一种饲用复合酶的制备方法及其制得的饲用复合酶

具体实施方式

实施例：参见图1～图19，提供一种饲用复合酶的制备方法及饲用复合酶。本发明实施例是一个科研与实际应用相结合的项目，在研究方法上考虑了动物消化道的温度/酸碱度以及底物的选择、底物浓度的特点，同时还考虑了饲料加工过程中对酶的破坏、利用，最重要的是底物的选择要与饲料原料的特性要接近。因此，设计并完善了测定酶活性的实验室分析方法与分析方案，对单酶的特性进行全方位的分析研究。另外，通过固定动物日粮，选择不同的单酶及组合进行针对性的试验，以筛选、优化复合酶的组配设计。通过对复合酶组配的筛选、效果对比，最终确定合适的制备方法与有针对性的配方。

参见图1，一种饲用复合酶的制备方法的流程，包括如下步骤：

1)分别测试饲料原料特性、日粮特性、饲料加工特性及动物特性，并分别记录测得的数据或绘制图表；

2)根据步骤1)的数据或图表，初步选择、分别测定各单酶特性，并记录测得的数据或绘制图表；

3)根据对比前述数据或图表，固定日粮特性，并分别筛选适用于该日粮的单酶品种及其含量；

4)根据步骤3)的筛选结果，实验确定适用于该日粮的单酶组合及其含量；

5)根据步骤4)的结果，将各单酶按比例混合，制得饲用复合酶。

前述的饲用复合酶的制备方法，其特征在于，其还包括如下步骤：

6)测试步骤5)制得的饲用复合酶的特性，并记录数据或绘制图表；

7)将制得的饲用复合酶取样与原料或日粮混合后，再测试其特性，并对比步骤1)～4)的数据，调整并重新确定该复合酶中的单酶组分及含量；

8)根据步骤7)所确定的复合制剂中的各单酶组分及含量，按比例混合制得饲用复合酶。

前述的饲用复合酶的制备方法，其特征在于，其还包括如下步骤：

步骤2)中所述单酶特性的测定，包括如下步骤：

1)制备单酶溶液；

2)测试并记录单酶溶液的热稳定性，根据测试结果绘制图表；

3)测试并记录单酶溶液的PH稳定性，根据测试结果绘制图表；

4)测试并记录底物浓度对单酶活性的影响，根据测试结果绘制图表；

5)测试并记录与该单酶溶液其它单酶制剂相互混合后对该单酶活性的影响，根据测试结果绘制图表。

6)测试并记录加工工艺对单酶活性的影响，根据测试结果绘制图表。

7)将前述步骤2)～6)所得图表，对其中任两个或多个，采用图表对比法选取最优特性区间。

具体的，经过优选的实施例如下：

1.2原料及日粮特性分析

1.2.1玉米的特性。在谷物能量原料中，玉米在我国是主要的能量饲料原料。长期以来，玉米都被认为是一种高效稳定的能量原料，最近的研究表明，玉米的消化率并没有以前想象的那么高(认为表观消化率高达95％)，另外，玉米营养成分的变异最近也引起了人们的关注，尤其是玉米的能值，因为玉米除了能值外的其它养分基本就是可以在试验室测定的。玉米的能值受产地、收获季节、品种、干燥方式等不同变化较大，最高时不同玉米间能值差异可达到300～500kcal/kg。

提高玉米可利用能值的方式有两种：一是通过育种培育高能值玉米；二是提高玉米能值的消化率。因此，要解决玉米的主要问题是提高玉米淀粉的消化率，因此选择的酶制剂应以淀粉酶为主。不同品牌的复合酶中，淀粉酶的来源不同，不是所有的淀粉酶在动物消化道内具有相同的消化淀粉的能力。同时，还应补充一些蛋白酶，证据①表明部分淀粉颗粒被一层蛋白膜包裹，只有打破了蛋白膜才能使淀粉更好的被消化。

1.2.2豆粕的特性。动物饲料中最主要的蛋白来源就是豆粕。针对豆粕最主要的问题就是如何提高豆粕贮存蛋白利用率以及破坏豆粕中抗营养因子的负作用，其中首选的主要的酶制剂是蛋白酶。参见表1，大豆中存在的抗营养因子，虽然在大豆加工过程中会破坏一部分，但由于大豆品种、加工工艺等方面的不同，其对抗营养因子破坏的程度差异很大。减少豆粕中抗营养因子的危害有多种方法，如大豆品种改良、大豆热处理加工、饲料的粉碎制粒工艺及添加酶制剂等。在豆粕中，危害最大的抗营养因子主要是蛋白质类的胰蛋白酶抑制因子、植物凝集素、抗性蛋白等抗营养因子，这些蛋白质类的抗营养因子在经过加工过程中的被部分破坏后，可以通过在饲料中添加蛋白酶来进一步在动物体内对其进行破坏，以降低其对营养物质消化吸收的抑制作用。

表1  豆粕中抗营养因子的种类及危害

另外，作为动物饲料中主要的蛋白来源，豆粕的品质变异也是影响豆粕有效利用的一个重要因素。经研究发现，豆粕的品质随大豆的产地不同、品种不同及加工工艺的不同而变化较大。在实际设计动物日粮时，若要考虑豆粕品质间的差异，则必须提高日粮中粗蛋白质的含量，以保证产品质量，若不考虑这种品质变化，则不仅给产品质量带来不稳定因素，而且会给动物生长的均一性带来很大影响，尤其对适时出栏的肉鸡影响最大。用酶制剂处理的方法不仅可以破坏豆粕中的抗营养因子，而且可以提高大豆贮藏蛋白的消化率，从而降低豆粕品质间的差异，在一定程度上降低配方制作时的安全量以降低配方成本。

1.2.3小麦的特性。在中国，小麦作为原料使用受玉米市场价格的影响，究其本质的原因则是其能值的利用比玉米低，导致小麦作为饲料原料的价值降低。在小麦方面要解决的首要问题是小麦中可溶性阿拉伯木聚糖在肠道中引起的粘性的抗营养作用。首选的酶制剂是阿拉伯木聚糖酶，阿拉伯木聚糖酶的作用主要是将小麦中的阿拉伯木聚糖分解成小分子的木寡糖，降解其在动物消化道中引起食糜粘性增加的负作用。众多专家经过多年对小麦日粮的研究发现，限制小麦能量利用的关键因素是小麦中含有较高水平的非淀粉多糖，尤其是阿拉伯木聚糖(Choct and Annison，1992a)。阿拉伯木聚糖的负作用表现在以下几方面：

1.2.3.1阿拉伯木聚糖在动物肠道中吸水后变得粘稠，增加了肠道食糜的粘性。食糜粘性的增加不仅阻止了消化酶扩散与养分的接触，降低了养分的消化率，而且也减缓了可吸收养分向肠壁的扩散，抑制了吸收。

1.2.3.2消化吸收的反馈调节可使分泌腺增生，消化器官变大，消化液分泌增加，消化酶的分泌增加，增加肠道的代谢消耗。

1.2.3.3未被消化的养分流向后肠道，增加了后肠道微生物的繁殖，不仅增强了微生物与动物之间的养分竞争、肠壁细胞的周转加快，而且还会造成动物水样粪便。这些都不仅增加养分的消耗，而且影响了动物的健康，降低了动物的生产性能。

另外，小麦作为饲料时，其营养价值的变异也远远大过玉米。小麦的主要用途是食用而非饲用，只有玉米价格较高的情况下小麦才有司能用到饲料中，因此在使用过程中，不仅会碰到小麦贮存时间的差开尤其是陈化粮，还会发现小麦的产地、品种、种植时间等一般是不可知的，因此更难判断小麦的营养价值及其变异。

1.2.4谷物副产品的特性。主要包括次粉、麸皮、米糠、DDGS等，这些原料在我国的动物日粮配方中应用较普遍。影响这些原料利用的一个主要因素是非淀粉多糖，如纤维素、木聚糖、葡聚糖等，具体原料中各抗营养因子的含量见下表。非淀粉多糖会引起以下几种抗营养作用：

1.2.4.1可溶性的木聚糖与葡聚糖增加肠道食糜粘性，粘性的增加不仅阻碍了消化酶与底物的接触，同时也影响了养分的吸收。另外由于食糜通过肠道速度下降，会引起肠道微生物的过度发酵，不仅消耗养分而且会损害肠道的健康，从而增加肠道营养的维持需要等。同时，由于排泄物水分过高，还会对动物的生长环境造成不利影响。

1.2.4.2由非淀粉多糖组成的细胞壁对营养物质的包裹，这道屏障阻碍了消化酶与底物的接触。只有充分打破这种屏障才能释放出更多的可利用养分。由于动物自身不分泌消化细胞壁的酶制剂，外添加酶制剂是一种有效地解决方法。

因此，参见表2，在谷物副产品含量较高的日粮配方中，改善原料利用特性的几种酶制剂主要是木聚糖酶和葡聚糖酶。

表2  谷物副产品中抗营养因子分析(％干物质)

1.2.5杂粕的特性。其主要包括棉、菜粕和葵粕等。限制杂粕利用的因素除了自身特有的有毒有害成份外，共有的抗营养因子与豆粕相近，具体的抗营养因子见表3。棉粕与菜粕在动物生长前期的日粮中的用量相对较小，在生长中后期畜禽日粮中用量相对较大。解决杂粕中主要的非淀粉多糖类抗营养因子的酶应以木聚糖酶与葡聚糖酶为主。

表3杂粕原料中抗营养因子分析(％干物质)

1.3动物特性分析：动物消化的生理特点

1.3.1猪的特性。参见图2，在自然生长过程中，猪出生后，消化道的酶系统随着采食食物的不同逐渐发生相应的变化。但在高规模化集约化的养殖方式下，一般在3～4周时会人工断奶，采食的方式和内容都发生了较大变化，人为造成了仔猪体内的消化酶有一个突然下降，至少需要3～4周的时间才能恢复到正常水平。在断奶后的一个月的时间内，由于内源消化酶分泌的突然下降，会导致仔猪的消化发生紊乱，严重时会影响仔猪后期的生长。在此阶段有必要补充适合的内源酶以帮助仔猪度过断奶后一个月的应激期。在中大猪阶段，动物体内的内源性消化酶的分泌基本已满足自身需要，但由于此时动物日粮中的谷物副产品和杂粕的用量会越来越高，这些原料中非淀粉多糖的含量较高，而猪自身不分泌非淀粉多糖酶，此时重点补充的酶制剂应是木聚糖酶和葡聚糖酶等非淀粉多糖酶。

1.3.2家禽的特性。家禽的肠道较短，一方面是解决家禽的粘性问题，另一方面要适当补充内源酶以帮助家禽对能量与蛋白的消化。参见图3，研究表明，家禽对淀粉的消化率并没有随着日龄的增长而增长，对淀粉的消化率平均保持在85％，要想提高家禽对淀粉的消化率，在家禽日粮中补充一定量的淀粉酶是很有必要的。

1.4动物特性与饲料加工特点

参见表4，猪与鸡是恒温动物，体温保持在38～40℃范围内，但饲料加工的温度(乳仔料65～70℃，中大猪料75～80℃，禽料85～90℃)却远远超过动物的体温，因此在选择单酶时，不仅要考虑酶制剂在动物体温下的催化效率，还要考虑酶是否能够经受饲料加工时恶劣条件的破坏。另外，由于消化道内的酸碱度变化范围较大，因此选择的酶制剂一定要有较强的耐受性，在整个消化道的环境中都能表现出较好的催化效果。

表4动物消化道内温度与pH变化

1.5单酶特性分析

本实施例所使用的内切阿拉伯木聚糖酶(EC 3.2.1.8)和内切中性蛋白酶(EC 3.4.21.62)是与东莞市泛亚太公司与原美国GenencorInternational公司联合研制开发，分别由Trichoderma longibrachiatum和Bacillus subtilis经液体深层发酵，分离、提纯、浓缩、干燥后制成的饲料专用单酶制品，其具有活性高，抗逆性强，底物专一性等特点。为了更进一步的了解上述单酶制品的酶学特性，有针对性的做了如下测试和研究。

1.5.1木聚糖酶酶学性质的测试

为了更有效地应用木聚糖酶，现对其pH稳定性、热稳定性、底物浓度等酶学性质进行测试和研究。

1.5.1.1温度对木聚糖酶活性的影响

温度对酶反应速度有很大的影响，并且每种酶都有自己的最适温度。因此，在不同温度(20℃、30℃、40℃、50℃、55℃、60℃、70℃、80℃和90℃)其它条件相同的情况下(pH5.3、底物浓度1％)，测定木聚糖酶的活性，其结果见图4。

由图4可以看到木聚糖酶在不同的反应温度下测定的酶活，其活性变化较大，40℃时酶活大于82％，在30℃时酶活仍然大于55％，反应温度在高于60℃后，酶活急剧下降，在60℃到70℃之间酶活从94％下降到60％，这说明，木聚糖酶的活性对反应温度的变化有些敏感。此产品提供的酶活的最适范围温度在40～60℃间，最佳反应温度为55℃，本试验的测定结果基本反应了此产品的的酶活随温度变化的特性。

在实际应用中，由于动物胃肠道内的温度在38～40℃间，从结果来看，此时木聚糖酶活性在80％左右。一方面，虽然动物胃肠道内酶的作用效果可因酶的作用时间较长从而可弥补酶活低的不足，另一方面，可以通过适当提高木聚糖酶在饲料中的添加量来解决这一问题。

1.5.1.2 pH对木聚糖酶活性的影响

pH也对酶反应速度有很大影响。分别将底物和对应的缓冲稀释液的pH调整到3.0、4.0、5.0、5.3、6.0、6.5、7.0、8.0和9.0，然后在其它条件相同的情况下(温度55℃、底物浓度1％)分别测其酶活，结果如图5所示。

由图5可以看出，木聚糖酶在pH＝4～6之间保持较高的活性，平均90％以上，在之外的范围酶活急剧下降，pH＝4的时候，酶活接近80％，但pH＝3时酶活仅为15％，在pH＝6.5时，酶活为55％，在pH＝7时，酶活为23％左右，当pH＝9时，基本上检不出酶的活性。

此酶的酶活最适的pH范围在4～6之间，最佳反应pH的为5.3，本试验的测定结果反应了此酶的酶活随pH变化的特性，说明此酶在偏酸性的条件下有较好的表现。在实际应用中，由于动物胃肠道内的pH偏酸性，所以此木聚糖酶在动物胃肠道内的条件下能够发挥较好的作用。

1.5.1.3底物浓度对木聚糖酶活性的影响

将木聚糖底物分别制备成0.2％、0.4％、0.6％、0.8％和1.0％五个浓度，在保证底物过饱和其它条件相同的情况下(温度55℃、pH5.3)，加入相应量的酶稀释液测定酶活，其结果如图6所示。由图6可以看出，木聚糖酶的活性随底物浓度的提高活性逐渐增强，在底物浓度达到0.6％(相当于最高活性时底物浓度的60％)时，木聚糖酶的活性基本稳定，并接近了酶活的最高值。这说明，木聚糖酶实际应用中，底物浓度较低时就有可能发挥出最高的活性。

1.5.1.4经不同温度处理后酶活存留情况

将固体木聚糖酶在从55℃～100℃(水分含量≤8％)，每间隔5℃的条件下分别处理5分钟，然后测定(pH5.3、温度55℃、底物浓度1％)其酶活，其结果如图7所示。由图7可以看到，木聚糖酶在干燥的状态下经过累积温度处理后，在不同温度下的酶活表现是先升高后下降，在70℃以前木聚糖酶的活性基本没有损失，70℃以后酶活开始损失，到85℃时酶活存留大于88％，100℃时酶活存留在75％左右。酶活在60-70℃间有升高的现象待进一步验证。

1.5.1.5其它酶制剂相互混合后对木聚糖酶的影响

将木聚糖酶(X1222)分别与蛋白酶(P1222)和淀粉酶(A1222)按表5体积比混合后，常温下放置一个月后测定(pH5.3、温度55℃、底物浓度1％)其中木聚糖酶活性，结果表明蛋白酶和淀粉酶对木聚糖酶的活性并无影响。

1.5.1.6木聚糖酶在贮存期间酶活存留情况

将固体木聚糖酶产品(水分含量≤8％)常温下保存，然后每隔两个月取样测定(pH5.3、温度55℃、底物浓度1％)其酶活，结果如图8。

由图8可看出，木聚糖酶在一年内酶活下降不到15％，尤其在前4个月内，酶活下降缓慢不到7.0％，随着时间的延长，酶活会逐渐下降，但速度较平缓，前6个月的酶活平均下降率为1.63％。

表5其它酶制剂与木聚糖酶混合后木聚糖酶活性表

注：1、表中X1222为固体木聚糖酶，P1222为固体蛋白酶，A1222为固体淀粉酶。

2、水分含量小于8％。

1.5.1.7加工工艺对木聚糖酶活性的影响

按照设计标准将1.0公斤活性为25,000U/g的木聚糖酶按1kg/吨的添加量加入小猪饲料后制粒，制粒的条件及温度(75℃左右)与商业饲料厂一致，在不同生产阶段(混合后、调制后、制粒后及打包口)分别取样并测定(pH5.3、温度55℃、底物浓度1％)木聚糖酶的活性，其结果见图9。

此木聚糖酶与饲料原料混合后其活性与设计标准相比有明显的下降，只有45％的活性保留下来，但此时并没有经过高温及压力的处理，说明此木聚糖酶与饲料混合后有55％的活性是在实验室的条件下不能检出的。经过高温(75℃左右)调制后，与设计标准相比，此木聚糖酶在饲料中的活性保留率只有37％左右，下降幅度较大，但与混合后相比，此木聚糖酶的活性保留率为82％(45.2对37.2％)，下降幅度仅为18％左右，说明高温(75℃左右)调制对此木聚糖酶的影响不大。制粒过程是高温及压力的结合，此过程对一般的木聚糖酶的活性影响巨大，但此木聚糖酶经过高温及高压的制粒过程后，与调制后相比，酶活的保留率仅下降了12％左右(37.2对32.8％)，与混合后相比，酶活在饲料中的保留率也只下降了27％左右(45.2对32.8％)。打包口的酶活保留率与制粒后的保留率基本一致(32.8对33.5％)。

本实验说明饲料加工过程中的高温及高压的制粒过程对该木聚糖酶的影响是有限的，整个调制、制粒过程对此木聚糖酶酶活保留率的影响不大于26％(45.2对33.5％)，但此木聚糖酶与饲料原料混合的过程会影响在实验室用现有的方法测定酶活保留率(100对45.2％)，影响酶活测定的原因有诸多，如：金属离子的干扰、酶与底物的作用、测定方法的灵敏度等因素。

1.5.2中性蛋白酶酶学性质的测试和研究

1.5.2.1温度对中性蛋白酶活性的影响分别在30℃、35℃、40℃、45℃、50℃、60℃、70℃和80℃，而其它条件相同(pH7.5、底物浓度1％)的情况下测中性蛋白酶的酶活，结果作图如图10所示。

由图10看出，中性蛋白酶的随反应温度的变化其酶活变化较大，反应温度在40℃左右时，酶活表现最好，反应温度在35～45℃之间酶活表现达到了90％左右，反应温度超过50℃后，其酶活呈现直线下降趋势，且下降幅度较大。这说明，此中性蛋白酶的最适反应温度在35～45℃之间，且反应活性对反应温度的变化较为敏感。

1.5.2.2 pH对中性蛋白酶活性的影响

分别制备pH3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、7.5、8.0和9.0的底物及相应的缓冲液，在其它条件相同(温度40℃、底物浓度1％)的情况下分别测定中性蛋白酶的活性，其结果如图11所示。由图11看出，中性蛋白酶的活性在pH＝5～8间较好，pH＝6～7.5间最好。pH≤4时，中性蛋白酶活下降较快，pH≤3时已检测不出酶的活性。因此，此中性蛋白酶的最适pH为6～7.5。

1.5.2.3底物浓度对蛋白酶活性的影响

将底物酪素分别制备成0.2％、0.4％、0.6％、0.8％和1.0％五个浓度，在保证底物过饱和并且其它条件相同的情况下(pH7.5、温度40℃)，加入酶稀释液测定酶活，其结果如图12所示。由图12看出，蛋白酶的活性随着底物浓度的升高逐渐增强，在底物浓度为0.4％时活性就已达到了最高活性的80％，0.6％时就基本接近了最高活性，这说明蛋白酶对底物的浓度比较敏感，在较低的浓度下就可以表现现较高的活性。

1.5.2.4经不同温度处理后中性蛋白酶活存留情况

将固体蛋白酶(水分含量≤8％)从55℃～100℃，每间隔5℃的条件下分别处理5分钟后，测定(pH7.5、温度40℃、底物浓度1％)其酶活，结果如图13所示。由图13可以看到，中性蛋白酶分别经过55℃到90℃处理后，酶活均处于较稳定状态，平均酶活在90％以上，90℃以后才急剧下降，酶活降到20％左右。

1.5.2.5中性蛋白酶在贮存期间酶活存留情况

将固体中性蛋白酶产品(水分含量≤8％)常温下保存，然后每隔两个月取样测定(pH7.5、温度40℃、底物浓度1％)其酶活，结果如图14所示，中性蛋白酶产品在贮存的前6个月内酶活下降非常少，不到5％；随着时间延长酶活会逐渐降低，一年左右酶活下降约10％。说明此中性蛋白酶在常温下非常稳定。

1.5.2.6加工工艺对中性蛋白酶活性的影响

按照设计标准，将2.5千克活性为40,000U/g的中性蛋白酶按2.5kg/吨的添加量加入小猪饲料后制粒，制粒的条件及温度(75℃左右)与商业饲料厂一致，在不同生产阶段(混合后、调制后、制粒后及打包口)分别取样并测定(pH7.5、温度40℃、底物浓度1％)中性蛋白酶的活性，其结果见图15。

与上述木聚糖酶有相似的结果，此中性蛋白酶与饲料原料混合后其活性与设计标准相比有明显的下降(100对65％)，在实验室的条件下，此中性蛋白酶只有65％的活性能测定，即在没有经过高温及压力处理的情况下，45％的酶活已测不到，说明混合过程会影响酶活的测定，影响酶活测定的原因有很多，未来应注重这方面的研究。经过高温调制后，与设计标准相比，此中性蛋白酶在饲料中的活性保留率只有47％左右，下降幅度较大，但与混合后相比，此中性蛋白酶的活性保留率为68％(65对47％)，下降幅度为30％左右，说明高温调制对此中性蛋白酶的一定的影响，但不大。此中性蛋白酶经过高温及高压的制粒过程后，与调制后相比，酶活的保留率仅下降了19％左右(47对38％)，与混合后相比，酶活在饲料中的保留率也只下降了41％左右(65对38％)。打包口的酶活保留率与制粒后的保留率都为38％。

本实验说明饲料加工过程中的高温及高压的制粒过程对该中性蛋白酶的影响是有限的，整个调制、制粒过程对此中性蛋白酶活保留率的影响在40％左右，但此中性蛋白酶与饲料原料混合的过程会影响酶活保留率。

1.5.3阿拉伯木聚糖酶和中性蛋白酶综合酶学特性的总结

1.5.3.1本实施例使用的内切阿拉伯木聚糖酶(EC 3.2.1.8)的酶学特性具有以下特点：

(1)酶活反应的最适温度在40～60℃间，最佳温度为55℃，在实际应用中，由于动物胃肠道内的温度在38～40℃间，从结果来看，此时木聚糖酶活性在80％左右；

(2)pH在4～6之间，酶活平均在90％以上，最佳反应pH为5.3，在实际应用中，由于动物胃肠道内的pH偏酸性，所以此酶在动物胃肠道内能够发挥较好的作用；

(3)酶的活性在底物浓度达到0.6％时活性已基本稳定，并接近最高值，说明此酶在底物浓度较低时就可能发挥出最高的活性；

(4)此酶在干燥的状态下经过累积温度处理后，在70℃以前活性没有损失，到85℃时酶活存留大于88％，100℃时酶活存留在75％左右；

(5)此木聚糖酶与蛋白酶和淀粉酶按比例混合后储存，测其样品中的木聚糖酶活性，结果表明蛋白酶和淀粉酶对木聚糖酶的活性没有影响；

(6)在室温条件下储存半年，其酶活比较稳定，但随着时间的延长，酶活会逐渐下降，酶活平均月下降率为7.3％；

(7)此木聚糖酶与饲料原料混合后其活性有明显的下降(100对45.2％)，但饲料加工过程中的制粒过程对该酶酶活的影响有限(45.2对33.5％)，说明此木聚糖酶具有耐高温抗高压，并能在体温下良好发挥作用等特点。影响酶活测定的原因有诸多，如：金属离子的干扰、酶与底物的作用、测定方法的灵敏度等因素。

1.5.3.2本实施例使用的内切中性蛋白酶(EC 3.4.21.62)的酶学特性具有以下特点：

(1)此酶酶活随反应温度的变化而变化，在40℃时，酶活表现最好，在35-45℃间酶活表现可达90％左右，说明此酶在动物胃肠道内的温度下能表现良好；

(2)中性蛋白酶的活性在pH＝5～8间较好，pH＝6～7.5间最好。pH≤4时，中性蛋白酶活下降较快，此酶在偏酸性由于动物胃肠道内能够发挥较好的作用；

(3)此酶在底物浓度为0.4％时即可达到最高活性的80％，0.6％时接近最高活性，说明此酶对底物的浓度比较敏感，在较低的浓度下可以表现较高的活性；

(4)中性蛋白酶在干燥的状态下分别经过55℃到90℃处理后，平均酶活在90％以上，90℃以后急剧下降，90℃时酶活降底到20％左右；

(5)中性蛋白酶在常温下贮存非常稳定，前3个月酶活下降不到5％；半年后酶活的保存率仍大于65％；

(6)与木聚糖酶的结果相似，此酶与饲料混合后其活性有明显的下降(100对65％)，即在没有经过高温及压力处理的情况下，35％的酶活已测不到，说明混合过程会影响酶活的测定。经过高温调制后，与混合后相比，此酶的活性保留率为72％(65对47％)，经过高温高压制粒后，酶活在饲料中的保留率在60％左右(65对38％)。高温高压的制粒加工过程对该酶酶活的影响有限，说明此酶具有耐高温抗高压，并能在体温下良好发挥作用等特点。

1.5.3.3综上所述，本实施例使用的内切阿拉伯木聚糖酶和内切中性蛋白酶具有活性高，抗逆性强，底物专一性等特点，是符合饲料专用单酶要求的制品。

1.6不同日粮中复合酶组合的选择

1.6.1乳仔猪玉米豆粕型日粮复合酶的筛选

在乳仔猪玉米豆粕型日粮中，本实施例设计了一种比较纯的玉米豆粕型日粮为试验日粮，在此基础上外添加不同组合的酶制剂。参见表6，酶制剂组合中选择了淀粉酶、蛋白酶、木聚糖酶、葡聚糖酶四种单酶，根据大量的单酶的试验数据，固定了三种酶的浓度，设计了四个梯度的蛋白酶活来选择一个较好的酶活配伍，酶制剂添加量1kg/吨全价料。

表6酶活梯度如下

                            酶活单位u/g

实验条件：试猪体重8公斤，10次试验，共960头数；试验时间2004.05-2005.03，试验地点：佛山高明兴业猪场；实验结果如图16所示。

从试验的结果图16来看，蛋白酶在300～600之间动物的生长速度都表现出了增高的趋势，但增长的速度下降，腹泻率都表现出了下降的趋势。但从经济效益来看，蛋白酶在500～600之间比较好，动物的腹泻率较低，生长速度较高，饲料转化率也较好。

1.6.2中大猪混合型日粮中复合酶的选择

中大猪混合型日粮主要以谷物副产品，如粉糠以及麸皮，杂粕主要以菜粕和棉粕为主。在中大猪阶段，动物体内的消化酶如蛋白酶，淀粉酶等的分泌已成熟，并能满足动物自身需要，因此在选择单酶时，这些消化酶不是选择的重点。随着猪的日龄增长，日粮中非淀粉多糖的含量越来越高，非淀粉多糖酶猪体内自身不能分泌，必需外添加。因此，在这种日粮中主要选择了木聚糖酶，筛选不同的梯度(见表7)进行试验。整个试验过程，固定一种基础日粮。酶制剂添加量500克/吨全价料。

参见试验的结果图17(实验条件：试猪体重20公斤，10次试验，共960头数；试验时间2004.05-2005.03，试验地点：佛山高明兴业猪场)木聚糖酶在4000～6000u/g之间动物的采食量和生长速度较缓，6000～8000u/g之间有一个较快的增高，之后又表现平稳，但从经济效益来看，8000u/g酶活设计是比较经济实用。

表7 2327酶活梯度如下

                             酶活单位u/g

1.6.3肉鸡玉米豆粕型日粮中复合酶的选择

肉鸡日粮，尤其是在一条龙经营方式的企业，主要是以玉米豆粕型为主，肉鸡日粮中不仅要考虑食糜粘性的抗营养作用，还主要考虑淀粉与蛋白的消化率问题。在复合酶的设计中，主要选择了淀粉酶、蛋白酶，适当补充了木聚糖酶。此次筛选主要以淀粉酶为主，固定了其它两种酶(酶活梯度见表8)。肉鸡的品种以AA鸡为主，添加量500克/吨全价料。参见图18所示的试验结果，(实验条件：AA肉鸡，5次试验，20000只，试验时间2004.05-2005.08，试验地点：山东诸城外贸鸡场)，其表明400～600u/g单位的酶活添加500g/吨饲料是有效果的，随着酶活添加量的增大，肉鸡的生长性能都表现出了增长的趋势，其中以800u/g单位的酶活添加500g的生长效果和经济效益最好。

1.6.4肉禽混合谷物型日粮复合酶的筛选

肉禽混合谷物型日粮中杂粕及谷物副产品的用量较大，尤其是肉鸭日粮中的用量更大。杂粕及谷物副产品中富含非淀粉多糖，其中水溶性的非淀粉多糖容易引起肠道中食糜的粘性，抑制消化酶与底物之间的接触与作用，是此类日粮中最主要的抗营养因子。设计复合酶时，重点加强了木聚糖酶，同时添加了一定量的淀粉酶与蛋白酶。试验过程中，固定了蛋白酶与淀粉酶，重点评价了木聚糖酶的作用。复合酶的添加量500g/吨全价料，酶活梯度设计见表9，其试验结果见图19(实验条件：英桃谷，5次试验，20000只，试验时间2004.05-2005.03，试验地点：山东昌邑新昌鸭场)。其结果表明，外添加木聚糖酶在肉禽混合谷物日粮中能显著地改善动物的生长性能及饲料转化率，0～5000u/g添加500克的生长效果都有显著的改善，5000u/g以上动物的生长效果没有显著改善。同时，5000u/g添加500克的经济效果是最好。

表8 5021酶活梯度如下

                              酶活单位μ/g

表9 5025酶活梯度如下

                              酶活单位u/g

1.6.5其他复合酶的筛选

上述复合酶筛选的工作只是整个产品设计筛选工作的一部分，按照相同的方法和步骤，还可以对其他单酶及单酶组合分别进行测试研究。本实施例中所提供了四个日粮的复合酶筛选过程，其中主要针对不同的日粮筛选了其中一种酶，采用相同或相似的方法和步骤，再结合现有技术，最后形成了四种复合酶产品，如表10所示。

表10通过筛选工作形成的四种复合酶设计

2实际推广动物试验效果

2.1乳仔猪用产品PK100在仔猪玉米-豆粕型日粮中的应用效果

2.1.1材料与方法

2.1.1.1试验用酶制剂

试验用酶制剂PK100，由东莞泛亚太生物科技有限公司提供，其组分见表10。

2.1.1.2试验动物

选用120头健康、体重一致的杜长大三元杂交断奶仔猪，按性别和体重一致的原则随机分为两组处理；每组处理3个重复，每个重复20头仔猪；仔猪平均始重为8kg左右，组间差异不显著。

2.1.1.3试验日粮

(1)对照组日粮：对照组日粮由试验场提供；

(2)试验组日粮：试验组日粮由东莞泛亚太生物科技有限公司根据PK100的特性，加入PK100后对对照组配方进行调整，由试验场依据该配方生产提供。

(3)所有日粮以粉料饲喂，各试验日粮的配方及营养水平见表11。

2.1.1.4饲养管理

每日自由采食和饮水。免疫与饲养按猪场常规进行。饲养过程中注意观察仔猪的生长发育情况。

表11  日粮的配方及营养水平

注：1、预混料中含有多种维生素、微量元素、石粉、磷酸氢钙、氨基酸、香味剂、促生长剂和抗氧化剂及载体。

2、PK100的主要成分为：α-淀粉酶、枯草杆菌蛋白酶、阿拉伯木聚糖酶及β-葡聚糖酶。

试验开始和结束，仔猪空腹16h后于第二天上午称取每个重复组的猪体重，并记录试验期间各重复组猪日粮消耗量以及各重复组腹泻猪的头次。

2.1.1.5指标

(1)观测指标

平均日增重、平均日采食量、料重比、腹泻率；

日增重(ADG)＝增重/(试验天数×试猪头数)；

料重比(F/G)＝饲料消耗量/增重；

腹泻率＝腹泻头次数总和/(猪头数×试验天数)。

(2)观察项目：粪便排放量。

2.1.1.6试验时间及地点

(1)试验时间：2005年4月2～2005年5月2日，为28天；

(2)试验地点：广东佛山某商业猪场。

2.1.2试验结果见表12

2.1.3结论

本试验结果表明，在仔猪日粮中添加PK100，能提高仔猪的日增重、改善日粮的转化效率以及降低仔猪的腹泻率。针对不同的地区和仔猪品种，还可以对PK100进行调整和改进。

2.1.3.1仔猪阶段其消化机能尚未发育健全，淀粉酶、蛋白酶等分泌量不足。

表12试验结果

PK100是以蛋白酶、淀粉酶、木聚糖酶等为主的复合型乳仔猪用酶制  剂，添加PK100，在仔猪的日粮中添加了外源淀粉酶、蛋白酶以及非淀粉多糖酶类，补充仔猪体内内源酶的不足，并能激活内源酶的分泌，提高了仔猪对淀粉、蛋白质的消化和利用。通过试验验证日增重提高8.2％，饲料转化率改善4.1％。

2.1.3.2本试验采用的试验日粮是玉米-豆粕型日粮，细胞壁中的非淀粉多糖是影响日粮养分消化率的一个重要因素。以往对日粮的处理是利用膨化技术破坏日粮细胞壁机构后有利于细胞壁内蛋白和淀粉与消化酶结合，提高其消化率。本试验的试验组配方是在对照组配方的基础上进行了调整，调低乳制品及膨化玉米用量，添加PK100。试验结果不仅提高了动物的生长性能，而且降低了动物的增重成本达7％。

2.1.3.3仔猪消化系统发育不充分，胃酸分泌不足，消化酶活性降低，容易引起营养应激反应，严重的表现为腹泻；另外，病源微生物感染，特别是大肠杆菌也是仔猪断奶后腹泻的一个主要原因之一。添加PK100，提高仔猪对养分的消化利用，减少后段肠道的养分浓度，从而降低病源微生物菌群，特别是大肠杆菌的生长，从而降低仔猪的腹泻率。试验组仔猪腹泻率显著低于对照组，比对照组下降了47.68％；

2.1.3.4通过本试验验证在乳仔料配方中降低乳制品及膨化原料或动物蛋白的用量来添加PK100是可靠的、经济的。

2.1.3.5通过观察，粪便的排放量降低约5~10％。

2.2 2327在中大猪混合谷物型日粮中的应用效果

2.2.1材料与方法

2.2.1.1试验用酶制剂

试验用酶制剂2327由东莞泛亚太生物科技有限公司提供。

2.2.1.2试验动物

选用360头健康、体重一致的杜长大三元杂交中猪。按性别和体重一致的原则随机分为3组处理；每组处理6个重复，每个重复20头仔猪；猪的平均始重20.0kg，组间差异不显著。

2.2.1.3试验日粮

(1)对照组日粮：对照组日粮由试验场提供；

(2)试验组日粮：试验组日粮由东莞泛亚太生物科技有限公司根据2327的特性，加入2327后对对照组配方进行调整，由试验场依据该配方生产提供。

(3)所有日粮以粉料饲喂，各组日粮的配方及营养水平见表13。

2.2.1.4饲养管理

每日自由采食和饮水。免疫与饲养按猪场常规进行。饲养过程中注意观察猪的生长情况。

试验开始和结束，称取每个重复组的猪体重，并记录试验期间各重复组猪日粮消耗量。

2.2.1.5指标

(1)观测指标

平均日增重、平均日采食量、料重比；

日增重(ADG)＝增重/(试验天数×试猪头数)；

料重比(F/G)＝饲料消耗量/增重；

表13  日粮的配方及营养水平

注：1、预混料中含有多种维生素、微量元素、香味剂、药物添加剂等。

2、2327的主要成分为：阿拉伯木聚糖酶。

(2)观察项目：粪便排放量。

2.2.1.6试验时间及地点

(1)试验时间：2005年5月5日-6月8日，为34天；

(2)试验地点：广东佛山某商业猪场。

2.2.2试验结果(见表14)：

表14试验结果

2.2.3结论

2.2.3.1在中大猪日粮中添加酶制剂，可以降解饲料中的抗营养因子，提高纤维和半纤维的利用率，促进饲料养分的吸收。2327中设计有高含量的阿拉伯木聚糖酶，在木聚糖酶的作用下，能提高基础日粮和部分粗蛋白质含量，因此在低成本混合型日粮中添加2327能够达到与正常基础日粮相同的饲养效果。在本试验中，对照组和调整日粮加2327两组的试验结果，平均日增重分别为325g和337g，调整日粮加2327组比对照组高12g，料重比分别为2.2和2.08，调整日粮加2327组比对照组低0.92，差异显著。

2.2.3.2直接添加或在调整日粮中添加2327，都可以降低养殖或饲料的单位增重成本。

2.2.3.3粪便排放量降低约5~10％。

根据上述性能测试及推广实验结果，还可以对复合酶的组分、比例等进行调整、修正。

2.3 5021在肉鸡玉米-豆粕型日粮中的应用效果

2.3.1材料与方法

2.3.1.1试验用酶制剂

试验用酶制剂5021由东莞泛亚太生物科技有限公司提供。

2.3.1.2试验动物

选用18000只健康的、体重接近的AA肉鸡，随机分为3组处理；每组处理3个重复，每个重复2000只肉鸡。

2.3.1.3试验日粮

(1)标准日粮：标准日粮由试验场提供；

(2)试验组日粮

试验组日粮A：由标准日粮直接加入5021组成；

试验组日粮B：由东莞泛亚太生物科技有限公司根据5021的特性，加入5021后对标准日粮配方进行调整，由试验场依据该配方生产提供。

(3)小鸡阶段：0~21日龄喂碎料；中大鸡阶段：22~50日龄喂粒料。

(4)各组日粮的配方及营养水平见表15。

表15  日粮的配方及营养水平

注：1、预混料中含有多种维生素、微量元素、氨基酸、氯化胆碱、药物添加剂等。

2、5021的主要成分为：α-淀粉酶、枯草杆菌蛋白酶、阿拉伯木聚糖酶。

2.3.1.4饲养管理

每日自由采食和饮水。免疫与饲养按饲养场常规进行。

2.3.1.5指标

(1)观测指标：每周对每个处理进行5％的随机抽查，测定成活率、体重、采食量及料重比；50日龄时全部屠宰计算经济效益。

(2)观察项目：粪便排放量。

2.3.1.6试验时间及地点

(1)试验时间：2005年3月20日～2005年5月8日，为50天；

(2)试验地点：山东某商业鸡场。

2.3.2试验结果见表16：

表16试验结果

2.3.3结论

2.3.3.1添加酶制剂可以补充内源酶的分泌，提高各种营养素的消化率，

从而提高肉鸡的生产性能。5021以蛋白酶、淀粉酶为主，辅助以木聚糖酶，主要针对肉禽玉米-豆粕型日粮。本试验中，在标准日粮添加5021后动物的生长都得到了改善。本试验在小鸡阶段改善效果相对较小，在42天时体重有非常强的明显效果。

2.3.3.2酶制剂可以破坏植物细胞壁，使存在于细胞内的蛋白质、淀粉等大分子营养物质释放出来，被动物消化吸收。直接添加5021的标准日粮的饲料转化率提高接近显著，低标准日粮的饲料转化率提高显著。调低营养水平后添加5021可达到不加酶的标准日粮地生产水平。

2.3.3.3与对照组相比较，不仅能明显地提高鸡只成活率，同时还能明显地提高饲料的转化率，这得益于在对中国饲料市场的理解基础上对产品质量的改造与加强。

2.3.3.4与对照组产品相比能明显提高鸡只的经济效益，这表明添加能够取得更好的经济效益。

2.3.3.5在玉米-豆粕型日粮中，调低日粮营养水平2-3％的表观低谢能和粗蛋白后添加5021是可行的。

2.3.3.6通过观察，粪便排放量降低约5~10％。

2.4 5025在肉鸡混合谷物型日粮中的应用效果

2.4.1材料与方法

2.4.1.1试验用酶制剂

试验用酶制剂5025由东莞泛亚太生物科技有限公司提供。

2.4.1.2试验动物

选用7200只健康的、体重接近的AA肉鸡，随机分为4组处理；每组处理3个重复，每个重复600只肉鸡。

2.4.1.3试验日粮

(1)标准日粮：标准日粮由试验场提供；

(2)试验组日粮

试验组日粮A：由标准日粮直接加入5025组成；

试验组日粮B：由东莞泛亚太生物科技有限公司根据5025的特性，加入5025后对标准日粮配方进行调整，由试验场依据该配方生产提供。

(3)各组日粮的配方及营养水平见表17。

(4)小鸡阶段：0~28日龄喂碎料；中大鸡阶段：29~42日龄喂粒料。

表17  日粮的配方及营养水平

注：1、预混料中含有多种维生素、微量元素、石粉、磷酸氢钙、氨基酸、氯化胆碱、杆菌肽锌、黏杆菌素及载体。

2、5025的主要成分为：α-淀粉酶、枯草杆菌蛋白酶、阿拉伯木聚糖酶。

2.4.1.4饲养管理

每日自由采食和饮水。免疫与饲养按饲养场常规进行。

2.4.1.5指标

(1)观测指标：分别在28、42日龄测定体重、采食量及料重比。

(2)观察项目：粪便排放量。

2.4.1.6试验时间及地点

(1)试验时间：2005年6月10日～2005年7月30日，为52天；

(2)试验地点：山东某商业鸡场。

2.4.2试验结果见表18：

表18试验结果

2.4.3结论

2.4.3.1添加酶制剂可以补充内源酶的分泌，提高各种营养素的消化率。

5025以木聚糖酶、蛋白酶、淀粉酶为主，主要针对肉禽混合谷物型日粮(谷物副产品10％-30％)。本试验中，在标准日粮和低标准日粮中添加5025后动物的生长都得到了改善。本试验在小鸡阶段改善效果相对较小，在42天时体重有非常强的明显效果。

2.4.3.2酶制剂可以破坏植物细胞壁，使存在于细胞内的蛋白质、淀粉等大分子营养物质释放出来，被动物消化吸收。直接添加5025的标准日粮的饲料转化率提高接近显著，低标准日粮的饲料转化率提高显著。调低营养水平后添加5025可达到不加酶的标准日粮地生产水平。

2.4.3.3在混合谷物型日粮中，调低日粮营养水平2-3％的表观低谢能和粗蛋白后添加5025是可行的。

2.4.3.4通过观察，粪便排放量降低约5~10％。

根据上述实验确定的复合酶组分及加工方法，可批量生产上述组分的复合酶。

2.5酶制剂产品中试验证试验总结

为了进一步验证酶制剂在猪和肉鸡的不同生长阶段、不同日粮中的应用和在大规模生产中应用的可行性，共采用了杜长大仔猪120头和中大猪360头、AA肉鸡25200只，分别在广东省佛山和山东省诸城的商业养殖场进行验证试验。试验结果总结如下。

2.5.1用更经济的谷物副产品及杂粕替代优质原料，充分利用饲料资源

在动物日粮中，通过添加产品，利用谷物副产品、杂粕等替代玉米、豆粕、鱼粉等原料，降低日粮中2~3％的能量和粗蛋白质的含量，动物的生产水平均比用原日粮的有提高。平均日增重提高了3.7~8.2％，平均提高了5.3％；料重比降低了3.96~5.7％，平均降低了4.2％。在仔猪验证试验中，调整日粮加PK100组与对照组的试验证明，平均日增重增加25g，为8.2％，料重比降低0.07，为4.1％；在中大猪验证试验中，调整日粮加2327组与对照组的试验证明，平均日增重增加12g，为3.7％，料重比降低0.12，为5.4％；在混合谷物日粮肉鸡的验证试验中，调整日粮加5025组与对照组的试验证明，料重比降低0.02，为5.7％；在玉米-豆粕日粮肉鸡的验证试验中，调整日粮加5021组与对照组的试验证明，平均日增重增加2.23g，为4.8％，料重比降低0.04，为3.96％。

2.5.2减少氮、磷等元素的排泄，保护环境生态

在动物日粮中，通过添加产品，可提高养分的利用率，减少粪便的排泄量，改善了动物舍内的环境，也减轻对大气环境的污染。通过试验与观察，在动物日粮中添加产品，可以减少粪便的排泄量5~10％。

2.5.3提高生产水平，降低饲养成本

在动物日粮中，通过添加产品，提高了养分的利用率，降低了日粮中的营养水平，从而降低了饲料成本。几个验证试验结果表明，添加了产品后，提高了动物的生产水平，降低了单位增重成本2~7％。

2.5.4在动物日粮中，通过添加产品，补充了仔猪阶段淀粉酶、蛋白酶等分泌量不足，减少了后段肠道的养分浓度，减少了病源微生物菌群，降低了仔猪的腹泻率。调整日粮加PK100组仔猪腹泻率显著低于对照组，比对照组下降了47.68％。在肉鸡的验证试验中，通过添加产品，消除了非淀粉多糖抗营养作用，提高了饲料中的营养素的消化率和动物的生产性能以及免疫力，从而提高了肉鸡的成活率。调整日粮加产品组的肉鸡成活率显著高于对照组，提高了4.05％。

综合上述验证试验结果，在动物日粮中添加酶制剂产品，可获得良好的生产性能和经济效益，并可以减少动物粪便的排放量，生态效益显著。可见该产品技术成熟，已可在饲养业和饲料大规模生产中推广应用。

2.6酶制剂产品的推广应用

作为饲用复合酶制剂系列产品的研发，根据养殖业、饲料工业和环境保护的需要，采取边研发、边推广的方式，研制出一系列饲用复合酶产品供饲料加工企业使用，取得了良好的效果。

自该项目开始推广以来，先后联合东莞兴业生物科技有限公司、深圳安佑公司、大北农集团、湖南正虹科技发展股份有限公司、岳泰集团等10多个单位30多人参加了项目的研究与推广工作。共生产应用饲用复合酶制剂的各类饲料150万吨，其中猪用饲料98万吨，占65.21％；禽用饲料49万吨，占32.96％；其它动物饲料饲料2.7万吨，占1.83％(部分汇总见表19)。的产品已推广到湖南、广东、上海、北京、天津、福建、安徽、湖北、河南、河北、山东、辽宁、吉林、黑龙江、江西、河北、广西、海南、等全国大部分省市的饲料厂和养殖场。

在该产品的应用过程中，各地饲料厂也对产品进行了对比试验，均取得了预期的效果，达到了预期的目的。在福建海新集团进行的5021在肉鸡饲养的试验中，日增重提高了2.56％，饲料转化率提高了3.7％，成活率提高了0.5％；在沈阳众友饲料有限公司对PK100进行了仔猪的饲养试验。其试验结果为，调整日粮(与标准日粮比较，粗蛋白质含量降低1.12％；消化能降低45千卡/千克)与对照组比较，平均日增重提高0.8％，饲料转化率提高1.25％，腹泻率下降33％，每公斤增重成本降低2.6％。在新郑银发饲料有限公司的试验中，肉鸡的日增重提高了4.9％，饲料转化率提高了5.4％，生长肥育猪的日增重提高了10.8％，饲料转化率提高了6.78％。从几个试验的平均结果畜禽的日增重提高了4.76％，饲料转化率提高了4.28％。各地饲料厂普遍反应，在饲料中添加产品，可以提高畜禽的日增重，提高饲料的转化率，减少了畜禽粪便的排泄量。

通过推广试验和各饲料厂的生产试验证明，在饲料中添加本产品，在保持原料成本不变得情况下，可使日增重平均提高5.3％，饲料转化率提高4.2％，降低单位增重成本约3.4％。按每头猪出栏时为100kg，售价为4.5元/kg计算，每头猪可节约养殖成本15.3元。以2004年我国生猪出栏量计算，全国生猪出栏量约为53840万头，若全部应用 酶制剂，即可降低养殖成本82375万元。同时减少了粪便的排放量5~10％，改善了生态环境。

如本发明上述实施例所述的相同或近似的方法，以及与本发明上述实施例相同或近似的猪用配合饲料生产方法，或采用与本发明上述实施例相同或近似的生产方法及配方得到的猪用配合饲料，均在本发明保护范围之内。