能使多核苷酸的输送指向表达脂蛋白受体的细胞。较佳的是，如果待输送的多核苷酸中加入了脂蛋白，则组合物中不加入其它寻靶的配体。

天然存在的脂蛋白包含脂质和蛋白部分。蛋白部分称为脱辅基蛋白。目前，已经分离并鉴定出了脱辅基蛋白A、B、C、D和E。其中至少有两个含有几种蛋白，用罗马数字AI、AII、AIV；CI、CII、CIII命名。

脂蛋白可包含多个脱辅基蛋白。例如，天然存在的乳糜微粒包含A、B、C和E，随着时间的推移，这些脂蛋白失去A，得到C和E脱辅基蛋白。VLDL包含A、B、C、和E脱辅基蛋白，LDL包含脱辅基蛋白B；HDL包含脱辅基蛋白A、C和E。

这些脱辅基蛋白的氨基酸是已知的，并且在下列文献中有所描述：Breslow(1985)Annu Rev.Biochem 54：699；Law(1986)Adv.Exp Med.Biol.151：162；Chen(1986)J Biol Chem 261：12918；Kane(1980)Proc Natl Acad Sci USA 77：2465；andUtermann(1984)Hum Genet 65：232。

脂蛋白含有各种脂质，包括甘油三酯、胆固醇(游离的和酯型)以及磷脂。天然存在的脂蛋白中脂质的组成是不同的。例如，乳糜微粒主要含甘油三酯。关于天然存在的脂蛋白的脂质含量更详细的描述可在例如Meth.Enzymol.128(1986)中找到。选择脂质的组成，以使脱辅基蛋白的构型有利于受体结合活性。还可选择脂质的组成，以促进与多核苷酸结合分子中的疏水性相互作用和结合。

天然存在的脂蛋白可以用诸如超离心方法从血清中分离出来。这些方法在Meth.Enzymol.(同上)；Pitas(1980)J.BioChem.255：5454-5460以及Mahey(1979)JClin.Invest 64：743-750中有所描述。脂蛋白还可在体外产生，或通过在所需宿主细胞中表达脱辅基蛋白基因的重组方法产生。例如参见Atkinson(1986)Annu RevBiophys Chem 15：403和Radding(1958)Biochim Biophys Acta 30：443。脂蛋白也可购自商业供应商，如Biomedical Techniologies，Inc.，Stoughton，Massachusetts，USA。关于脂蛋白的进一步描述可在Zuckermann等人的WO98/06437中找到。

F.聚阳离子试剂

聚阳离子试剂可以与或不与脂蛋白一起包括在含所需待输送多核苷酸/多肽的组合物中。

聚阳离子试剂通常在生理性相关的pH下表现出净的正电荷，并能中和核酸的电荷，而有助于输送至所需位置。这些试剂具有体外、活体外和体内的用途。聚阳离子试剂可用来将核酸通过肌内或皮下等输送至活的对象。

下面是用作聚阳离子试剂的多肽例子：聚赖氨酸、聚精氨酸、聚鸟氨酸和鱼精蛋白。其它例子包括组蛋白、鱼精蛋白、人血清白蛋白、DNA结合蛋白、非组蛋白染色体蛋白、DNA病毒的外壳蛋白，如(X174，转录因子还含有结合DNA的结构域，因此可用作核酸凝聚剂。简言之，转录因子如C/CEBP、c-jun、c-fos、AP-1、AP-2、AP-3、CPF、Prot-1、Sp-1、Oct-1、Oct-2、CREP、和TFIID含有结合DNA序列的基本结构域。聚阳离子有机试剂包括：精胺、亚精胺和腐胺。

从上面的清单可以推出聚阳离子试剂的尺寸和物理性能，以构建其它多肽聚阳离子试剂或产生合成的聚阳离子试剂。有用的合成聚阳离子试剂例如包括，DEAE-葡聚糖、Polybrene。Lipofectin^TM和lipofectAMINE^TM是与多核苷酸/多肽组合时形成聚阳离子复合物的单体。

免疫诊断检测

本发明的奈瑟球菌抗原可用在免疫测定中，以检测抗体水平(或者相反地，可使用抗奈瑟球菌抗体检测抗原的水平)。可发展以明确的重组抗原为基础的免疫测定，以替换侵入性诊断方法。可检测针对生物样品(包括血液和血清样品)中奈瑟球菌蛋白质的抗体。免疫测定的设计变化极大，其中多数是本领域已知的。免疫测定的方案可以如竞争性试验、或直接反应或者夹心式试验为基础。这些方案也可使用如固相支持物，或者通过免疫沉淀进行。大多数的测定涉及使用标记的抗体或多肽；这些标记物可以是如荧光素、化学发光物质、放射性物质或染料分子。由探针放大信号的试验也是已知的；这类试验的例子是使用生物素和抗生物素蛋白的测定以及酶标记和介导的免疫测定(如ELISA)。

通过使适当的材料(包括本发明的组合物)与进行试验所需的剩余的试剂以及材料(如适当的缓冲液、盐溶液等)包装在合适的容器中，构建适合用于免疫诊断并含有适当的标记试剂的试剂盒，同时提供适当的测定说明。

核酸杂交

“杂交”指两个核酸序列相互之间通过氢键而结合。通常，一个序列固定于固体载体，另一个将游离于溶液内。然后，在有利于形成氢键的条件下使两个序列相互接触。影响这种结合的因素包括：溶剂的类型和体积；反应温度；杂交时间；搅拌；封闭液相序列与固体载体非特异性结合的试剂(Denhardt＇s试剂或BLOTTO)；各序列的浓度；是否使用化合物来增加序列结合的速度(硫酸葡聚糖或聚乙二醇)；以及杂交后洗涤条件的严谨程度。见Sambrook等人〔同上〕第2卷，第9章，9.47至9.57页。

“严谨性”指有利于非常相似的序列结合而不利于不同序列结合的杂交反应条件。例如，应选择温度和盐浓度的组合，使温度比所研究的杂交的Tm计算值低大约120至200℃。温度和盐浓度常可通过初步实验中凭经验来确定，在初步实验中，固定在滤膜上的基因组DNA样品与感兴趣的序列杂交，然后在不同的严谨度条件下洗涤。见Sambrook等人第9.50页。

在进行例如Southern印迹时，要考虑的参数是(1)待印迹的DNA的复杂性以及(2)探针与受检测序列之间的同源性。对于高度复杂的真核基因组中的单拷贝基因，待研究片段的总量可以在10的一个数量级范围内变化，质粒为0.1至1微克，或将噬菌体消化至10^-9至10^-8克。对于复杂性较低的多核苷酸，可以采用实际上更短的印迹、杂交以及接触时间，更少量的起始多核苷酸，以及比活更低的探针。例如，从1微克酵母DNA开始，用仅仅1小时的接触时间，印迹2小时，然后和10⁸cpm/μg的探针杂交4-8小时，就可以检测单拷贝酵母基因。对于单拷贝哺乳动物基因而言，一种保守的方法是从10微克DNA开始，印迹过夜，在10％硫酸葡聚糖存在下用10⁸cpm/μg以上的探针杂交过夜，导致接触时间约为24小时。

有几个因素可能会影响探针与感兴趣片段之间的DNA-DNA杂交物的解链温度(Tm)，因而影响杂交和洗涤的合适条件。在许多情况下，探针并非与待测片段100％同源。其它常常遇到的变量包括杂交序列的长度和G+C总含量，以及杂交缓冲液的离子强度和甲酰胺含量。所有这些因素的作用可近似表示成一个方程式：

Tm＝81+16.6(log₁₀Ci)+0.4〔％(G+C)〕-0.6(％甲酰胺)-600/n-1.5(％错配)式中Ci是盐浓度(单价离子)，n是杂交物碱基对的长度(对Meinkoth和Wahl(1984)Anal.Biochem.138：267-284的方法稍作了修改)。

在设计杂交实验时，影响核酸杂交的一些因素可以方便地予以改变。杂交和洗涤时的温度以及洗涤时的盐浓度的调节最为简单。随着杂交温度(即严谨度)的升高，不同源的链之间发生杂交的可能性变得更少，结果背景值降低。如果放射性标记的探针并非与固定的片段完全同源(这在基因家族和种间杂交实验中是常见的)，则必须降低杂交温度，而背景值将会增加。洗涤温度以类似的方式影响杂交带的强度和背景值的程度。洗涤的严谨性也随盐浓度的降低而升高。

通常，在50％甲酰胺存在下的方便的杂交温度是：对于靶片段同源性达95％至100％的探针而言，是42℃；对于同源性为90％至95％的探针，为37℃；对于同源性为85％和90％的探针，为32℃。对于较低的同源性，应用上述方程式应相应地降低甲酰胺含量和调节温度。如果探针和靶片段之间的同源性是未知的，则最简单的方法是从非严谨的杂交和洗涤条件开始。如果在放射自显影后发现了非特异性的条带或高背景值，则可在高严谨性下洗涤滤膜，并重新曝光。如果曝光所需时间使得该方法不切实际，则应平行测试几种杂交和/或洗涤严谨性。

脑膜炎球菌80-85kDa蛋白质的鉴定

已发现从脑膜炎奈瑟球菌血清群B制备的多种外膜小泡制剂含有约80-85kDa的成分。用SDS-PAGE凝胶纯化该蛋白质并进行N-端测序(SEQ ID 1)。

制备的抗SDS-PAGE纯化蛋白的抗体与50种以上的不同血清群和血清型的脑膜炎奈瑟球菌菌株中的当量蛋白质相互反应。还观察到与淋病奈瑟球菌、多糖奈瑟球菌(N.polysaccharia)和乳糖奈瑟球菌(N.lactamica)的交叉反应。接受过疫苗的患者的血清也与该蛋白质反应。

从血清群B脑膜炎奈瑟球菌克隆了完整的基因(SEQ ID 2)，并推断其编码的蛋白质(SEQ ID 3)。通过与上述N-端测序相比较，推断出信号肽(SEQ ID 4)和成熟序列(SEQ ID 5)。

脑膜炎奈瑟球菌血清群A和淋病奈瑟球菌中相应基因的鉴定

在血清群B脑膜炎奈瑟球菌序列的基础上，克隆和测序了脑膜炎奈瑟球菌血清群A和淋病奈瑟球菌的相应序列(称为‘ORF21’)。

SEQ ID 6列出了血清群A脑膜炎奈瑟球菌的完整基因，SEQ ID 7列出了其所编码的蛋白质。SEQ ID 8和9是信号肽和成熟序列。

SEQ ID 10列出了淋病奈瑟球菌的完整序列，SEQ ID 11列出了其编码的蛋白质。SEQ ID 12和13为信号肽和成熟序列。

序列的比较

将这些蛋白质序列进行比较，发现它们是高度同源的。

脑膜炎奈瑟球菌血清群B序列和淋病奈瑟球菌序列显示在797aa重叠的片段中有95.4％相同。

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                790orf21.pep    KPEDEIQRFQFQLGTTF

         |||||||||||||||||orf21nG.pep  KPEDEIQRFQFQLGTTFX

           780       790脑膜炎奈瑟球菌A血清群和B血清群在797个氨基酸重叠序列中显示出99.9％的同一性：

                 10        20        30        40        50        60orf21.pep    MKLKQIASALMMLGISPLALADFTIQDIRVEGLQRTEPSTVFNYLPVKVGDTYNDTHGSA

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                130       140       150       160       170       180

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                310       320       330       340       350       360

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                490       500       510       520       530       540

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                730       740       750       760       770       780

                790orf21.pep    KPEDEIQRFQFQLGTTF

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                790

高度的保守说明，单一的蛋白质可能会针对各种奈瑟球菌种类诱导免疫应答。

疫苗

使上述鉴别的三种蛋白质表达，然后将它们用于免疫接种。观察到针对这些蛋白质的良好的免疫应答。

组合疫苗

此外，使这些蛋白质各自与针对其它病原生物体(如针对脑膜炎C血清群的Chiron多糖疫苗)的抗原混合，并用于免疫接种。观察到良好的免疫应答。

另外的NmB组分

虽然这种挪威OMV疫苗是有效的，但是它产生的保护作用受到制备它的菌株的限制。使用这种疫苗对青少年进行的临床试验的结果显示，在29个月后仅获得57.2％的有效率，虽然观察到几乎100％的患者有IgG应答〔如Rosenqvist等人(1995)，Infect.Immun.，63：4642-4652〕。

令人意外的是，已发现将另外确定的组分加到该挪威OMV疫苗中的做法明显扩大了该疫苗的有效率。

挪威疫苗并没有产生针对NmB 2996菌株的保护作用。将从2996菌株获得的确定的蛋白质加到该挪威疫苗中，结果显示该疫苗的药学以令人惊讶的程度增加。而且，加入NmC多糖连接抗原〔如Costantino等人(1992)，Vaccine，10：691-698〕获得优异的结果。

下表给出这些组合物的杀菌活性：

^*使用3种不同的NmB抗原：

#1：ORF1——如WO99/24578(还可参见WO99/55873)的实施例77

#2：＇287＇蛋白——如WO99/57280的图21(还可参见SEQ ID 3103-3108)

#3：#1、#2和＇919＇蛋白在Al(OH)₃中的混合物(本文的SEQ ID 14，还可参见WO99/57280的图23和该文献中的SEQ ID 3069-3074)

可易于看出，通过加入从2996菌株获得的确定的抗原，可克服该挪威OMV疫苗抗2996菌株的无效问题(组1)。使用NmB蛋白＇287＇的结果特别好。由此可改善该挪威疫苗，而不需由各种不同菌株制备OMV。

这种疫苗还提供了针对异源MenB菌株的保护作用。测试使用2996菌株蛋白质制得的相同的疫苗抗5种其它菌株的情况。滴度如下：

^*对照：2996菌株、BZ133株和1000株＝由同源菌株制得的OMV；

BZ232株＝由2996菌株制得的OMV；MC56和NGH38＝SEAM3。

另一研究使用从NmB2996菌株获得的蛋白质添加到“挪威”OMV中：

——919蛋白，在大肠杆菌中表达，没有任何融合配偶体

——ORF1，在大肠杆菌中表达为His标记的融合蛋白

——287蛋白，在大肠杆菌中表达为GST融合蛋白

——这3种蛋白质的混合物，任选含有NmC偶联物

使用Al(OH)₃作为这些制品的佐剂，进行杀菌测试，测试它们抗同源菌株的能力。结果如下：

^*该抗体抑菌而非杀菌。

使用抗原287进行的进一步的工作

进一步研究挪威OMV与抗原287的组合物。将20μg的287抗原和挪威OMP疫苗(15μg OMP+Al(OH)₃〕混合，用所得混合物对小鼠进行免疫。在杀菌测试中测试抗体，结果发现它能有效抗所有测试的菌株。结果如下：

因此，几乎在大多数例子中，OMV+287蛋白的组合令人惊讶地产生比单独的OMV要好的结果。

重组的OMV

转化大肠杆菌，使其表达ORF1、ORF40和ORF46。由重组的大肠杆菌制得的OMV能诱导针对脑膜炎奈瑟球菌的杀菌性抗体。

ORF1、ORF40和ORF46(2996菌株)在大肠杆菌中表达为His标记的融合蛋白质，并以纯蛋白质的形式或者OMV的形式制得它们。使用2996菌株作为攻击源测试针对这两种制品的杀菌滴度：

还测量了使用异源攻击菌株的杀菌滴度。纯化的ORF46抗MC58株的滴度是4096，其OMV形式抗MC58的滴度升高到32000。纯化的ORF1抗NmA F6124株的滴度是128，其OMV形式抗此菌株的滴度升高到512。纯化的ORF40抗MC58株的滴度是512，其OMV形式是这个滴度的两倍。

这些数据显示，当在大肠杆菌中将NmB抗原制成OMV形式时，它们保留了免疫原性，而且该免疫原性实际上被提高。

可以理解，本申请仅通过实施例的方式描述本发明，在不偏离本发明的范围和精神的情况下可对本发明进行修改。

                                    序列表

                                    序列表<110>启龙股份公司(CHIRON SpA)<120>含有脑膜炎奈瑟球菌B血清群外膜蛋白质的外膜囊(OMV)疫苗<130>P023785WO<141>2001-01-17<150>GB-0001067.8<151>2000-01-17<150>GB-0005699.4<151>2000-03-09<160>14<170>SeqWin99，version1.02<210>1<211>15<212>PRT<213>脑膜炎奈瑟球菌(Neisseria meningitidis)<400>1Asp Phe Thr Ile Gln Asp Ile Arg Val Glu Gly Leu Gln Arg Thr1               5                   10                  15<210>2<211>2394<212>DNA<213>脑膜炎奈瑟球菌(Neisseria meningitidis)<400>2atgaaactga aacagattgc ttccgcactg atgatgttgg gcatatcgcc tttggcactt   60gccgacttca ccatccaaga catccgcgtc gaaggcttgc agcgtaccga gccgagtacc   120gtattcaact acctgcccgt caaagtcggc gacacctaca acgacacaca cggcagtgcc   180atcatcaaaa gcctgtacgc caccggtttc tttgacgacg tacgcgtcga aactgcggac   240gggcagctcc tgctgaccgt tatcgaacgc cccaccatcg gctcgctcaa catcaccggc   300gcaaaaatgc tgcaaaacga cgccattaag aaaaacctcg aatcgttcgg gctggcgcag   360tcgcaatact ttaatcaggc gacactcaat caggcagtcg ccggcctgaa agaagaatac   420ctcgggcgcg gcaaactcaa tatccaaatc acgcccaaag taaccaaact cgcccgcaac   480cgcgtcgaca tcgacatcac gattgacgag ggcaaatccg ccaaaatcac cgacatcgaa   540tttgaaggca accaagtcta ttccgaccgc aaactgatgc ggcaaatgtc cctgaccgaa   600ggcggcattt ggacatggct gacacgaagc aaccaattca acgagcagaa atttgcccaa   660gatatggaaa aagtaaccga cttctaccaa aataacggct acttcgattt ccgtatcctc   720gataccgaca tccaaaccaa cgaagacaaa accaagcaga ccatcaaaat caccgtccac   780gaaggcggac gtttccgttg gggcaaagtc tccatcgaag gcgacaccaa cgaagtcccc   840aaagccgaac tggaaaaact gctgaccatg aagcccggca aatggtacga acgccagcag   900atgaccgccg ttttgggtga gattcagaac cgcatgggct cggcaggcta cgcatacagc   960gaaatcagcg tacagccgct gccgaacgct gaaaccaaaa ccgtcgattt cgtcctgcac   1020atcgaaccgg gccggaaaat ctacgtcaac gaaatacaca tcaccggcaa caacaaaacc   1080cgcgacgaag tcgtccgccg tgaattacgc caaatggaat ccgcacctta cgacacctcc   1140aagctgcaac gttccaaaga gcgcgtcgag cttttgggct acttcgacaa tgtccagttt   1200gatgctgtcc cgcttgccgg cacgcccgac aaagtcgatt tgaacatgag tctgaccgaa   1260cgttccaccg gttccctgga tttgagcgcg ggttgggttc aagataccgg gttggtcatg   1320tccgcaggcg tttcccaaga caacctgttc ggtacgggca agtcggccgc actgcgcgcc   1380tccaggagca aaaccacgct taacggctcg ctgtcgttta ctgacccgta cttcacggca   1440gacggggtca gcctgggcta cgatgtttac ggaaaagcct tcgacccgcg caaagcatcg   1500accagcatca aacaatataa aaccaccacg gcaggcgcag gcatccgcat gagcgtgcct   1560gttaccgaat acgaccgcgt gaatttcggt ttggtggcag aacacctgac cgtcaacacc   1620tacaacaaag cgcccaaaca ctatgccgac tttatcaaga aatacggcaa aaccgacggc   1680acagacggca gcttcaaagg ctggctgtac aaaggtaccg tcggctgggg gcgcaacaaa   1740accgacagcg cgttatggcc gacgcgcggc tacctgacgg gcgtgaacgc cgaaatcgcc   1800ctgcctggca gcaaactgca atactactcc gccacccaca accaaacctg gttcttcccc   1860ctgagcaaaa ccttcacgct gatgctcggc ggcgaagtcg gcattgcggg cggctacggc   1920agaaccaaag aaatcccctt ctttgaaaac ttctacggcg gcggcctggg ttcggtgcgc   1980ggatacgaaa gcggcacgct cggtccgaaa gtctatgacg aatacggcga aaaaatcagc   2040tacggcggca acaaaaaagc caacgtctcc gccgagctgc tcttcccgat gcccggcgcg   2100aaagacgcgc gcaccgtccg cctgagcctg tttgccgacg caggcagcgt gtgggacggc   2160aaaacctacg acgacaacag cagttccgcg accggcggca gggttcaaaa catttacggc   2220gccggcaata cccataaatc cacctttacc aacgaattgc gctattccgc cggcggcgcg   2280gttacctggc tctcgccttt aggcccgatg aaattcagct acgcctaccc gctgaagaaa   2340aaaccggaag acgaaatcca acgcttccaa ttccaactcg gcacgacgtt ctaa         2394<210>3<211>797<212>PRT<213>脑膜炎奈瑟球菌(Neisseria meningitidis)<400>3Met Lys Leu Lys Gln Ile Ala Ser Ala Leu Met Met Leu Gly Ile Ser1               5                   10                  15Pro Leu Ala Leu Ala Asp Phe Thr Ile Gln Asp Ile Arg Val Glu Gly

        20                  25                  30Leu Gln Arg Thr Glu Pro Ser Thr Val Phe Asn Tyr Leu Pro Val Lys

    35                  40                  45Val Gly Asp Thr Tyr Asn Asp Thr His Gly Ser Ala Ile Ile Lys Ser

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130                 135                 140Lys Leu Asn Ile Gln Ile Thr Pro Lys Val Thr Lys Leu Ala Arg Asn145                 150                 155                 160Arg Val Asp Ile Asp Ile Thr Ile Asp Glu Gly Lys Ser Ala Lys Ile

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290                 295                 300Leu Gly Glu Ile Gln Asn Arg Met Gly Ser Ala Gly Tyr Ala Tyr Ser305                 310                 315                 320Glu Ile Ser Val Gln Pro Leu Pro Asn Ala Glu Thr Lys Thr Val Asp

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690                 695                 700Thr Val Arg Leu Ser Leu Phe Ala Asp Ala Gly Ser Val Trp Asp Gly705                 710                 715                 720Lys Thr Tyr Asp Asp Asn Ser Ser Ser Ala Thr Gly Gly Arg Val Gln

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        20<210>5<211>776<212>PRT<213>脑膜炎奈瑟球菌(Neisseria meningitidis)<400>5Asp Phe Thr Ile Gln Asp Ile Arg Val Glu Gly Leu Gln Arg Thr Glu1               5                   10                  15Pro Ser Thr Val Phe Asn Tyr Leu Pro Val Lys Val Gly Asp Thr Tyr

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        100                 105                 110Ala Gly Leu Lys Glu Glu Tyr Leu Gly Arg Gly Lys Leu Asn Ile Gln

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290                 295                 300Pro Leu Pro Asn Ala Glu Thr Lys Thr Val Asp Phe Val Leu His Ile305                 310                 315                 320Glu Pro Gly Arg Lys Ile Tyr Val Asn Glu Ile His Ile Thr Gly Asn

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            565                 570                 575Glu Ile Ala Leu Pro Gly Ser Lys Leu Gln Tyr Tyr Ser Ala Thr His

        580                 585                 590Asn Gln Thr Trp Phe Phe Pro Leu Ser Lys Thr Phe Thr Leu Met Leu

    595                 600                 605Gly Gly Glu Val Gly Ile Ala Gly Gly Tyr Gly Arg Thr Lys Glu Ile

610                 615                 620Pro Phe Phe Glu Asn Phe Tyr Gly Gly Gly Leu Gly Ser Val Arg Gly625                 630                 635                 640Tyr Glu Ser Gly Thr Leu Gly Pro Lys Val Tyr Asp Glu Tyr Gly Glu

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770                 775<210>6<211>2379<212>DNA<213>淋病奈瑟球菌(Neisseria gonorrhoeae)<400>6atgaaactga aacagattgc ctccgcactg atgatgttgg gcatatcgcc tttggcattt   60gccgacttca ccatccaaga catccgtgtc gaaggcttgc agcgtaccga gccgagcacc   120gtattcaact acctgcccgt caaagtcggc gacacctaca acgacacaca cggcagtgcc   180atcatcaaaa gcctgtacgc caccggtttc tttgacgacg tacgagtcga aactgcggac   240gggcagcttc tgctgaccgt tatcgaacgc cccaccatcg gctcgctcaa catcaccggc   300gccaaaatgc tgcaaaacga cgccatcaag aaaaacctcg aatcgttcgg gctggcgcag   360tcgcaatact ttaatcaggc gacactcaac caggcagtcg ccggcctgaa agaagaatac   420ctcgggcgtg gcaaactcaa tatccaaatc acgcccaaag taaccaaact cgcccgcaac   480cgcgtcgaca tcgacatcac gattgacgag ggcaaatccg ccaaaatcac cgacatcgaa   540tttgaaggca accaagtcta ttccgaccgc aaactgatgc ggcagatgtc gctgaccgaa   600ggcggcattt ggacatggct gacacgaagc gaccggttcg accgccagaa attcgcccaa   660gacatggaaa aagtaaccga cttctaccag aacaacggct acttcgattt ccgtatcctc   720gataccgaca tccaaaccaa cgaagacaaa accaggcaga ccatcaaaat caccgtccac   780gaaggcggac gtttccgctg gggcaaagtg tcgattgaag gcgacaccaa cgaagtcccc   840aaggccgaac tggaaaaact gctgaccatg aagcccggca aatggtacga acgccagcag   900atgaccgccg ttttgggtga gattcagaac cgcatgggct cggcaggcta cgcatacagc   960gaaatcagcg tacagccgct gccgaacgcc ggaaccaaaa ccgtcgattt cgtcctgcac   1020atcgaaccgg gccggaaaat ctacgtcaac gaaatccaca tcaccggcaa caacaaaacc  1080cgcgacgaag tcgtgcgccg cgaattgcgc caaatggaat ccgcgcctta cgacacctcc  1140aagctgcaac gctccaaaga gcgcgtcgag cttttgggct acttcgacaa cgtacagttt  1200gatgccgtcc cgcttgccgg tacgcccgac aaagtcgatt tgaacatgag cctgaccgaa  1260cgctccaccg gctcgctcga cttgagcgcg ggctgggttc aggataccgg cttggtcatg  1320tccgccggcg tatcgcagga caacctgttc ggtacgggca agtcggccgc cctgcgcgcc  1380tcgcgaagca aaaccacgct caacggctcg ctgtcgttta ccgacccgta cttcacggca  1440gacggggtca gcctgggcta cgatatttac ggaaaagcct tcgacccgcg caaagcatcg  1500accagcgtca aacaatataa aaccaccacc gccggcggcg gcgtaaggat gggtatcccc  1560gttaccgaat acgaccgcgt caatttcggg ctggcggcgg aacacctgac cgtcaacacc  1620tacaacaaag cacccaaacg ctatgccgac tttatcagga aatacggcaa aaccgacggc  1680gcagacggca gcttcaaagg cctgctgtac aaaggcaccg tcggctgggg gcgcaacaag  1740accgacagcg cgtcatggcc gacgcgcggc tacctgaccg gcgtaaatgc cgaaatcgcc  1800ctgcccggca gcaaactgca atactactcc gccacccaca accaaacctg gttcttcccc  1860ttaagcaaaa ccttcacgct gatgctcggc ggcgaagtcg gcattgcggg cggctacggc  1920agaaccaaag aaatcccctt ctttgaaaac ttctacggcg gcggcctggg ttcggtgcgc  1980ggctacgaaa gcggcacgct cggcccgaaa gtgtatgacg aatacggcga aaaaatcagc  2040tacggcggca acaaaaaagc caacgtctcc gccgagctgc tcttcccgat gcccggtgcg  2100aaagacgcac gcaccgtccg cctgagcctg tttgccgacg caggcagcgt gtgggacggc  2160agaacctata ccgccgccga aaacggtaac aacaaatcgg tttactcgga aaacgcgcat  2220aaatccacct ttaccaacga attgcgctat tccgccggcg gcgcggttac ctggctctcg  2280cctttgggtc cgatgaaatt cagctacgcc tacccgctga agaaaaaacc ggaagacgaa  2340atccaacgct tccaattcca gctcggcacg acgttctaa                         2379<210>7<211>792<212>PRT<213>淋病奈瑟球菌(Neisseria gonorrhoeae)<400>7Met Lys Leu Lys Gln Ile Ala Ser Ala Leu Met Met Leu Gly Ile Ser1               5                   10                  15Pro Leu Ala Phe Ala Asp Phe Thr Ile Gln Asp Ile Arg Val Glu Gly

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    755                 760                 765Tyr Ala Tyr Pro Leu Lys Lys Lys Pro Glu Asp Glu Ile Gln Arg Phe

770                 775                 780Gln Phe Gln Leu Gly Thr Thr Phe785                 790<210>8<211>21<212>PRT<213>淋病奈瑟球菌(Neisseria gonorrhoeae)<400>8Met Lys Leu Lys Gln Ile Ala Ser Ala Leu Met Met Leu Gly Ile Ser1               5                   10                  15Pro Leu Ala Phe Ala

        20<210>9<211>771<212>PRT<213>淋病奈瑟球菌(Neisseria gonorrhoeae)<400>9Asp Phe Thr Ile Gln Asp Ile Arg Val Glu Gly Leu Gln Arg Thr Glu1               5                   10                  15Pro Ser Thr Val Phe Asn Tyr Leu Pro Val Lys Val Gly Asp Thr Tyr

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50                  55                  60Thr Val Ile Glu Arg Pro Thr Ile Gly Ser Leu Asn Ile Thr Gly Ala65                  70                  75                  80Lys Met Leu Gln Asn Asp Ala Ile Lys Lys Asn Leu Glu Ser Phe Gly

            85                  90                  95Leu Ala Gln Ser Gln Tyr Phe Asn Gln Ala Thr Leu Asn Gln Ala Val

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    355                 360                 365Glu Leu Leu Gly Tyr Phe Asp Asn Val Gln Phe Asp Ala Val Pro Leu

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        580                 585                 590Asn Gln Thr Trp Phe Phe Pro Leu Ser Lys Thr Phe Thr Leu Met Leu

    595                 600                 605Gly Gly Glu Val Gly Ile Ala Gly Gly Tyr Gly Arg Thr Lys Glu Ile

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770<210>10<211>2394<212>DNA<213>脑膜炎奈瑟球菌(Neisseria meningitidis)<400>10atgaaactga aacagattgc ttccgcactg atggtcttgg gcatatcgcc tttggcactt   60gccgacttca ccatccaaga catccgcgtc gaaggcttgc agcgtaccga gccgagtacc   120gtattcaact acctgcccgt caaagtcggc gacacctaca acgacacaca cggcagtgcc   180atcatcaaaa gcctgtacgc caccggtttc tttgacgacg tacgcgtcga aactgcggac   240gggcagctcc tgctgaccgt tatcgaacgc cccaccatcg gctcgctcaa catcaccggc   300gcaaaaatgc tgcaaaacga cgccattaag aaaaacctcg aatcgttcgg gctggcgcag   360tcgcaatact ttaatcaggc gacactcaat caggcagtcg ccggcctgaa agaagaatac   420ctcgggcgcg gcaaactcaa tatccaaatc acgcccaaag taaccaaact cgcccgcaac   480cgcgtcgaca tcgacatcac gattgacgag ggcaaatccg ccaaaatcac cgacatcgaa   540tttgaaggca accaagtcta ttccgaccgc aaactgatgc ggcagatgtc gctgaccgaa   600ggcggcattt ggacatggct gacacgaagc aaccaattca acgagcagaa atttgcccaa   660gacatggaaa aagtaaccga cttctaccag aacaacggct acttcgattt ccgcatcctc   720gataccgaca tccaaaccaa cgaagacaaa accaagcaga ccatcaaaat caccgtccac   780gaaggcggac gtttccgttg gggcaaagtc tccatcgaag gcgacaccaa cgaagtcccc   840aaagccgaac tggaaaaact gctgaccatg aagcccggca aatggtacga acgccagcag   900atgaccgccg ttttgggtga gattcagaac cgcatgggct cggcaggcta cgcatacagc   960gaaatcagcg tacagccgct gccaaacgcc gaaaccaaaa ccgtcgattt cgtcctgcac   1020atcgaaccgg gccggaaaat ctacgtcaac gaaatccaca tcaccggcaa caacaaaacc   1080cgcgacgaag tcgtgcgccg cgaattgcgc caaatggaat ccgcgcctta cgacacctcc   1140aagctgcaac gctccaaaga gcgcgtcgag cttttgggct acttcgacaa cgtacagttt   1200gatgccgtcc cgcttgccgg cacacccgac aaagtcgatt tgaacatgag cctgaccgaa   1260cgttccaccg gctcgctcga cttgagcgcg ggctgggtac aggataccgg cctggtcatg   1320tccgcaggcg tttcccaaga caacctgttc ggtacgggca agtcggccgc cctgcgcgcc   1380tcacgaagca aaaccacgct caacggctcg ctgtcgttta ccgacccgta cttcacggca   1440gacggggtca gcctgggcta cgatgtttac ggaaaagcct tcgacccgcg caaagcatcg   1500accagcatca aacaatataa aaccaccacg gcaggcgcag gcatccgcat gagcgtgcct   1560gttaccgaat acgaccgcgt gaatttcggt ttggtggcag aacacctgac cgtcaacacc   1620tacaacaaag cgcccaaaca ctatgccgac tttatcaaga aatacggcaa aaccgacggc   1680acagacggca gcttcaaagg ctggctgtac aaaggtaccg tcggctgggg gcgcaacaaa   1740accgacagcg cgttatggcc gacgcgcggc tacctgacgg gcgtgaacgc cgaaatcgcc   1800ctgcccggca gcaaactgca atactactcc gccacccaca accaaacctg gttcttcccc   1860ttaagcaaaa ccttcacgct gatgctcggc ggcgaagtcg gcattgcggg cggctacggc   1920agaaccaaag aaatcccctt ctttgaaaac ttctacggcg gcggcctggg ttcggtgcgc   1980ggatacgaaa gcggcacgct cggtccgaaa gtgtatgacg aatacggcga aaaaatcagc   2040tacggcggca acaaaaaagc caacgtctcc gccgagctgc tcttcccgat gcccggcgcg   2100aaagacgcgc gcaccgtccg cctgagcctg tttgccgacg caggcagcgt gtgggacggc   2160aaaacctacg acgacaacag cagttccgcg accggcggca gggttcaaaa catttacggc   2220gccggcaata cccataaatc cacctttacc aacgaattgc gctattccgc cggcggcgcg   2280gttacctggc tctcgccttt aggcccgatg aaattcagct acgcctaccc gctgaagaaa   2340aaaccggaag acgaaatcca acgcttccaa ttccaactcg gcacgacgtt ctaa         2394<210>11<211>797<212>PRT<213>脑膜炎奈瑟球菌(Neisseria meningitidis)<400>11Met Lys Leu Lys Gln Ile Ala Set Ala Leu Met Val Leu Gly Ile Ser1               5                   10                  15Pro Leu Ala Leu Ala Asp Phe Thr Ile Gln Asp Ile Arg Val Glu Gly

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    195                 200                 205Arg Ser Asn Gln Phe Asn Gtu Gln Lys Phe Ala Gln Asp Met Glu Lys

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770                 775                 780Glu Ile Gln Arg Phe Gln Phe Gln Leu Gly Thr Thr Phe785                 790                 795<210>12<211>21<212>PRT<213>脑膜炎奈瑟球菌(Neisseria meningitidis)<400>12Met Lys Leu Lys Gln Ile Ala Ser Ala Leu Met Val Leu Gly Ile Ser1               5                   10                  15Pro Leu Ala Leu Ala

        20<210>13<211>776<212>PRT<213>脑膜炎奈瑟球菌(Neisseria meningitidis)<400>13Asp Phe Thr Ile Gln Asp Ile Arg Val Glu Gly Leu Gln Arg Thr Glul               5                   10                  15Pro Ser Thr Val Phe Asn Tyr Leu Pro Val Lys Val Gly Asp Thr Tyr

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    355                 360                 365Glu Leu Leu Gly Tyr phe Asp Asn Val Gln Phe Asp Ala Val Pro Leu

370                 375                 380Ala Gly Thr Pro Asp Lys Val Asp Leu Asn Met Ser Leu Thr Glu Arg385                 390                 395                 400Ser Thr Gly Ser Leu Asp Leu Ser Ala Gly Trp Val Gln Asp Thr Gly

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        580                 585                 590Asn Gln Thr Trp Phe Phe Pro Leu Ser Lys Thr Phe Thr Leu Met Leu

    595                 600                 605Gly Gly Glu Val Gly Ile Ala Gly Gly Tyr Gly Arg Thr Lys Glu Ile

610                 615                 620Pro Phe Phe Glu Asn Phe Tyr Gly Gly Gly Leu Gly Ser Val Arg Gly625                 630                 635                 640Tyr Glu Ser Gly Thr Leu Gly Pro Lys Val Tyr Asp Glu Tyr Gly Glu

            645                 650                 655Lys Ile Ser Tyr Gly Gly Asn Lys Lys Ala Asn Val Ser Ala Glu Leu

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    675                 680                 685Leu Phe Ala Asp Ala Gly Ser Val Trp Asp Gly Lys Thr Tyr Asp Asp

690                 695                 700Asn Ser Ser Ser Ala Thr Gly Gly Arg Val Gln Asn Ile Tyr Gly Ala705                 710                 715                 720Gly Asn Thr His Lys Ser Thr Phe Thr Asn Glu Leu Arg Tyr Ser Ala

            725                 730                 735Gly Gly Ala Val Thr Trp Leu Ser Pro Leu Gly Pro Met Lys Phe Ser

        740                 745                 750Tyr Ala Tyr Pro Leu Lys Lys Lys Pro Glu Asp Glu Ile Gln Arg Phe

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770                 775<210>14<211>441<212>PRT<213>脑膜炎奈瑟球菌(Neisseria meningitidis)<400>14Met Lys Lys Tyr Leu Phe Arg Ala Ala Leu Tyr Gly Ile Ala Ala Ala1               5                   10                  15Ile Leu Ala Ala Cys Gln Ser Lys Ser Ile Gln Thr Phe Pro Gln Pro

        20                  25                  30Asp Thr Ser Val Ile Asn Gly Pro Asp Arg Pro Val Gly Ile Pro Asp

    35                  40                  45Pro Ala Gly Thr Thr Val Gly Gly Gly Gly Ala Val Tyr Thr Val Val

50                  55                  60Pro His Leu Ser Leu Pro His Trp Ala Ala Gln Asp Phe Ala Lys Ser65                  70                  75                  80Leu Gln Ser Phe Arg Leu Gly Cys Ala Asn Leu Lys Asn Arg Gln Gly

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        100                 105                 110Gln Ala Lys Gln Phe Phe Glu Arg Tyr Phe Thr Pro Trp Gln Val Ala

    115                 120                 125Gly Asn Gly Ser Leu Ala Gly Thr Val Thr Gly Tyr Tyr Glu Pro Val

130                 135                 l40Leu Lys Gly Asp Asp Arg Arg Thr Ala Gln Ala Arg Phe Pro Ile Tyr145                 150                 155                 160Gly Ile Pro Asp Asp Phe Ile Ser Val Pro Leu Pro Ala Gly Leu Arg

            165                 170                 175Ser Gly Lys Ala Leu Val Arg Ile Arg Gln Thr Gly Lys Asn Ser Gly

        180                 185                 190Thr Ile Asp Asn Thr Gly Gly Thr His Thr Ala Asp Leu Ser Arg Phe

    195                 200                 205Pro Ile Thr Ala Arg Thr Thr Ala lle Lys Gly Arg Phe Glu Gly Ser

210                 215                 220Arg Phe Leu Pro Tyr His Thr Arg Asn Gln Ile Asn Gly Gly Ala Leu225                 230                 235                 240Asp Gly Lys Ala Pro Ile Leu Gly Tyr Ala Glu Asp Pro Val Glu Leu

            245                 250                 255Phe Phe Met His Ile Gln Gly Ser Gly Arg Leu Lys Thr Pro Ser Gly

        260                 265                 270Lys Tyr lle Arg Ile Gly Tyr Ala Asp Lys Asn Glu His Pro Tyr Val

    275                 280                 285Ser Ile Gly Arg Tyr Met Ala Asp Lys Gly Tyr Leu Lys Leu Gly Gln

290                 295                 300Thr Ser Met Gln Gly Ile Lys Ala Tyr Met Arg Gln Asn Pro Gln Arg305                 310                 315                 320Leu Ala Glu Val Leu Gly Gln Asn Pro Ser Tyr Ile Phe Phe Arg Glu

            325                 330                 335Leu Ala Gly Ser Ser Asn Asp Gly Pro Val Gly Ala Leu Gly Thr Pro

        340                 345                 350Leu Met Gly Glu Tyr Ala Gly Ala Val Asp Arg His Tyr Ile Thr Leu

    355                 360                 365Gly Ala Pro Leu Phe Val Ala Thr Ala His Pro Val Thr Arg Lys Ala

370                 375                 380Leu Asn Arg Leu Ile Met Ala Gln Asp Thr Gly Ser Ala Ile Lys Gly385                 390                 395                 400Ala Val Arg Val Asp Tyr Phe Trp Gly Tyr Gly Asp Glu Ala Gly Glu

            405                 4l0                 415Leu Ala Gly Lys Gln Lys Thr Thr Gly Tyr Val Trp Gln Leu Leu Pro

        420                 425                 430Asn Gly Met Lys Pro Glu Tyr Arg Pro

    435                 440