川牛膝药材指纹图谱的构建方法及其标准指纹图谱

技术领域

本发明涉及中药材的指纹图谱技术领域，尤其是一种川牛膝药材指纹图谱的构建方法及其标准指纹图谱。

背景技术

中药虽然已有几千年的应用发展历史，但如何有效地评价中药/中药材质量的好坏，一直是中药研究与应用的重点与难点问题。随着科技的发展，指纹图谱质控技术在中药领域被提出并得到广泛认可，其在中药材及其提取物/制剂等质控中的应用也越来越多，它为中药材及其相关产品的质量控制及评价提供了新的思路和方法。

就如每个人都有指纹，但每个人的指纹却各不相同；每一味中药材也都具有自己的“指纹”。但中药材的指纹却并不是直观的，并且由于每一味中药材的特性和有效成分千差万别，对其指纹图谱的构建方法显然也不可能一概而论，而是需要针对其不同中药材不同的特性及有效成分甚至所含杂质等情况，设计特定的提取分离等前处理方法及相应的指纹图谱测定方法，从而分别确立适合每一味中药材的指纹图谱构建方法及其标准指纹图谱，其所获得的指纹图谱必然也是千差万别。

目前获得指纹图谱的主要手段是色谱法和光谱法，其中比较常用的有以下几种：

(1)薄层色谱法：常用于中药中各种成分的鉴定。

(2)高效液相色谱法：是构建指纹图谱的主要方法之一。由于中药成分的复杂性，构建指纹图谱一般采用梯度洗脱，因为逐步提高流动相洗脱能力可获得较多色谱峰，提供更多指纹信息。

(3)气相色谱法：适合于挥发性药材及制剂的指纹图谱研究。

(4)毛细管电泳技术：已用于中草药中生物碱、黄酮/黄酮苷、酚酸、香豆素、醌类、强心苷、葡萄糖异硫氰酸盐等物质的分析。

(5)红外光谱法：可用于药材鉴定和成药鉴别。但红外光谱是由分子的振动-转动跃迁引起的，确定其专属性和特征性有较大困难。

(6)紫外光谱法：是电子光谱，形状变化不大，有时不同的化合物有相似的图谱，专属性差。

(7)分子生物学方法：不同生物体有各自相对稳定的DNA序列，因而可以利用现代分子生物学技术构建DNA指纹图谱。限制性内切酶片段长度多态性(RFLP)技术和随机扩增多态DNA(RAPD)是目前最常用的构建DNA指纹图谱的方法。但RFLP技术繁琐，要求的DNA量大，实验材料必须新鲜，因此其应用受到限制；而RAPD法可以在特异DNA序列尚不清楚的情况下检测DNA的多态性，具有灵敏度高、多态性强的优点，同时分析的是基因型而非表现型，结果不受材料来源、环境因素、样品形态等影响，为干燥药材鉴定提供了更加准确的手段。但RAPD法的重复性差等问题引起了许多争议。

色谱法与DNA指纹图谱相比其优点在于：不但有特征的体现((各种化学成分的个数和相对位置--保留时间)可作定性鉴别使用，还可体现量的概念。

但是，应用色谱技术构建指纹图谱时，色谱图中各色谱峰的保留值通常会受各种因素的影响，包括一系列的操作因素，甚至色谱柱本身在实验过程中的变化等。并且因为中药材是生物样品，存在明显的个体差异，再加上产地、批次、运输、贮存等的不同，即使同种中药也会出现不同的色谱峰，不同种中药有时会出现相同的色谱峰。所有这些都给指纹图谱的分析带来了巨大的困难。解决这一难题就需要进行大批量实验研究、收集大批量仪器分析数据，并对大批量仪器分析数据进行处理，从中提取特征信息，进而加以识别，从而确立专属性强、并且稳定有效的指纹图谱构建方法，得到可有效用于中药材质量评价的标准指纹图谱。

川牛膝(Cyathula officinalis Kuan.)为苋科(Amaranthaceae)杯苋属(CyathulaBlume)多年生草本植物，别名甜膝。主要分布于四川、云南和贵州，野生或栽培，生长于海拔1500米以上的地区，为著名的川产地道中药材，是极常用且是重要的出口品种。1977年以后各版《中国药典》确定川牛膝植物来源为C.officinalis Kuan.。川牛膝的主要成分为生物碱和甾醇类物质，如杯苋甾酮(cyastelone)、头花蒽草甾酮、促脱皮甾酮、红甾酮等，另外还有阿魏酸；现代研究还从川牛膝根中提取出一种生物活性多糖--牛膝多糖(Achyranthes bidentata Polysaccharides，ABP)。川牛膝的主要药理作用有活血通经、祛风湿、通利关节、利尿通淋，以及对高血压性心脏病和痛经等疾病的治疗作用。

由于在栽培过程中容易产生品种混杂，不同地区用药习惯的不同造成品种混乱、以及采收/运输/贮存条件等原因，川牛膝的商品品种较为混乱，其质量各不统一，有时差异甚大。另一方面，中华人民共和国药典2005年版一部收载的“川牛膝”品种项下，对川牛膝的质量控制也显得非常薄弱，只包括显微鉴别以及水分、灰分、浸出物等常规性检查，缺乏完善的质量评价体系，难以达到对川牛膝质量的有效控制。

发明内容

本发明的目的就是针对上述川牛膝缺乏完善的质量评价体系，难以有效控制其质量的问题，提供一种川牛膝药材指纹图谱的构建方法，以此达到完善其质量评价体系、有效控制川牛膝药材质量的目的。

在此基础上，本发明进一步的目的还提供了一种基于上述指纹图谱构建方法得到的标准指纹图谱。

为了实现上述发明目的，本发明采用的技术方案如下：

川牛膝药材指纹图谱的构建方法，包括下述主要步骤：

(1)标准品溶液的制备：

以杯苋甾酮为标准品，称取杯苋甾酮标准品，置于容量瓶中，加75％-100％甲醇(当其溶液低于100％时，均是指体积百分比浓度的甲醇水溶液，下同)溶解并定容，使浓度为0.4mg/ml-0.6mg/ml，摇匀，制成标准品溶液；

(2)样品供试溶液的制备：

取川牛膝药材粉末0.9g-1.1g，加入75％-100％甲醇5ml，振荡均匀，超声提取20min-40min，离心(使固液分离)，取上清液以微孔滤膜(主要是为了去除可能堵塞色谱柱的大分子物质，目前常用的各种规格的微孔滤膜均可使用)滤过，滤液作为川牛膝样品供试溶液；

由于指纹图谱中均是采用相对保留时间和相对峰面积来表征各特征峰，主要和药材中各成分之间的含量比例、HPLC条件等相关，对样品供试溶液制备过程中的取样量、提取溶剂的加入量、提取时间、离心时间、微孔直径等可能轻微影响到提取率及含量测定准确度的一些参数条件，无需过于严格要求。

(3)HPLC检测：

分别吸取上述标准品溶液和样品供试溶液，分别注入高效液相色谱仪中进行高效液相色谱检测，记录39min内的HPLC图谱；

其中，色谱条件为：

色谱柱为C₁₈反相色谱柱；柱温为30℃；检测波长为266nm；流动相为不同浓度的甲醇-水溶液，流速为0.8ml/min；

采用非线性梯度洗脱方式，在检测时间内、不同时间段的流动相变化如下：

0～5min：甲醇浓度(体积百分比浓度，下同)由5％匀速变至46％，

5～32min：甲醇浓度由46％匀速变至66％，

32～40min：甲醇浓度由66％匀速变至100％。

通过对上述构建方法中步骤(3)记录得到的大量样品的HPLC图谱进行解析，确定共有指纹特征(主要包括特征峰的确定、与标准品相比其余特征峰的相对保留时间及相对峰面积等)，即可得到川牛膝药材的标准指纹图谱。

基于上述川牛膝药材指纹图谱的构建方法，发明人采集了大量川牛膝药材样品，通过大批量实验研究、收集大批量仪器分析数据，并对大批量仪器分析数据进行处理，从中提取特征信息，进而加以识别、计算，不仅进一步确立、验证了该专属性强、且稳定有效的川牛膝药材指纹图谱构建方法，并且得到了可有效用于川牛膝药材质量评价的标准指纹图谱。

通过分析比较，确定了川牛膝药材的标准指纹图谱具有如下10个共有特征峰，其中第8个为杯苋甾酮的特征峰，以此杯苋甾酮特征峰为参照，计算其余9个特征峰相对应的相对保留时间和相对峰面积。所得结果见下述表1：

表1 川牛膝药材标准指纹图谱

标准指纹图谱中确定的上述10个共有特征峰具有广泛的代表性，在发明人自行采集的大量川牛膝药材和市场购得的川牛膝药材/饮片样品检测结果中均得到了证实，因此该指纹图谱可用于正品川牛膝药材或饮片质量的评价和控制。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：

本发明确立了川牛膝药材指纹图谱的构建方法，通过该方法可获得川牛膝药材的标准指纹图谱，完善了川牛膝药材的质量评价体系，为川牛膝药材及其饮片质量的全面有效控制提供了理论和实践基础。

在此指纹图谱构建方法基础得到的川牛膝药材的标准指纹图谱，进一步完善了川牛膝药材的质量评价体系，有利于川牛膝药材及其饮片的质量控制。

附图说明

图1是利用中药色谱指纹图谱相似度评价系统(A版)处理所得的本发明川牛膝药材共有模式特征指纹图谱，图中的1-10分别对应特征峰编号1-10；

图2是27批栽培及4批市售川牛膝药材/饮片的HPLC指纹图谱；

图3是3批野生川牛膝药材的HPLC指纹图谱与川牛膝标准指纹图谱的对比示意图。