一种硫代阿德福韦、替诺福韦肝靶向酯前体药物

四、具体实施方式

下面的实施例可以对本发明进行进一步的描述，然而，这些实施例不应作为对本发明范围的限制。

制备例1：硫代替诺福韦的制备

1.1、(R)-1，2-丙二醇的制备

将氢化釜中空气用N₂置换后充N₂，加入5％Pd载于活性炭(50％湿含量)催化剂100g悬浮于NaOH乙醇溶液(由7.85Kg乙醇和16.7％NaOH溶液54g组成)的悬浮液，搅拌降温至0℃(通常-5～0℃左右)，再加入(S)-缩水甘油1.0Kg(13.5mol)，然后用H₂置换釜中N₂3次，充H₂(压力≤13.79KPa或≤20psi)反应，反应温度控制不超过25℃。充H₂反应至不再消耗氢气时为反应终点。反应毕，将反应液通过硅藻土(150g)过滤出固体不溶物，滤液于50℃真空蒸除溶剂，得油状物R)-1，2-丙二醇粗品1.0Kg左右，収率100％。无需进一步纯化，直接用于下一步反应。

1.2、(R)-1，2-亚丙基碳酸酯的制备

在反应釜中加入上步制备的化合物R)-1，2-丙二醇1.0Kg(上步制备的一批量)，搅拌，再加入二乙基碳酸酯1.78Kg(15.1mol)和乙醇钠的乙醇溶液【21％(质量分数)乙醇钠乙醇溶液】210g，加毕，搅拌升温至80～150℃，过程中蒸馏出乙醇，为了使反应完全，可向反应混合物补加二乙基碳酸酯0.16Kg。用TLC跟踪确认反应终点【即(R)-1，2-丙二醇斑点消失】。反应毕，蒸除乙醇后的剩余物经真空蒸馏，收集120℃/1.333～2.666KPa(10～17mmHg)馏分，得无色液体R)-1，2-亚丙基碳酸酯，其纯度为98.6％(GC分析)。

1.3、对甲苯磺酰氧甲基硫代磷酸二乙酯的制备

在N₂保护下向反应器内加入硫代磷酸二乙酯0.95Kg和甲苯1.25Kg，将反应液冷至1℃左右(一般可在-2～4℃)，加入对甲苯磺酰氯1.0Kg，然后在5℃慢慢加入三乙胺0.82Kg(放热反应)，加时应维持温度不超过10℃(一般0～0℃)，加毕，升温至22℃，在该温度搅拌反应8h，直到反应完全(TLC)跟踪确认)。反应毕，过滤，滤饼用甲苯0.34Kg洗涤，合并洗液和滤液用水1.15Kg洗涤，5％Na₂CO₃溶液3.38kg洗涤，最后用水(1.15L×2)洗涤。每次洗涤时应将反应器内容物搅拌片刻，静置分层，将水层分出弃去【如果溶液呈乳状液可加入盐水(NaCl 0.08Kg和水0.23Kg)处理】。分取有机层，将其于低于50℃下真空蒸馏(样品在110℃LOD不大于10％，按KF滴定，水分含量不超过0.3％)。得油状物(对甲苯磺酰氧甲基硫代磷酸二乙酯)，收率约60％～70％，其纯度为93.6％，(GC分析)，甲苯除外。

1.4、(R)-9-[2-(二乙基硫代膦酰基甲氧基)丙基]腺嘌呤的制备

在N₂保护下向反应器中加入腺嘌呤1.0Kg(7.33mol)、NaOH 11.8g、第二步制备的化合物(R)-1，2-亚丙基碳酸酯0.83Kg(7.81mol)和N，N-二甲基甲酰胺(DMF)6.5Kg，开动搅拌，加热至130℃左右(通常在125℃～138℃)，在该温度范围搅拌反应18～30h。用HPLC跟踪，若试样中腺嘌呤含量不超过0.5％，则反应基本到终点。反应毕，冷却至25℃(一般20～30℃)，此时反应液有沉淀析出，即为中间体(R)-9-(2-羟丙基)腺嘌呤(028-3)。冷却后，向上述反应液(含中间体(R)-9-(2-羟丙基)加入2mol/L叔丁醇锂的THF溶液3.62Kg，搅拌反应(轻度放热反应)，制得(R)-9-(2-羟丙基)腺嘌呤锂盐的浆状物。向浆状物中加入第三步制备的对甲苯磺酰氧甲基硫代磷酸二乙酯1.19Kg，将该混合物加热至32℃(通常30～45℃)，在32℃搅拌反应3h。在反应期间反应液变成均相溶液，再补加对甲苯磺酰氧甲基硫代磷酸二乙酯1.43Kg，在32℃(一般30～45℃)搅拌反应2h。补加2mol/L叔丁醇锂的THF溶液0.66Kg和对甲苯磺酰氧甲基硫代磷酸二乙酯0.48Kg(分两次加入)，将混合物在32℃搅拌反应2h以上，用HPLC跟踪，取样分析中间体(R)-9-(2-羟丙基)腺嘌呤含量低于10％则反应基本完成，如果反应未完成，再补加2mol/L叔丁醇锂的THF溶液0.33Kg和对甲苯磺酰氧甲基硫代磷酸二乙酯0.24Kg，在32℃再搅拌反应2h，反应则完成。然后将反应混合物冷却至25℃(通常为20～40℃)，加入冰醋酸0.5Kg。将混合物真空浓缩(≤80℃/98.21KPa)，剩余物冷却至50℃(通常约40～60℃)，加水1.8Kg，并补加水1.8Kg漂洗反应液。然后将溶液用二氯甲烷35K连续分次提取36～48h。提取期间5h后和10h后间断地加入冰醋酸0.2Kg(加入到水相中)。合并二氯甲烷提取液，首先常压浓缩，然后在真空下浓缩(提取液内温不超过80℃)，得黏稠橙色油状物(R)-9-[2-(二乙基硫代膦酰基甲氧基)丙基]腺嘌呤，收率约40％～45％，其纯度为60％～65％(HPLC法)。(R)-9-[2-(二乙基硫代膦酰基甲氧基)丙基]腺嘌呤的实际产量近似于理论量的1.6倍(或预期产量的3.8倍)，增加的重量是因为在连续提取和浓缩后的残留剂和不纯物的存在所致，所得(R)-9-[2-(二乙基硫代膦酰基甲氧基)丙基]腺嘌呤粗品可直接用于下步反应。

1.5、(R)-9-[2-(硫代膦酰基甲氧基)丙基]腺嘌呤粗品的制备

在反应器中加入上步制备的化合物(R)-9-[2-(二乙基硫代膦酰基甲氧基)丙基]腺嘌呤粗品1.0Kg和乙腈0.9Kg，搅拌溶解，然后在冷却下控制温度不高于50℃下加入溴三甲基硅(TMSBr)1.56Kg(回流系统的管线等应预用乙腈0.3Kg洗涤过)。将混合物搅拌加热回流(约在60～70℃)反应2～4h(在搅拌时应控制中度搅拌，以防止反应器中物料飞溅)。用HPLC跟踪，当单乙基硫代PMPA和二乙基硫代PMPA总含量低于3％时，则反应完全。如果反应未完全，可补加溴三甲基硅0.04Kg，在中度搅拌下再回流反应1h。反应液中的易挥发组分在70℃以下蒸除，先用常压蒸馏(＜70℃)，然后用真空蒸馏(≤70℃/81.273～91.432KPa)，冷却至20℃(通常15～25℃)，向剩余物中加入水1.9Kg(加时放热)，加时保持温度不高于50℃。将混合物再冷至20℃搅拌下用二氯甲烷1.7Kg洗涤，搅拌30min后分出水相，通过1μm滤筒过滤器过滤，加水3.2Kg稀释，加热到约40℃(一般35～50℃)用NaOH水溶液调至pH1.1(一般0.9～1.3)，大约用NaOH水溶液(50％)0.15Kg，并保持温度45℃左右。当有少许结晶时，用50％NaOH水溶液(约0.15Kg)调至pH2.8(一般2.6～3.0)，且温度保持45℃(一般35～50℃)。将混合物在慢速搅拌下于15～20h内降温至22℃左右，在此期间产物沉淀将析出，在35℃时将浆状液用50％NaOH水溶液或浓盐酸调至pH3.2(一般3.1～3.3)，如有必要，将浆状液冷至5℃，，把浆状物缓慢温和搅拌3h以上。过滤，依次用冷水0.35Kg和丙酮0.3Kg洗涤滤饼，抽干，得粗品(R)-9-[2-(硫代膦酰基甲氧基)丙基]腺嘌呤(为湿品)，其纯度为97％。将湿品于50℃下真空干燥，直至水分含量＜10％。1.6、硫代替诺福韦纯品的制备

在大反应瓶中加入水和粗品(R)-9-[2-(硫代膦酰基甲氧基)丙基]腺嘌呤1.00kg(按水分含量折算的干品量)，加热到110℃(一般95～110℃)，先温和地搅拌，后强搅拌，直至固体全部溶解，如未溶好，补加预热好的清水(95～100℃)，直至全溶。将溶液热过滤，热水(95～110℃)洗，洗液和滤液加热到100℃。在缓慢搅拌下约在3～5h内冷却，首先冷至30℃，然后连续冷却至10℃。在10℃保持至少3h。过滤收集析出固体，依次用冷水1.5Kg(0～10℃冷水)和丙酮1Kg洗涤滤饼，湿滤饼于50℃真空干燥(一般40～60℃)，干至水分含量约5.9％(一般3.9％～7.9％)，得纯的(R)-9-[2-(硫代膦酰基甲氧基)丙基]腺嘌呤一水合物，其纯度为98％.

制备例2：硫代阿德福韦的制备

参照实施例1.4～1.6的方法，由市售碳酸亚乙酯代替(R)-1，2-亚丙基碳酸酯制得阿德福韦。

制备例3：(S)-(-)-1-(3-氯苯基)-1，3-丙二醇的制备

3.1、3-(3-氯苯基)-3-氧代-丙酸的制备

在干燥洁净的5L三颈圆底烧瓶装上机械搅拌器和加料漏斗。通入氮气以赶走空气，向其中加入二异丙胺(424ml)和THF(1.2L)，将被搅拌的内容物冷却至-30℃，在搅拌下缓慢加入正丁基锂(1.23L，2.5M的己烷溶液)，并将温度保持在-30至-48℃。在完成加料后(30分钟)，用己烷(30ml)冲洗加料漏斗，然后将被搅拌的溶液冷却至-70℃，在搅拌下缓慢加入乙酸三甲基硅烷基乙酯(200g)，将温度保持在＜-70℃，在完成加料后(约30分钟)，将溶液在-70℃下搅拌15分钟。在搅拌下缓慢加入3-氯苯甲酰氯(197ml)，将温度保持在＜-70℃。在完成加料后(约1.5小时)，除去冷却裕，将反应溶液搅拌约1.5小时，同时逐渐升温至0℃，用冰浴冷却反应烧瓶，然后向被搅拌的溶液中加入水(1.5L)。将反应混合物搅拌20min，然后用叔丁基甲基醚(MTBE)(0.8L)稀释，分离下面的水箱，并转移至装有机械搅拌器的圆底烧瓶中，加入MTBE(1.3L)并在冰浴中将被搅拌的混合物冷却至＜10℃。加入浓HCl溶液(250ml12M的溶液)并剧烈搅拌该混合物。分离各层，将水相用浓HCl(40ml)进一步酸化并再次用MTBE(1.1L)萃取，将合并的MTBE萃取溶液用约10％的NaCl溶液(2L)洗涤，干燥(MgSO₄，100g)，过滤并在减压下进行浓缩，得到约503g的黄色固体，将粗品固体在己烷(3.5L)中制成浆液并转移至装有机械搅拌器的圆底烧瓶中，将混合物在＜0℃的温度下搅拌1h，然后过滤，用己烷(3×300ml)洗涤并室温减压干燥至恒重，即得487g淡黄色3-(3-氯苯基)-3-氧代-丙酸粉末状固体。

3.2、(S)-3-(3-氯苯基)-3-羟基丙酸的制备

於干燥洁净的10L三颈圆底烧瓶装上机械搅拌器和加料漏斗，用氮气冲洗并甲入上步所得的3-(3-氯苯基)-3氧代-丙酸(420g)和二氯甲烷(3.5L)。搅拌，将混合物冷却至-30℃，20分钟后将三乙胺(350ml)加入到混合物中，待所有的固体溶解，将(-)-β-氯二异松莰基硼烷的二氯甲烷溶液(1.60M，1.8L)装入到加料漏斗中，然后在搅拌下缓慢加入，同时将温度保持在-30至-35℃，在完成加料后(约1h)，将溶液升温至℃并搅拌，搅拌约6h后，将混合物用1M HCl(400ml)酸化并用乙酸乙酯(2000ml)萃取，分离有机相，通过MgSO₄塞进行过滤，并用氮气流浓缩，将剩余物溶解于CH₂Cl₂，用氮气流蒸发溶剂，向浑浊的橙色反应混合物中加入水(2L)，随后加入3M NaOH溶液(2.1L)。将混合物剧烈搅拌20分钟，然后将其转移至分液漏斗中，分离各层，用乙酸乙酯(2L)洗涤碱性的水相，用浓HCl(500ml)酸化水相，并用乙酸乙酯萃取(3次，每次1.0L)。合并3次的酸性乙酸乙酯萃取物，用饱和NaCl溶液(800ml)洗涤，用无水MgSO干燥，过滤并在减压下浓缩，得到428g的黄色油状物。冷却结晶，将所得固体在乙酸乙酯(600ml)中制成浆液，并转移至装有机械搅拌器的1L三颈圆底烧瓶中，将所得混合物在冰浴温度下搅拌8h，然后过滤，将收集到的固体用4∶1的己烷∶乙酸乙酯(3×100ml)洗涤并减压室温干燥至恒重，得415g淡黄色粉末固体(S)-3-(3-氯苯基)-3-羟基丙酸。

3.3、(S)-(-)-(3-氯苯基)-1，3-丙二醇的制备

於干燥洁净的10L三颈圆底烧瓶，安装上机械搅拌器、加料漏斗和温度计。将烧瓶用氮气冲洗并装入(S)-3-(3-氯苯基)-3-羟基丙酸2(412g)和THF(2000mL)，搅拌，溶液冷却至0～5℃(冰盐浴)。将1M硼烷的THF溶液(4.5L)装入加料漏斗中，然后在搅拌下缓慢加入，同时将温度保持在＜5℃。在完成加料后(约3h)，除去冷却浴，将溶液在室温下搅拌3h用水(1000mL)将反应溶液猝灭，然后加入6M NaOH溶液(600mL)。将混合物搅拌60min，观察到温度升高至约30℃，然后将混合物转移至分液漏斗中。分离各层，将水相再次用乙酸乙酯(2×800mL)萃取。将合并的有机相用饱和NaCl溶液(1000mL)洗涤，无水硫酸镁干燥，过滤并在减压下进行浓缩，得到365g浅黄色油状物(S)-(-)-(3-氯苯基)-1，3-丙二醇。

实施例1：(R)-9-{2-[2，4-顺式-(S)-(+)-4-(3-氯苯基)-2-硫代-1，3-二氧杂磷杂环己烷-2-基]甲氧基丙基}腺嘌呤的制备

1.1、硫代替诺福韦二氯化物的制备

於干燥洁净的5000mL的四颈圆底烧瓶，安装上机械搅拌器、回流冷凝管和加料漏斗。将烧瓶用氮气冲洗并装入制备例1化合物(280g)、二氯甲烷(2000mL)和N，N-二乙基甲酰胺(320g)，搅拌，将草酰氯(153mL)装入加料漏斗中缓慢滴入混合物中。约2h滴完，移去加料漏斗，将混合物搅拌加热回流6h，冷却，过滤，滤液浓缩至干即得硫代替诺福韦二氯化物，直接用于下一步。1.2、(R)-9-{2-[2，4-顺式-(S)-(+)-4-(3-氯苯基)-2-硫代-1，3-二氧杂磷杂环己烷-2-基]甲氧基丙基}腺嘌呤的制备

於干燥洁净的10L三颈圆底烧瓶，装上机械搅拌器、温度计和加料漏斗。用氮气冲洗并加入制备例3的化合物(180g)和二氯甲烷(4600mL)。将该溶液冷却至0～10℃。加入四氯化钛(70mL)，在约10min后形成沉淀。加入三乙胺(250mL)，沉淀溶解，溶液变成紫色。5h左右将该紫色溶液滴加到上步硫代替诺福韦二氯化物(270g)的3000ml的二氯甲烷溶液中。开始的温度是10℃，最后的温度是37℃。冷却至室温后将反应在室温下搅拌4h，然后滴入甲醇(300mL)。用水(3×700mL)洗涤反应混合物，分离有机层。用氯仿(3×800mL)萃取水相。将合并的有机相用饱和氯化钠(3×700mL L)洗涤。合并的有机相，无水硫酸镁干燥，通过硅藻土(Celite521)过滤，在减压下浓缩，得到135g淡黄色油状物(R)-9-{2-[2，4-顺式-(S)-(+)-4-(3-氯苯基)-2-硫代-1，3-二氧杂磷杂环己烷-2-基]甲氧基丙基}腺嘌呤。

含量测定：

HPLC条件：CHIRALPAK IC共价键手性合柱，250×4.6mm

流动相：溶剂A＝20mM磷酸钾，pH 6.2；溶剂B＝乙腈

梯度：10～60％B/15min，60～10％B/2min，10％B/3min，1.4ml/min。

检测波长：272nm    样品配制：适量，溶于甲醇制成溶液

进样体积：20μL

检测结果：含量顺式97.3％21.1min出峰，反式1.8％21.7min出峰

¹H-NMR(400MHz，CDCl₃)：

δ1.28(3H，二重峰，J＝7.5Hz，13号氢)；δ1.96～2.16(2H，多重峰，22号氢)；δ2.69～2.74(1H，多重峰，22号氢)；δ3.53～3.62(2H，多重峰，15号氢)；δ3.79～3.85(2H，，多重峰，21号氢)；δ3.98～4.04(2H，多重峰，11号氢)；δ4.67～4.73(1H，三重峰，J＝8.1Hz，19号氢)；δ7.19～7.72(4H，，24、26、27、28号氢)；δ8.76(1H，，单峰，2号氢)；δ8.96(1H，，单峰，8号氢)。

MS：m/z(M⁺)453.5(100％)，455.3(33.1％)。

实施例2：9-{2-[2，4-顺式-(S)-(+)-4-(3-氯苯基)-2-硫代-1，3-二氧杂磷杂环己烷-2-基]甲氧基乙基}腺嘌呤的制备

参照实施例1的方法，由硫代阿德福韦代替硫代替诺福韦制得目标化合物9-{2-[2，4-顺式-(S)-(+)-4-(3-氯苯基)-2-硫代-1，3-二氧杂磷杂环己烷-2-基]甲氧基乙基}腺嘌呤。

含量测定：

HPLC条件：CHIRALPAK IC共价键手性合柱，250×4.6mm

流动相：溶剂A＝20mM磷酸钾，pH 6.2；溶剂B＝乙腈

梯度：10～60％B/15min，60～10％B/2min，10％B/3min，1.4ml/min。

检测波长：270nm    样品配制：适量，溶于甲醇制成溶液

进样体积：20μL

检测结果：含量顺式96.4％，17.3min出峰，反式2.6％17.8min出峰

实施例3：(R)-9-{2-[2，4-顺式-(S)-(+)-4-(3-氯苯基)-2-硫代-1，3-二氧杂磷杂环己烷-2-基]甲氧基丙基}腺嘌呤富马酸盐的制备

将(R)-9-{2-[2，4-顺式-(S)-(+)-4-(3-氯苯基)-2-硫代-1，3-二氧杂磷杂环己烷-2-基]甲氧基丙基}腺嘌呤45g和无水乙醇600ml放入1000ml三口烧瓶中，搅拌溶解，加入5.6g富马酸，强烈搅拌，加热至回流，15min后，冷却至50℃左右搅拌3h，然后慢速搅拌下于30min内冷至25℃，再在1h内冷至5～10℃。当晶体开始形成，停止搅拌，将混合物在0℃静置10h，过滤，固体用冷的乙醇洗涤，真空50℃干燥得淡黄色固体结晶36g。HPLC手性纯度，99.1％。

实施例4：(R)-9-{2-[2，4-顺式-(S)-(+)-4-(3-氯苯基)-2-硫代-1，

3-二氧杂磷杂环己烷-2-基]甲氧基丙基}腺嘌呤甲磺酸盐的制备

参照实施例3的制备方法，以甲磺酸代替代替富马酸，制得目标化合物的甲磺酸盐，即R)-9-{2-[2，4-顺式-(S)-(+)-4-(3-氯苯基)-2-硫代-1，3-二氧杂磷杂环己烷-2-基]甲氧基丙基}腺嘌呤甲磺酸盐，淡黄色结晶性粉末，其纯度为98.9％，(HPLC法)。

实施例5：9-{2-[2，4-顺式-(S)-(+)-4-(3-氯苯基)-2-硫代-1，3-二氧杂磷杂环己烷-2-基]甲氧基乙基}腺嘌呤富马酸盐的制备

参照实施例3的制备方法，以9-{2-[2，4-顺式-(S)-(+)-4-(3-氯苯基)-2-硫代-1，3-二氧杂磷杂环己烷-2-基]甲氧基乙基}腺嘌呤代替代替(R)-9-{2-[2，4-顺式-(S)-(+)-4-(3-氯苯基)-2-硫代-1，3-二氧杂磷杂环己烷-2-基]甲氧基丙基}腺嘌呤，制得目标化合物的富马酸盐，淡黄色结晶性粉末，其纯度为99.3％，(HPLC法)。

实施例6：体内抗鸭乙型肝炎病毒(DHBV)的药理活性评价

材料和方法

受试药物：实施例1、实施例2的化合物，硫代阿德福韦酯、硫代替诺福韦酯、阿德福韦酯、替诺福韦酯，以无菌蒸馏水与丙二醇适宜比例配成所需浓度。

实验动物：；1日龄广州麻鸭，体重：40～50g；性别：均为雄性.

毒种：上海麻鸭乙型肝炎病毒，强阳性血清(北京医药生物技术研究所)，一70℃保存

试验方法：鸭乙型肝炎病毒感染：1日龄广州麻鸭，经腹腔注射上海麻鸭-阳性血清，每只0.2ml，在感染后7天取血，分离血清，-7℃保存待检，感染的饲养至两周作为实验动物。

测定方法：取感染阳性鸭35只随机分成7组，分设为：病毒对照组1组，用淀粉胶囊；阳性对照组，分别是阿德福韦酯对照组与替诺福韦酯对照组个1组；实施例1化合物、实施例2的化合物，硫代阿德福韦酯、硫代替诺福韦酯、实验组各1组。剂量均按照同摩尔浓度给药。实验时间为14天，停药后观察7天，

观察指标：血清DHBV DNA改变情况。在用药前、用药7天、用药14天、停药5天分自鸭腿胫静脉取血，分离血清，-70℃保存待检。采用杂交斑点吸光度值法，同时用DSQO软件对半点进行定量分析。结果如下表：

实验结果表明：实施例1化合物与实施例2化合物的抗DHBV病毒活性明显优于对照组。