抗中间普氏菌和牙龈二氧化碳噬纤维菌混合IgY及其在治疗口臭和牙龈中的应用

具体实施方式：

下面结合实施例详细描述本发明的实现方案。

实施例1：

抗中间普氏菌和牙龈二氧化碳噬纤维菌混合特异性IgY，其中：取牙龈二氧化碳噬纤维菌菌体特异性IgY30～60份，中间普氏菌菌体特异性IgY40～70份混合而成。

抗中间普氏菌和牙龈二氧化碳噬纤维菌混合特异性IgY在制备预防和治疗口臭和牙龈的制剂中的应用。

抗中间普氏菌和牙龈二氧化碳噬纤维菌混合特异性IgY的制备方法，其中：

A细菌种类：牙龈二氧化碳噬纤维菌和中间普氏菌；

细菌的来源和培养：牙龈二氧化碳噬纤维菌和中间普氏菌，来自牙周病患者口腔牙周袋炎症部位分离的牙龈二氧化碳噬纤维菌、中间普氏菌，以及标准的牙龈二氧化碳噬纤维菌ATCC 33624和中间普氏菌ATCC 25261菌株，经BHI-S培养基分离培养和扩增培养的牙龈二氧化碳噬纤维菌、中间普氏菌，并经鉴定确认为牙龈二氧化碳噬纤维菌、中间普氏菌；

B免疫原制备：

取牙龈二氧化碳噬纤维菌菌体的碎片30～60份，中间普氏菌菌体的碎片40～70份混合成菌液；

将等体积的菌液与等体积的福氏完全佐剂混合，使用高速搅拌器搅拌乳化，最终制成油包水福氏完全佐剂牙龈二氧化碳噬纤维菌、中间普氏菌混合免疫原。

或者将等体积的菌液与等体积的福氏不完全佐剂混合，使用高速搅拌器搅拌乳化，最终制成油包水福氏不完全佐剂牙龈二氧化碳噬纤维菌、中间普氏菌混合免疫原；

每毫升福氏完全佐剂混合免疫原和福氏不完全佐剂混合免疫原中均含有细菌20亿-60亿；

C免疫：

使用注射器将福氏完全佐剂混合免疫原皮下和肌肉注射给产蛋母鸡，每只产蛋母鸡注射1.5ml-2.0ml免疫原，然后每隔一周使用福氏不完全佐剂混合免疫原1.5ml-2.0ml皮下和肌肉注射给产蛋母鸡，加强免疫二次后；此后每隔八周再使用福氏不完全佐剂混合免疫原1ml皮下和肌肉注射给产蛋母鸡加强免疫四次，前后共免疫七次。

D抗中间普氏菌和牙龈二氧化碳噬纤维菌混合特异性IgY提取物的制备：

收集免疫第一次免疫后第30天的免疫母鸡鸡蛋，使用70％的酒精进行鸡蛋表面消毒，打开蛋壳取蛋黄，去除蛋黄膜取蛋黄液，将蛋黄液与蒸馏水按体积比1∶7-9的比例加蒸馏水，充分搅拌，并使用1N HCl调节酸碱度至pH5.0-5.2，然后放置4℃ 12小时。

然后将蛋黄稀释液高速离心10000rpm，30分钟，取上清，将蛋黄稀释液上清置于截留分子量为100KD的中空纤维超滤器中超滤浓缩5-10倍，然后加入0.02％-2.0％的氯己定充分搅拌，并使用1N NaOH调节酸碱度至pH7.0-7.5，放置4℃ 12小时，此后高速离心10000rpm，15分钟，取上清，除去脂质物质，将上清经0.45μ-0.22μ的消毒微孔滤膜过滤除菌，即得抗中间普氏菌和牙龈二氧化碳噬纤维菌混合特异性IgY提取物。

实施例2：单独取牙龈二氧化碳噬纤维菌菌体的碎片作为菌液；单独制备抗牙龈二氧化碳噬纤维菌特异性IgY提取物。其余制备参照实施例1。

实施例3：单独取中间普氏菌菌体的碎片作为菌液；单独制备抗中间普氏菌特异性IgY提取物。其余制备参照实施例1。

实施例4：取实施例2、3所得的抗中间普氏菌特异性IgY提取物，抗牙龈二氧化碳噬纤维菌特异性IgY提取物。按抗牙龈二氧化碳噬纤维菌菌体特异性IgY30份，抗中间普氏菌菌体特异性IgY70份混合而成。

其余制备参照实施例1。

实施例5：取实施例2、3所得的抗中间普氏菌特异性IgY提取物，抗牙龈二氧化碳噬纤维菌特异性IgY提取物。按抗牙龈二氧化碳噬纤维菌菌体特异性IgY40份，抗中间普氏菌菌体特异性IgY60份混合而成。

实施例6：取实施例2、3所得的抗中间普氏菌特异性IgY提取物，抗牙龈二氧化碳噬纤维菌特异性IgY提取物。按抗牙龈二氧化碳噬纤维菌菌体特异性IgY35份，抗中间普氏菌菌体特异性IgY65份混合而成。

实施例7：

制备500克抗中间普氏菌和牙龈二氧化碳噬纤维菌混合特异性IgY提取物生产工艺流程：

(1)细菌培养：

标准的牙龈二氧化碳噬纤维菌(ATCC 33624)和中间普氏菌(ATCC 25261)等菌株经BHI-S培养基分离培养和扩增培养的牙龈二氧化碳噬纤维菌、中间普氏菌，并经鉴定确认为牙龈二氧化碳噬纤维菌、中间普氏菌，并收集细菌；

(2)免疫原制备：

将上述菌体经石炭酸灭活处理。另外，用超声波粉碎机将细菌菌体超声粉碎30分钟，使细菌菌体粉碎裂解成细小的和/或分子的碎片。

牙龈二氧化碳噬纤维菌菌体、中间普氏菌菌体、以及牙龈二氧化碳噬纤维菌体碎片、中间普氏菌菌体碎片50∶50数量份混合，其中细菌菌体与菌体碎片的比例为细菌菌体60份，菌体碎片40份。

将400ml的菌液与400ml的福氏完全佐剂混合，使用高速搅拌器搅拌乳化，制成油包水福氏完全佐剂免疫原。福氏不完全佐剂免疫原的制备：将400ml的菌液与400ml的福氏不完全佐剂混合，使用高速搅拌器搅拌乳化，制成油包水福氏不完全佐剂免疫原。每毫升免疫原中含有细菌25亿；

(3)免疫产蛋母鸡：

使用注射器将福氏完全佐剂混合免疫原皮下和肌肉注射给28周的产蛋母鸡，每只注射2.0ml免疫原，然后隔一周使用福氏不完全佐剂免疫原2.0ml皮下和肌肉注射给产蛋母鸡，加强免疫二次后，此后每隔八周再使用福氏不完全佐剂免疫原1ml皮下和肌肉注射给产蛋母鸡加强免疫共四次，前后共免疫七次，免疫母鸡总数为300只；

(4)抗中间普氏菌和牙龈二氧化碳噬纤维菌混合特异性IgY提取物的制备：

收集免疫第一次免疫后第50～70天的免疫母鸡鸡蛋，使用70％的酒精进行鸡蛋表面消毒，打开蛋壳取蛋黄，去除蛋黄膜取蛋黄液，将蛋黄液与蒸馏水按体积比1∶9的比例加蒸馏水，充分搅拌，并使用1N HCl调节酸碱度至pH5.0，然后放置4℃ 12小时；

然后将蛋黄稀释液高速离心10000rpm，30分钟，取上清，将上清置于截留分子量100KD的中空纤维超滤器中超滤浓缩10倍，然后加入1.0％的氯已定充分搅拌，并使用1N NaOH调节酸碱度至pH7.0，并放置4℃ 12小时。此后高速离心10000rpm，15分钟，取上清，除去脂质物质，将上清经0.45μ-0.22μ的消毒微孔滤膜过滤除菌，即得抗中间普氏菌和牙龈二氧化碳噬纤维菌混合特异性IgY提取物。抗中间普氏菌和牙龈二氧化碳噬纤维菌混合特异性IgY提取物经ELISA(酶联免疫吸附实验)方法测定，提取物中每毫克蛋白中的特异性IgY抗体的效价为1∶4000/mg蛋白，或者称提取物中每毫克蛋白中的特异性IgY抗体的比活为1∶4000。在IgY抗体提取物中，IgY抗体的纯度经非还原性SDS-PAGE测定为33.5％。

实施例8：

制备500克抗中间普氏菌和牙龈二氧化碳噬纤维菌混合特异性IgY纯品生产工艺流程：

(1)细菌培养：

标准的牙龈二氧化碳噬纤维菌(ATCC 33624)和中间普氏菌(ATCC 25261)等菌株经BHI-S培养基分离培养和扩增培养的牙龈二氧化碳噬纤维菌、中间普氏菌，并经鉴定确认为牙龈二氧化碳噬纤维菌、中间普氏菌，并收集细菌；

(2)免疫原制备：

将上述菌体经石炭酸灭活处理。另外，用超声波粉碎机将细菌菌体超声粉碎30分钟，使细菌菌体粉碎裂解成细小的和/或分子的碎片。

牙龈二氧化碳噬纤维菌菌体、中间普氏菌菌体、以及牙龈二氧化碳噬纤维菌体碎片、中间普氏菌菌体碎片60∶40数量份混合，其中细菌菌体与菌体碎片的比例为细菌菌体50份，菌体碎片50份。

将300ml的菌液与300ml的福氏完全佐剂混合，使用高速搅拌器搅拌乳化，制成油包水福氏完全佐剂免疫原。福氏不完全佐剂免疫原的制备：将300ml的菌液与300ml的福氏不完全佐剂混合，使用高速搅拌器搅拌乳化，制成油包水福氏不完全佐剂免疫原。每毫升免疫原中含有细菌50亿；

(3)免疫产蛋母鸡：

使用注射器将福氏完全佐剂混合免疫原皮下和肌肉注射给26周的产蛋母鸡，每只注射1.5ml免疫原，然后隔一周使用福氏不完全佐剂免疫原1.5ml皮下和肌肉注射给产蛋母鸡，加强免疫二次后，此后每隔八周再使用福氏不完全佐剂免疫原1ml皮下和肌肉注射给产蛋母鸡加强免疫共四次，前后共免疫七次，免疫母鸡总数为300只；

(4)抗中间普氏菌和牙龈二氧化碳噬纤维菌混合特异性IgY纯品的制备：

收集免疫第一次免疫后第60～80天的免疫母鸡鸡蛋，使用70％的酒精进行鸡蛋表面消毒，打开蛋壳取蛋黄，去除蛋黄膜取蛋黄液，将蛋黄液与蒸馏水按体积比1∶9的比例加蒸馏水，充分搅拌，并使用1N HCl调节酸碱度至pH5.05，然后放置4℃ 12小时。

然后将蛋黄稀释液高速离心10000rpm，30分钟，取上清，将上清置于截留分子量100KD的中空纤维超滤器中超滤浓缩10倍，然后加入2.0％的氯己定充分搅拌，并使用1N NaOH调节酸碱度至pH7.03，并放置4℃ 12小时。此后高速离心10000rpm，15分钟，取上清，除去脂质物质，即得抗中间普氏菌和牙龈二氧化碳噬纤维菌混合特异性IgY提取物。

将除去脂质物质后的抗中间普氏菌和牙龈二氧化碳噬纤维菌混合特异性IgY提取物加硫酸胺至55％的饱和度，充分搅拌，室温静置4小时，然后高速离心10000rpm 10分钟，取沉淀，将沉淀使用蒸馏水稀释到原体积量，再加硫酸胺至33％的饱和度，充分搅拌，室温静置4小时，然后高速离心10000rpm 10分钟，取沉淀，用蒸馏水稀释溶解后装入透析袋，用蒸馏水透析除盐，即得抗中间普氏菌和牙龈二氧化碳噬纤维菌混合特异性IgY纯品。抗中间普氏菌和牙龈二氧化碳噬纤维菌混合特异性IgY纯品经ELISA方法测定，抗中间普氏菌和牙龈二氧化碳噬纤维菌混合特异性IgY纯品中每毫克蛋白中的特异性IgY抗体的效价为1∶16000/mg蛋白，或者称抗中间普氏菌和牙龈二氧化碳噬纤维菌混合特异性IgY纯品中，每毫克蛋白中的特异性IgY抗体的比活性为1∶16000。在IgY抗体纯品中，IgY抗体的纯度经非还原性SDS-PAGE测定为93.6％。

实施例9：

抗中间普氏菌和牙龈二氧化碳噬纤维菌混合特异性IgY的口腔喷雾剂：

抗中间普氏菌和牙龈二氧化碳噬纤维菌混合特异性IgY提取物  0.20％

甘露醇                                                 5.0％

氯已定                                                 0.001％

蒸馏水                                                 补充至100％共100ml。

将60m1蒸馏水加入烧杯中，再依次加入上述成分，最后将蒸馏水补充至100ml，经0.22μ的消毒微孔滤膜过滤除菌，无菌灌装入消毒的喷雾剂的罐中。

其余分别重复实施例5、6、7。

实施例10：

抗中间普氏菌和牙龈二氧化碳噬纤维菌混合特异性IgY的滴注剂：

抗中间普氏菌和牙龈二氧化碳噬纤维菌混合特异性IgY提取物  0.30％

甘露醇                                                 5.0％

氯已定                                                 0.002％

蒸馏水                                                 补充至100％共100ml。

将60ml蒸馏水加入烧杯中，再依次加入上述成分，最后将蒸馏水补充至100ml，经0.22μ的消毒微孔滤膜过滤除菌，无菌灌装入消毒的滴鼻剂的瓶中。

其余分别重复实施例4、5、6。

实施例11：

抗中间普氏菌和牙龈二氧化碳噬纤维菌混合特异性IgY的含片：

抗中间普氏菌和牙龈二氧化碳噬纤维菌混合特异性IgY提取物  1.0％

羧甲基纤维素                                           0.15％

硬脂酸镁                                               0.10％

山梨醇                                                 补充至100％共100g。

将上述含片药物低温制粒，然后压成不同形状的口含片，每片0.5g。

其余分别重复实施例4、5、6。

实施例12：

抗中间普氏菌和牙龈二氧化碳噬纤维菌混合特异性IgY纯品的喷雾剂及滴注剂：

抗中间普氏菌和牙龈二氧化碳噬纤维菌混合特异性IgY纯品  0.1％

甘露醇                                               5.0％

氯己定                                               0.002％

蒸馏水                                               补充至100％共100ml。

将60ml蒸馏水加入烧杯中，再依次加入上述成分，最后将蒸馏水补充至100ml，经0.22μ的消毒微孔滤膜过滤除菌，无菌灌装入消毒的喷雾剂和滴注剂的罐中。

其余分别重复实施例4、5、6。

实施例13：

抗中间普氏菌和牙龈二氧化碳噬纤维菌混合特异性IgY纯品的含片：

抗中间普氏菌和牙龈二氧化碳噬纤维菌混合特异性IgY纯品  0.15％

羧甲基纤维素                                         0.15％

硬脂酸镁                                             0.10％

山梨醇                                               补充至100％共100g。

将上述含片药物低温制粒，然后压成不同形状的口含片，每片0.5g。

其余分别重复实施例4、5、6。

实验例1：

牙龈二氧化碳噬纤维菌、中间普氏菌等两种细菌组合的免疫原按本发明的方法免疫产蛋母鸡，取第一次免疫后30-40天的免疫母鸡的鸡蛋，并按本发明的方法制备出抗中间普氏菌和牙龈二氧化碳噬纤维菌混合特异性IgY的提取物，应用ELISA方法测定抗中间普氏菌和牙龈二氧化碳噬纤维菌混合特异性IgY结合不同抗原的生物学效价(见表1)：

表1  牙龈二氧化碳噬纤维菌、抗中间普氏菌混合IgY抗体提取物的效价

根据上述实验结果可以清楚地看到：(1).牙龈二氧化碳噬纤维菌、中间普氏菌两种菌菌体+菌体碎片免疫原免疫产蛋母鸡，可以产生分别抗两种细菌的特异性IgY抗体；(2).产生的对各种细菌的特异性IgY抗体的效价并不随免疫产蛋母鸡时每种细菌使用的剂量而变化，即：并不是免疫剂量大的细菌产生的IgY抗体的效价也高，这是与抗原的免疫原性相关；(3).牙龈二氧化碳噬纤维菌、中间普氏菌混合IgY抗体与牙龈二氧化碳噬纤维菌、中间普氏菌的混合抗原都能起反应，其效价有叠加作用；(4).由上述实验可见，一种抗中间普氏菌和牙龈二氧化碳噬纤维菌混合特异性IgY可以治疗由上述细菌引起的口臭、口腔异味、以及牙龈炎等；(5).同时也可以用一种抗中间普氏菌和牙龈二氧化碳噬纤维菌混合特异性IgY治疗由上述细菌中的任何一种细菌引起的口臭、口腔异味、以及牙龈炎等；(6).由此还可以扩大到由与上述细菌有共同抗原决定簇的细菌引起的口臭、口腔异味、以及牙龈炎等，都可以使用本发明的抗中间普氏菌和牙龈二氧化碳噬纤维菌混合特异性IgY治疗。

实验例2：

牙龈二氧化碳噬纤维菌、中间普氏菌混合免疫原按本发明的方法免疫产蛋母鸡，取第一次免疫后80-100天的免疫母鸡的鸡蛋，并按本发明的方法制备出抗中间普氏菌和牙龈二氧化碳噬纤维菌混合特异性IgY的纯品，应用ELISA方法测定抗中间普氏菌和牙龈二氧化碳噬纤维菌混合特异性IgY结合不同抗原的生物学效价(见表2)：

表2  抗中间普氏菌和牙龈二氧化碳噬纤维菌混合特异性IgY纯品的效价

根据上述实验结果可以清楚地看到：(1).按本发明的方法制备出抗中间普氏菌和牙龈二氧化碳噬纤维菌混合特异性IgY的纯品要比实验例1中的按本发明的方法制备出抗中间普氏菌和牙龈二氧化碳噬纤维菌混合特异性IgY的提取物的特异性结合牙龈二氧化碳噬纤维菌和中间普氏菌混合抗原，以及牙龈二氧化碳噬纤维菌、中间普氏菌等细菌各自抗原的生物学效价都要高，基本是按比例增加；(2).牙龈二氧化碳噬纤维菌、中间普氏菌混合免疫原免疫产蛋母鸡，可以产生分别抗两种细菌的特异性IgY抗体；(3).产生的对各种细菌的特异性IgY抗体的效价并不随免疫产蛋母鸡时每种细菌使用的剂量而变化，即：并不是免疫剂量大的细菌产生IgY抗体的效价也高，这是与抗原的免疫原性相关；(4).抗中间普氏菌和牙龈二氧化碳噬纤维菌混合特异性IgY与牙龈二氧化碳噬纤维菌、中间普氏菌等两种菌的混合抗原都能起反应，而且总的特异性IgY抗体的效价也增加了，其效价有叠加作用；(5).由上述实验可见，一种抗中间普氏菌和牙龈二氧化碳噬纤维菌混合特异性IgY可以治疗由上述细菌引起的口臭、口腔异味、以及牙龈炎等；(6).同时也可以用一种抗中间普氏菌和牙龈二氧化碳噬纤维菌混合特异性IgY治疗由上述细菌中的任何一种细菌引起的口臭、口腔异味、以及牙龈炎等；(7).由此还可以扩大到由与上述细菌有共同抗原决定簇的细菌引起的口臭、口腔异味、以及牙龈炎等，都可以使用本发明的抗中间普氏菌和牙龈二氧化碳噬纤维菌混合特异性IgY预防和治疗。

实验例3：

按本发明的方法制备出的牙龈二氧化碳噬纤维菌、中间普氏菌的菌体及牙龈二氧化碳噬纤维菌、中间普氏菌的菌体+菌体碎片等两种免疫原免疫产蛋母鸡，并分别制备出抗牙龈二氧化碳噬纤维菌、中间普氏菌菌体混合IgY抗体提取物和抗牙龈二氧化碳噬纤维菌、中间普氏菌菌体+菌体碎片混合IgY抗体提取物，应用ELISA方法测定它们抗牙龈二氧化碳噬纤维菌、中间普氏菌混合抗原的结合生物学效价，结果见表4：

表4  不同免疫原诱导的母鸡特异性混合IgY抗体结合不同抗原的生物学效价

根据上述实验结果可以清楚地看到：在相同的免疫条件下，按本发明的方法制备出牙龈二氧化碳噬纤维菌、中间普氏菌菌体和抗牙龈二氧化碳噬纤维菌、中间普氏菌菌体+菌体碎片等两种不同免疫原免疫产蛋鸡，并制备出第一次免疫后80-100天免疫母鸡的鸡蛋的抗牙龈二氧化碳噬纤维菌、中间普氏菌菌体混合IgY抗体提取物和抗牙龈二氧化碳噬纤维菌、中间普氏菌菌体+菌体碎片混合IgY抗体提取物等两种IgY抗体。这两种IgY抗体分别与牙龈二氧化碳噬纤维菌、中间普氏菌混合抗原反应，结果这两种IgY抗体生物学结合效价有一定的差异，其中抗牙龈二氧化碳噬纤维菌、中间普氏菌菌体+菌体碎片混合IgY抗体的生物学结合效价更高。这些结果说明牙龈二氧化碳噬纤维菌、中间普氏菌菌体+菌体碎片免疫原的免疫效果比单纯牙龈二氧化碳噬纤维菌、中间普氏菌菌体免疫原的免疫效果要更好。

实验例4：

生物学效价为1∶32000/mg，蛋白纯度为93.1％的特异性抗中间普氏菌(P.i，ATCC 25261)IgY抗体分别与牙龈二氧化碳噬纤维菌(Cg，ATCC 33624)、伴放线放线杆菌(Aa，ATCC 29523)、具核梭杆菌(Fn，ATCC 10953)、牙龈卟啉菌(Pg，ATCC 33277)发生免疫交叉反应，结果见表10：

表10  抗中间普氏菌IgY抗体与其它口腔厌氧菌交叉反应生物学效价

根据上述实验结果可以清楚地看到：按本发明的方法免疫产蛋母鸡后，并按本发明的方法制备出第一次免疫后30-40天免疫母鸡的鸡蛋的抗中间普氏菌IgY抗体的纯品，其能够与牙龈二氧化碳噬纤维菌，以及其它口腔厌氧菌发生免疫交叉反应。这明确地证明这些口腔厌氧菌之间有着共同的抗原决定簇，相同的抗原决定簇越多，交叉反应就越强。因此，抗中间普氏菌和牙龈二氧化碳噬纤维菌混合特异性IgY制剂可以预防和治疗由上述具有共同抗原决定簇的细菌引起的口臭、口腔异味、以及牙龈炎等。

实验例5：

抗口臭的临床试验

一、一般原则

1.首次进行的抗口臭产品的功效验证或含有新型活性成分的抗口臭产品的功效验证应被一个以上的独立临床试验证实。

2.产品含有已通过临床验证的抗口臭的成分时，可通过证明此产品与临床已验证的产品的等效性来证实它的有效性。试验组和对照组(阳性对照)的产品应含有相同浓度的同一活性成分。另外，对照组也应包括空白对照或安慰剂。如果产品为一种机械清除的工具，对照组应为自然状态的日常刷牙清洁。

3.含有可能影响抗口臭活性的赋形剂(非活性成分)时，产品的功效应通过临床试验验证。

4.申请者需要提供材料证明配方中活性成分的生物活性和稳定性。

二、研究设计

一般应采用盲法、分层、二单位平行试验或交叉试验方法。

三、试验期限

应按受检产品的功效强度来确定。可为数小时至数周。

四、研究对象：

受试者为符合纳入及排除标准的患有口源性口臭的男性和女性。

一般每组完成试验全过程的人群数量应大于等于12人。

五、检查指标或采用指数

可同时采用以下两种评价方法：

1.感官评价(即嗅觉评分)：由训练有素的评估人员利用有效记分指标评价受试者的口气。试验前对评估者进行校正实验。

检查者与受检者距离约为10厘米，两者之间放置一屏蔽隔板。受检者用口向外呼气，检查者通过主观感受，分别评分，可采用0-5的等级，评分标准如下：0：察觉不到气味；1：勉强可以察觉到气味，若有若无；2：轻微但可明确察觉；3：中等臭味；4：重度臭味；5：极强的不能忍受的恶臭。取检查者评分的均值作为结果。

2.仪器测量：采用评估主要致臭因素的有效分析仪器测量(如口气测量仪Halimeter)

口气测量仪利用电化学的原理，将口腔气体中挥发性硫化物的浓度以数值的形式表现出来，可作为衡量患者口气水平的指标。使用前先用环境空气调零，嘱受试者闭口三分钟后测量，测量时受试者用鼻呼吸，口微张，将集气管口放在舌背中后三分之一交界处上方0.5cm处，读取显示屏上的数值。每次检查重复三次，结果取平均值。

六、效果评价：

按医学统计方法，对试验组和对照组分别统计试验前、后口气值均数的变化和仪器读数均值变化情况；并比较两组之间各时间段、各指标的变化。

表11  抗中间普氏菌和牙龈二氧化碳噬纤维菌混合特异性IgY抑制口臭的实验效果：

使用方法：取(1)、(2)、(3)、(4)、(5)、(6)的溶液1毫升，喷雾于口臭级别为四级(重度臭味)病人的口腔中，含漱三分钟，每天三次，疗程一个月后，评价治疗效果。

病人人数：72人，随机分为六组，每组12人。

(1)组：取牙龈二氧化碳噬纤维菌菌体特异性IgY35份，中间普氏菌菌体特异性IgY65份混合，加十万份蒸馏水而成。

(2)组：取牙龈二氧化碳噬纤维菌菌体特异性IgY100份，加十万份蒸馏水而成。

(3)组：取中间普氏菌菌体特异性IgY100份，加十万份蒸馏水而成。

(4)组：取Treponemas denticola栖牙密螺旋体特异性IgY100份，加十万份蒸馏水而成。

(5)组：取Mutans streptococci变形链球菌群特异性IgY100份，加十万份蒸馏水而成。

(6)组：蒸馏水。