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法律状态信息
法律状态
2013-07-17
授权
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2012-03-21
专利申请权的转移 IPC(主分类):C12N1/21 变更前: 变更后: 登记生效日:20120213 申请日:20080228
专利申请权、专利权的转移
2010-04-28
实质审查的生效 IPC(主分类):C12N1/21 申请日:20080228
实质审查的生效
2010-03-17
公开
公开
相关申请的相互参照
本申请主张2007年3月1日提出的日本特愿2007-50935号的优先权，其全部内容均作为公开特别援引到本说明书中。
技术领域
本发明涉及在多药运出蛋白缺损的宿主中整合来自异种生物的基因而得到的转化株、以及使用该转化株进行的底物化合物的微生物转化方法。
背景技术
通常制备化合物的方法例如有化学合成法和酶促合成法。为了制备可作为很多药物原料的化合物，高效率地进行原料化合物的区域特异性或立体特异性修饰，这是不可缺少的。关于这些反应，已知酶促合成法较为优异。
但是，以酶作为实际应用的催化剂在工业规模中使用时，必须考虑酶本身所具有的本质上的极限。即，酶的寿命短以及催化作用中必须有辅酶的问题。目前在使用酶的制备工艺设计中，如何延长酶的寿命、使酶活性持续的问题受到了较多关注。在酶促合成法中使用的大部分的酶在其催化作用中必须有辅酶，例如在氧化还原的酶促反应中，必须有NADH等吡啶核苷酸。这些辅酶通常价格昂贵，因此进行工业规模的酶促反应时辅酶的添加在成本上存在较大的问题。
作为为了克服这些酶促反应的极限的解决对策，建立了使用微生物、特别是大肠杆菌的细胞作为酶促反应场所的战略。即，通过将大肠杆菌用酶的基因转化，可以使目标酶在细胞内大量表达。这意味着可以在细胞内连续生产酶，只要细胞存活就可以维持酶活性。并且，通过细胞内的各种代谢反应，可以再生酶促反应所必需的辅酶。
将上述大肠杆菌的转化体在培养基中培养，使底物化合物与培养物接触，获得经修饰的该化合物，通过该“微生物转化”可以尝试生产可作为各种药物原料的化学物质。特别是使用由细胞色素P-450基因转化的大肠杆菌对疏水性或两亲性的化合物进行微生物转化的氧化反应在药物制备中很重要。
细胞色素P-450基因所编码的细胞色素P-450酶(以下简称为P-450酶)是还原型、结合有一氧化碳、在450nm附近显示索雷吸收带(索雷带)的一组含血红素的蛋白质的总称。P-450酶与很多动植物组织、霉菌、酵母的微粒体、一部分动物组织的线粒体的内膜结合，除此之外在某种细菌、霉菌中以可溶性的形式存在。
P-450酶具有各种底物特异性。是可以以各种各样的有机化合物作为底物的、显示异常广泛的底物特异性的酶，不过也存在只与比较有限种类的有机化合物反应的底物特异性非常严格的酶。有时还显示对反应部位的立体特异性(stereo-specificity)或区域特异性(regio-specificity)也优异的选择性。已知P-450酶的具体功能是通过催化单加氧反应，在表达该P-450酶的细胞内参与生物体内异物(异生素)的氢氧化、环氧化、去烷基化、脱氮等各种反应。
特别是来自微生物的P-450酶的一部分实际上已应用于有用化合物的工业生产。代表性的例子之一是放射菌链霉菌(Streptomycescarbophilus)的P-450酶，将作为底物的密实菌素(compactin)6β位进行氢氧化，作为产物生成高血脂的治疗药物普伐他汀(参照非专利文献1)。并且利用放射菌自养假诺卡氏菌(Pseudonocardia autotrophica)ATCC33795株的P-450酶，使维生素D3的1α位和25位进行氢氧化，生产活性型维生素D3的方法也已经得到实际应用。这些来自微生物的P-450酶与向其供给电子的电子传递系统(铁氧化还原蛋白和铁氧化还原蛋白还原酶)共轭才会催化其单加氧反应。
使用上述来自微生物的细胞色素P-450酶的化合物的微生物转化可使用表达该酶的微生物的培养液或菌体来进行。也可以使用将编码来自微生物的P-450酶的基因导入到适合作为宿主的放射菌变青链霉菌(Streptomyces lividans)中、表达该酶活性的培养液。但是，由具有上述基因的放射菌进行的底物化合物的微生物转化，由于放射菌特有的性质，培养和底物化合物向目标产物的转化需要很长时间。为了有效增加酶的表达量还必须对诱导酶表达的条件进行研究。并且，有时转化所使用的放线菌中存在代谢或分解底物化合物或目标产物的反应体系，这引起副产物的生成或底物化合物和目标产物的减少等，成为目标产物的生产性能降低的一个原因。
基于这些理由，人们希望构建培养所需时间较短、并且以被认为代谢或分解底物化合物和目标产物的反应体系少的大肠杆菌作为宿主的、可功能性表达来自微生物的细胞色素P-450基因的体系。关于上述体系，有人提出了共表达编码P-450cam的电子传递系统的camAB基因、功能性表达各种放射菌的细胞色素P-450基因的系统(参照专利文献1)。但是，该系统的微生物转化活性非常低，应用于工业生产时并不足够。也就是说，为了通过使用大肠杆菌的微生物转化来实际进行工业生产，必须进一步提高活性，其中所述大肠杆菌表达编码来自微生物的细胞色素P-450酶的基因。
作为上述目的的方法，还对于使底物主动地摄取到细胞内的方法进行了研究。例如已知表达lat基因的大肠杆菌具有将L-赖氨酸转化成L-2-哌啶酸的能力(参照非专利文献2)，其中，所述lat基因编码来自泥色黄杆菌(Flavobacterium lutescens)IFO3084株的L-赖氨酸-6-氨基转移酶；在使用该转化体的微生物转化反应中，为了使底物的L-赖氨酸主动地摄取到细胞内，通过对编码L-赖氨酸特异性透过酶的lysP基因进行扩增，可以使该微生物转化活性提高(参照非专利文献3)。
上述微生物转化中，显示底物分子向细胞内的膜转运是重要的问题，在用于药物制备的微生物转化中，对于常常作为底物化合物的亲水性或两亲性的化合物，大肠杆菌中并不存在使其主动地膜转运到细胞内的机制。有报道指出：在破坏了大肠杆菌的药物运出蛋白的株中，所给予的化合物(哺乳类的甾类激素)在细胞内的存在量升高(参照非专利文献4)。这显示被动地摄入到细胞内的化合物难以运出到细胞外，由此细胞内的存在量升高。
另一方面，有一个专利申请，其主要内容是：由编码药物运出蛋白的acrA、acrB或tolG基因的至少一个基因转化的大肠杆菌对有机溶剂产生抗性，可以高效率实施使用该大肠杆菌的双层系统(二系)的微生物转化(专利文献2)。由此很难推测破坏宿主微生物的多药耐药性蛋白对于微生物转化会产生什么样的影响。
专利文献1：国际公开第2003/087381号小册子及其英文家族US2006234337A1
专利文献2：日本申请公开平成11-221080(221080/1999A1)号公报
非专利文献1：Cloning，characterization and expression of thc gene encoding cytochrome P-450sca-2from Streptomyces carbophilus involved in production of pravastatin，a specific HMG-CoA reductase inhibitor.Gene.1995Sep 22；163(1)：81-85.
非专利文献2：Biotransformation ofL-lysine to L-pipecolic acid catalyzed by L-lysine 6-aminotransferase and pyrroline-5-carboxylate reductase.Biosci Biotechnol Biochem.2002Mar；66(3)：622-627.
非专利文献3：Increase in the rate of L-pipecolic acid production using lat-expressing Escherichia coli by lysP and yeiE amplification.Biosci Biotechnol Biochem.2002Sep；66(9)：1981-1984.
非专利文献4：Mammalian steroid hormones are substrates for the major RND-andMFS-type tripartite multidrug efflux pumps of Escherichia coli.JBacteriol.2006Feb：188(3)：1191-1195.
非专利文献5：Entry into and release of solvents by Escherichia coli in an organic-aqueous two-liquid-phase system and substrate specificity of the AcrAB-TolC solvent-extruding pump.J Bacteriol.2000Sep；182(17)：4803-10.
非专利文献6：Production of alpha，omega-alkanediols using Escherichia coli expressing a cytochrome P450from Acinetobacter sp.OC4.Biosci Biotechnol Biochem.2006Jun；70(6)：1379-1385.
上述专利文献1和2、非专利文献1～6的全部记载在这里均以公开的形式援引到本说明中。
本发明的课题在于提供改善在现有的使用整合来自异种生物的基因的转化体进行的微生物转化中可见的转化效率低的方法。
发明内容
本发明人等为解决上述课题，使用编码几种多药运出蛋白的基因中的任意一种的基因缺损的微生物作为宿主，向其中整合来自异种生物的基因，来制备转化体。发现该转化体可以高效率地将疏水性或两亲性的底物化合物转化成其目标化合物，从而完成了本发明。
即，本发明涉及以下的[1]～[9]。
[1]转化体，该转化体是向宿主微生物中整合来自异种生物的基因而得到的，其中，所述宿主微生物是编码多药运出蛋白的基因中的任意一种基因缺损的宿主微生物。
[2][1]所述的转化体，其中，编码多药运出蛋白的基因缺损的宿主微生物是大肠杆菌。
[3][1]或[2]所述的转化体，其中，编码多药运出蛋白的基因是选自tolC、acrA和acrB的任意一种基因。
[4][1]～[3]中任一项所述的转化体，其中，来自异种生物的基因是编码选自氧化还原酶、转移酶、水解酶、裂解酶、异构酶和合成酶的任意一种酶的基因。
[5][1]～[3]中任一项所述的转化体，其中，来自异种生物的基因是编码细胞色素P-450酶或氨基转移酶的基因。
[6][1]～[3]中任一项所述的转化体，其中，来自异种生物的基因是编码细胞色素P-450酶的基因。
[7]微生物转化方法，其使用[4]～[6]中任一项所述的转化体进行的微生物转化方法。
[8]微生物转化方法，其使用[4]～[6]中任一项所述的转化体进行的微生物转化方法，其特征在于：在底物化合物中单加氧。
[9][8]所述的方法，其中，底物化合物选自维生素D3、4-胆甾烯-3-酮和密实菌素。
以下通过说明本说明书中所述的术语、符号等的含义来详细地说明本发明。
本说明书中使用的“多药运出蛋白”包含革兰氏阴性细菌所具有的、主要使疏水性、两亲性的化合物由菌体内向菌体外排出的构成耐药性机制的全部蛋白。大肠杆菌中，TolC、AcrA、AcrB、EmrA、EmrB等属于该蛋白，在绿脓杆菌中，OprM、MexA、MexB等属于该蛋白质，但不限于此。
本说明书中使用的“来自异种生物的基因”包含由宿主微生物以外的生物分离或可扩增的全部基因。由生物的染色体DNA或质粒DNA中分离或扩增的基因、由mRNA扩增的基因等属于该基因，但不限于此。
本说明书中使用的“转化体”是指采用基因重组技术，以可表达的形式将来自其它生物的基因导入到特定的微生物中所得的微生物，在其中所使用的基因导入方法不只是使用质粒等载体的基因重组，也包含同源重组等方法。
本说明书中使用的“微生物转化方法”是指在培养基中培养转化体，使底物化合物与培养物接触，修饰该化合物，转化为目标化合物并获得该目标化合物的方法。
本发明中所述的“底物化合物”是指可通过各种微生物转化反应修饰的疏水性或两亲性的化合物。例如，来自异种生物的基因为P-450基因时，可以是己烷、庚烷、辛烷、壬烷等链烷化合物，甲苯、苯酚、枯烯等芳族化合物，胆甾醇、睾丸酮、4-胆甾烯-3-酮、脱氢表雄酮、维生素D2、维生素D3的甾类，亮氨酰基亮氨酸、亮氨酰基缬氨酸、聚亮氨酸、聚缬氨酸等直链肽类，脯氨酰基苯基丙氨酸、亮氨酰基丙氨酸等二肽进行环化稠合所得的二酮哌嗪类，环胞菌素、棘霉素等具有生理活性的环状肽类，蒎烯、莰烯、柠檬烯、香叶醇等单萜烯类；豚草烷(Ambrosane)、丁香烷(Caryophyllane)、补身烷(Drimane)等的倍半萜烯类，松香酸、赤霉酸等的二萜烯类，达玛烷、何帕烷、羊毛甾烷等的三萜烯类，密实菌素等的抑制素类，泰洛星、FK-506、红霉素等的大环内脂类，其它各种药物，或者它们的前体、代谢产物、衍生物等。
本说明书中使用的“基因的类似物”是指与原有的基因实质上具有同等功能的、
(1)与原有的基因在严谨条件下杂交的多核苷酸；
(2)具有与原有基因的碱基序列同源性为70％以上的碱基序列的多核苷酸；
(3)具有与原有的基因的碱基序列互补的碱基序列的多核苷酸；或者
(4)多核苷酸，该多核苷酸具有的碱基序列由于基因密码的简并，与原有的基因在严谨条件下不杂交，但是编码与(1)～(3)中任一项中定义的多核苷酸所编码的氨基酸序列相同的序列。
“在严谨条件下杂交的多核苷酸”是指例如以原有的基因作为探针，通过使用集落杂交法、噬菌斑杂交法或DNA杂交法等获得的多核苷酸，具体来说，是使用固定有来自集落或噬菌斑的多核苷酸的滤器，在0.7～1.0M氯化钠存在下、在65℃下进行杂交，然后使用0.1～2倍浓度的SSC溶液(1倍浓度的SSC溶液的组成包含150mM的氯化钠、15mM柠檬酸钠)，在65℃的条件下清洗滤器进行鉴定的多核苷酸。
根据本发明，可以制备以编码多药运出蛋白基因缺损的微生物作为宿主的、整合来自异种生物的基因的转化体，使用该转化体，可以高效率地将各种底物化合物转成目标化合物。
具体实施方式
以下对本发明的实施方式进行详细说明。
编码多药运出蛋白的基因缺损的宿主
本发明中，首先制备使作为宿主的微生物本来所具有的多药运出蛋白的功能丧失的宿主。该宿主是编码多药运出蛋白的基因的一部分或全部缺失，或者在该基因的内部插入其它的DNA进行分隔，或者在该基因中引入至少一个以上的突变，由此使该基因所编码的多药运出蛋白的功能的一部分或全部丧失(也称为被破坏)。对上述基因的功能被破坏的微生物并没有限定，可以采用公知的P1转导法或DNA的同源重组法来获得。作为宿主的微生物只要是可培养、并且与质粒或噬菌体DNA等载体用于插入基因的扩增的微生物即可，没有特别限定，例如有属于大肠杆菌、黄杆菌属(Flavobacterium)、假单胞菌属(Pseudomonas)、棒状杆菌属(Corynebacterium)的微生物，优选的例子是大肠杆菌。
对编码多药运出蛋白的基因并没有限定，例如来自大肠杆菌的有：SEQ ID NO：.22的碱基1～碱基1488的连续的碱基序列所示的、编码来自大肠杆菌K-12株的多药运出蛋白TolC的基因tolC，SEQ IDNO：.23的碱基329～碱基1522的连续的碱基序列所示的、编码来自大肠杆菌K-12株的多药运出蛋白AcrA的基因acrA，SEQ ID NO：.23的碱基1545～碱基4694的连续的碱基序列所示的、编码来自大肠杆菌K-12株的多药运出蛋白AcrB的基因acrB或它们的类似物。
上述得到的宿主微生物是多药运出蛋白的功能的部分或全部缺损，因此在微生物转化中底物化合物容易停留在微生物内，结果转化反应的效率提高，目标产物的生产效率也提高。
转化体的制备
接着，向所得的宿主中整合来自异种生物的基因或其类似物(以下也简称为异种基因等)，制备适合微生物转化的转化体。对将异种基因等整合宿主的方法没有特别限定，例如可以将该异种基因等插入到适当的载体中，通过原生质体法、电穿孔法整合到宿主中。对可以使用的载体的种类没有特别限定，例如可以是自主复制的载体(例如质粒等)，或者是导入到宿主中时整合到宿主细胞的基因组中，与整合的染色体一起复制，优选表达载体。表达载体中，异种基因等可以功能性连接转录所必须的要素(例如启动子等)。启动子在宿主细胞中是显示转录活性的DNA序列，可以根据宿主的种类适当选择。
来自异种生物的基因
整合到宿主中的异种基因等只要是参与将底物化合物转化成目标化合物的反应即可，没有特别限定，优选编码直接催化转化反应的各种酶的基因，例如有：氧化还原酶、转移酶、水解酶、裂解酶、异构酶或合成酶等。氧化还原酶只要是催化氧化还原反应的酶即可，没有特别限定，例如有细胞色素P-450酶或醛还原酶等。特别优选的是细胞色素P-450酶，其中有分类为CYP105家族和CYP107家族的细胞色素P-450。转移酶只要是将原子团(官能基团等)从某种分子转移到另一种分子上的酶即可，没有特别限定，可以是氨基转移酶(将底物化合物的α-氨基转移到2-氧化戊二酸上，底物化合物本身催化形成2-氧代酸的反应)或糖转移酶等。
水解酶只要是催化水解反应的酶即可，没有特别限定，有脂酶或淀粉酶等。裂解酶只要是催化原子基团的键解离的酶即可，没有特别限定，例如有碳酸水合酶(carbonate hydratase)等。异构酶只要是催化将某种异构体进行底物特异性异构化的反应的酶即可，没有特别限定，优选葡糖异构酶等。合成酶只要是利用ATP的水解能量，使两个分子键合的酶即可，没有特别限定，例如有DNA连接酶等。
转化体的培养
上述制备的转化体可以根据需要添加诱导物质等，在可以表达导入的基因的条件下、在适当的营养培养基中进行培养。该营养培养基含有适当的碳源、氮源、无机盐和天然有机营养物等，碳源可以使用葡萄糖、果糖、甘油、山梨醇、有机酸类等，氮源可以使用氨、尿素、硫酸胺、硝酸胺、乙酸胺等化合物，它们分别可以使用一种或两种以上。无机盐可以使用磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、硫酸镁、硫酸锰、硫酸亚铁等的盐类。并且，对使用菌具有生长发育促进效果的天然有机营养物可以使用蛋白胨、肉膏、酵母提取物、玉米浆、水解酪蛋白氨基酸等，进一步可以少量含有维生素类、核酸类。
使用转化体的微生物转化
接着，使表达这些基因的菌体与底物化合物接触，进行转换反应。转换反应的温度可考虑转化体的最佳温度而适当决定。反应时间也可考虑目标化合物的转化率(反应的进行程度)等而适当决定。宿主为大肠杆菌时，例如优选在20～37℃下、1～5天。并且反应方式可以是间歇式或连续式，也可以以任何形式实施。
生成的目标产物的分离和纯化通常可以利用将微生物代谢产物从其培养液中分离时所使用的分离、纯化的方法。例如使用甲醇、乙醇、丙酮、丁醇、乙酸乙酯、乙酸丁酯、氯仿、甲苯等的有机溶剂萃取，使用ダイヤイオンHP-20等疏水性吸附树脂的吸附脱吸附处理，使用セフアデツクスLH-20等的凝胶过滤色谱、活性碳、硅胶等的吸附色谱、或薄层色谱的吸附脱吸附处理，或者使用反相柱等的高效液相色谱等公知的所有方法均符合。另外，不特别限于这里所述的方法。可以将这些方法单独或组合成任意的顺序、还可以反复使用，由此可以分离、纯化目标化合物。
实施例
以下给出具体例子，对本发明进行更详细的说明，但并不是将本发明限定为这些例子。需要说明的是，下述例子中的百分号(％)在培养基的说明中表示重量百分号，在HPLC的流动相说明中表示容量百分号。
实施例1：大肠杆菌tolC破坏株的构建
通过P1转导法，将购自E.coli Genetic Stock Center(耶鲁大学)的大肠杆菌CAG12184(tolC::Tn10)株转移至BL21star(DE3)株上。即，在含有2.5mM氯化钙的L-培养基(1％聚胨、0.5％酵母提取物、0.5％氯化钠，pH7.2)上培养大肠杆菌CAG12184株，向0.2mL该培养液中添加P1噬菌体，在37℃下培养10分钟。将该反应液添加到加温至45℃的软琼脂(1％聚胨、0.5％酵母提取物、0.5％氯化钠、0.3％琼脂、2.5mM氯化钙、pH7.2)中，铺于含有2.5mM氯化钙的L-琼脂培养基(1％聚胨、0.5％酵母提取物、0.5％氯化钠、1.8％琼脂，pH7.2)上。将其在37℃下培养18小时，然后加入3mL L-培养基，破碎软琼脂，回收上清，制成tolC-噬菌体液。接着，将大肠杆菌BL21star(DE3)株(インビトロジエン公司)用含有2.5mM氯化钙的L-培养基培养，向0.1mL该培养液中添加tolC-噬菌体液，在37℃下培养10分钟。然后将菌体离心并回收，向其中加入1mL L-培养基，在37℃下培养1小时，然后铺于含有10μg/mL四环素的L-琼脂培养基中。在37℃下培养18小时，将出现的集落作为BLstarTolC株。BLstarTolC株是TolC功能缺损的tolC破坏株。
实施例2：大肠杆菌acrAB破坏株的构建
同样，通过P1转导法，从具有非专利文献5所述大肠杆菌JA300A(acrAB::cat)的大肠杆菌JA300A株转移至BL21star(DE3)株，将用含有5μg/mL氯霉素的L-琼脂培养基选择的株作为BLstarAcrAB株。另外，将acrAB::cat也转移至BLstarTolC株，将该株作为BLstarTolCAcrAB株。BLstarAcrAB株是AcrA功能和AcrB功能缺损的acrAB破坏株。BLstarTolCAcrAB株是TolC功能进一步缺损的TolC、acrAB破坏株。
实施例3：各种质粒的构建
(1)pETAciBC-SD载体
以下，所有的PCR反应均使用KOD#PLUS-DNA聚合酶(东洋纺公司)进行。
将质粒pDolABC(参照非专利文献6)用限制酶NcoI和BamHI处理，得到含有基因aciB(参照SEQ ID NO：.3的碱基1～碱基321)的DNA片段，其中基因aciB编码来自不动杆菌(Acinetobacter sp.)OC4株的铁氧化还原蛋白。将该片段通过T4DNA连接酶与大肠杆菌质粒载体pETduet-1(Novagen公司)的NcoI和BamHI位点连接，将该质粒作为质粒A。进一步以pDolABC为模板，使用引物A(参照SEQ IDNO：.6)和引物B(参照SEQ ID NO：.7)进行PCR，扩增含有基因aciC(参照SEQ ID NO：.3的碱基1978～碱基3192)的DNA片段，然后用限制酶BamHI和HindIII处理，其中基因aciC编码来自不动杆菌OC4株的铁氧化还原蛋白还原酶。将该片段通过T4DNA连接酶与质粒A的BamHI和HindIII位点连接，将所得质粒作为质粒B。接着，为了除去质粒B的两个T7启动子中后面一侧的一个，将质粒B用限制酶EcoRV和NotI处理，使用BKL试剂盒(宝酒造公司)使其平滑化，然后通过T4DNA连接酶连接，将所得质粒作为质粒C。另一方面，以自养假诺卡氏菌ATCC33795株的基因组DNA作为模板，使用引物C(参照SEQ ID NO：.8)和引物D(参照SEQ ID NO：.9)进行PCR，扩增作为间隔DNA序列的DNA片段，用限制酶BglII和BamHI处理。将该片段通过T4DNA连接酶与质粒C的BglII和BamHI位点连接，将所得质粒作为pETAciBC-SD载体。
(2)质粒pETAciBC-50AABP 195
以不动杆菌OC4株的基因组DNA作为模板、使用引物E(参照SEQ ID NO：.10)和引物F(参照SEQ ID NO：.11)进行PCR，扩增编码来自不动杆菌OC4株的链烷氧化性P-450酶AciA的N末端部分的DNA片段(SEQ ID NO：.3的碱基398～碱基541的DNA片段)，用限制酶NdeI和SpeI处理。另一方面，以指孢囊菌(Dactylosporangiumvariesporum)IFO14104株的基因组DNA为模板，使用引物BP195F(参照SEQ ID NO：.12)和引物BP195R(参照SEQ ID NO：.13)进行PCR，扩增编码P-450酶的BP195基因(参照SEQ ID NO：.2的碱基1～碱基1203)，用限制酶SpeI和BamHI处理。将这些DNA片段通过T4DNA连接酶与pETAciBC-SD载体的NdeI和BaHI位点连接，将所得质粒称作pETAciBC-50AABP 195。
(3)质粒pETAciBC-50AAvdh
以自养假诺卡氏菌ATCC33795株的基因组DNA作为模板，使用引物vbhF(参照SEQ ID NO：.14)和引物vbhR(参照SEQ ID NO：.15)进行PCR，扩增编码P-450酶的vdh基因(参照SEQ ID NO：.1的碱基320～碱基1531)，用限制酶SpeI和BglII处理。将这些DNA片段通过T4DNA连接酶与pETAciBC-50AABP 195的SpeI和BamHI位点连接，将所得质粒称作pETAciBC-50AAvdh。
(4)质粒pETduet-boxA
将质粒pETAciBC-SD载体用限制酶BamHI和HindIII处理，将含有基因aciC的DNA片段通过T4DNA连接酶连接，其中基因aciC编码与铁氧化还原蛋白还原酶具有同源性的蛋白，将所得质粒称作pETduetaciC。接着，使用引物boxBNcoF(参照SEQ ID NO：.16)、boxBBamR(参照SEQ ID NO：.17)和链霉菌(Streptomyces sp.)TM-7株的基因组DNA，扩增含有boxB基因(参照SEQ ID NO：.4的碱基1782～碱基1973)的DNA片段，用限制酶NcoI和BamHI处理，其中boxB基因编码附随在密实菌素氧化性P-450酶上的铁氧化还原蛋白。将该DNA片段通过T4DNA连接酶与用限制酶NcoI和BamHI处理的pETduetaciC连接，将所得质粒称为pETduetboxB。进一步使用引物boxANdeF(参照SEQ ID NO：.18)、boxAXhoR(参照SEQ ID NO：.19)和链霉菌TM-7株的基因组DNA，扩增含有boxA基因(参照SEQ IDNO：.4的碱基544～碱基1761)的DNA片段，用限制酶NdeI和XhoI处理，其中boxA基因编码密实菌素氧化性P-450酶。将该DNA片段通过T4DNA连接酶与用限制酶NdeI和XhoI处理的pETduetboxB连接，将所得质粒称为pETduet-boxA。
(5)质粒pTrcRat
以洋葱伯克霍尔德氏菌(Burkholderia cepacia)895-3株的基因组DNA作为模板，使用引物ExratF(参照SEQ ID NO：.20)和引物ExratR(参照SEQ ID NO：.21)进行PCR，扩增编码(R)-α-甲基色胺氨基转移酶的ratA基因(参照SEQ ID NO：.5的碱基序列230～碱基1330)，用限制酶PstI和EcoRI处理。将该DNA片段通过T4DNA连接酶与pTrcHisA(インビトロジエン公司)的PstI和EcoRI位点连接，将所得质粒称作pTrcRat。
(6)质粒pHSG-ZAR
以泥色黄杆菌IFO3084株的基因组DNA作为模板，使用引物latSacF(参照SEQ ID NO：.24)和引物latXhoR(参照SEQ ID NO：.25)进行PCR，扩增编码赖氨酸氨基转移酶的lat基因(参照SEQ ID NO：.30)，用限制酶SacI和XhoI处理。另外，以泥色黄杆菌IFO3084株的基因组DNA为模板，使用引物ZARXhoF(参照SEQ ID NO：.26)和引物ZARBamR(参照SEQ ID NO：.27)进行PCR，扩增编码N-苄氧基羰基-L-氨基己二酸-δ-半醛还原酶的zar基因(参照SEQ ID NO：.31)，用限制酶XhoI和BamHI处理。进一步以枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)str.168ATCC23857株的基因组DNA作为模板，使用引物rocGBamF(参照SEQ ID NO：.28)和引物rocGXbaR(参照SEQ ID NO：.29)进行PCR，扩增rocG基因(参照SEQ ID NO：.32)，用限制酶SacI和XbaI处理。将这三个DNA片段通过T4DNA连接酶与pHSG298(タカラバイオ公司)的SacI和XbaI位点连接，得到依次整合了lat、zar、rocG的质粒pHSG-ZAR。
实施例4：由维生素D3向25-羟基维生素D3的微生物转化
使用质粒pETAciBC-50AAvdh转化大肠杆菌BLstarTolCAcrAB株、BlstarTolC株、BLstarAcrAB株和BL21star(DE3)株，将所得的菌株分别称为BlstarTolCAcrAB/pETAciBC-50AAvdh株、BlstarTolC/pETAciBC-50AAvdh株、BlstarAcrAB/pETAciBC-50AAvdh株和BL21star/pETAciBC-50Aavdh株。同样，使用质粒pETAciBC-50AABP195转化大肠杆菌BLstarTolCAcrAB株、BLstarTolC株、BLstarAcrAB株和BL21star(DE3)株，将所得菌株分别称为BlstarTolCAcrAB/pETAciBC-50AABP195株、BLstarTolC/pETAciBC-50AABP195株、BLstarAcrAB/pETAciBC-50AABP195株和BL21star/pETAciBC-50AABP195株。将这些株接种于含有羧苄西林钠(100μg/mL)的M9SEED液体培养基(3.39％Na2HPO4、1.5％KH2PO4、0.25％氯化钙、0.5％氯化铵、1％水解酪蛋白氨基酸、0.002％胸腺嘧啶、0.1mM氯化钙、0.1mM硫酸铁、0.4％葡萄糖、0.001mM氯化镁)中，在25℃下、以220rpm振荡培养24小时。将200μL该培养液添加到25mL含有羧苄西林钠(100μg/mL)和Overnight Express AutoinductionSystems(Novagen公司)的M9Main液体培养基(3.39％Na2HPO4、1.5％KH2PO4、0.25％氯化钠、0.5％氯化铵、1％水解酪蛋白氨基酸、0.002％胸腺嘧啶、0.1mM氯化钙、0.1mM硫酸铁、80μg/mL 5-氨基乙酰丙酸)中，然后在25℃下、以220rpm振荡培养24小时。通过离心回收菌体，悬浮于5mL的CV2缓冲液(50mM磷酸钾缓冲液、2％甘油、50μg/mL羧苄西林、0.1M IPTG)中，得到了相对于培养液浓缩了5倍的菌体悬浮液。向1mL该菌体悬浮液中添加25μL含1％维生素D3的DMSO溶液(终浓度250μg/mL)和部分甲基化环糊精(终浓度0.75％)，在28℃下、以220rpm振荡培养24小时。然后在该反应液中加入2mL甲醇，在室温下涡旋10分钟，然后通过Eppendorf离心机、以15,000rpm离心10分钟，将所得上清用HPLC分析，检测到由于底物维生素D3被氢氧化而生成的25-羟基维生素D3。该结果如表1所示。
[表1]
需要说明的是，HPLC的测定条件如下。
分析装置：Agilent 100系列
柱：J’sphere ODS-HS0(YMC，Inc.)，75mm×4.6mmI.D.
流动相：A：乙腈
B：离子交换水
梯度时间设定：
0分流动相A/B＝30∶70
13.00分流动相A/B＝30∶70
14.00分流动相A/B＝100∶0
21.00分流动相A/B＝100∶0
22.00分流动相A/B＝70∶30
25.00分流动相A/B＝70∶30
流速：1.0mL/分钟
检测：UV 265nm
注射容量：10μL
柱温：40℃
分析时间：25分钟
保留时间：25-羟基维生素D3 8.8分钟
维生素D3 21.0分钟
在使用表达编码P-450酶Vdh的vdh基因与编码电子传递系统的基因aciAB的大肠杆菌进行的维生素D3的微生物转化反应中，与以往的方法-使用野生型大肠杆菌作为表达宿主的情形比较，25-羟基维生素D3的蓄积是：使用acrAB破坏株时为2.9倍，使用tolC破坏株时为4.0倍，使用tolCacrAB破坏株时为4.6倍。
另外，在使用表达编码P-450酶BP195的基因和编码电子传递系统的基因aciAB的大肠杆菌进行的维生素D3的微生物转化反应中，与以往的方法-使用野生型大肠杆菌作为表达宿主的情形比较，25-羟基维生素D3的蓄积是：使用acrAB破坏株时为1.8倍，使用tolC破坏株时为2.3倍，使用tolCacrAB破坏株时为3.0倍。
实施例5：由4-胆甾烯-3-酮向25-羟基-4-胆甾烯-3-酮的微生物转化
使用上述的大肠杆菌BlstarTolCAcrAB/pETAciBC-50AABP195株、BLstarTolC/pETAciBC-50AABP 195株、BLstarAcrAB/pETAciBC-50AABP195株和BL21star/pETAciBC-50AABP195株，与实施例4同样制备菌体悬浮液。向1mL该菌体悬浮液中添加25μL 1％4-胆甾烯-3-酮甲醇溶液(终浓度250μg/mL)和部分甲基化环糊精(终浓度0.75％)，在28℃下、以220rpm振荡培养24小时。然后向该反应液中加入2mL甲醇，在室温下涡旋10分钟，然后通过Eppendorf离心机、以15,000rpm离心10分钟，将由此得到的上清进行HPLC分析，检测到由于底物4-胆甾烯-3-酮被氢氧化而生成的25-羟基-4-胆甾烯-3-酮。结果如表2所示。
[表2]
需要说明的是，HPLC的测定条件如下。
分析装置：Agilent 100系列
柱：Inertsil ODS/350mm×4.6mmI.D.
流动相：A：乙腈
B：0.85％磷酸水溶液
梯度时间设定：
0分流动相A/B＝40∶60
5.00分流动相A/B＝100∶0
8.00分流动相A/B＝100∶0
8.30分流动相A/B＝40∶60
11.00分流动相A/B＝40∶60
流速：1.2mL/分钟
检测：UV 235nm
注射容量：40μL
柱温：40℃
分析时间：11分钟
保留时间：25-羟基-4-胆甾烯-3-酮4.97分钟
4-胆甾烯-3-酮 7.45分钟
在4-胆甾烯-3-酮的微生物转化反应中，与以往方法-使用野生型大肠杆菌作为表达宿主的情形比较，25-羟基-4-胆甾烯-3-酮的蓄积是：使用acrAB破坏株时为1.4倍、使用tolC破坏株时为10.5倍，使用tolCacrAB破坏株时为11.0倍。
实施例6：由密实菌素向普伐他汀的微生物转化
使用上述的质粒pETduet-boxA转化大肠杆菌BLstarTolCAcrAB株和BL21star(DE3)株，将所得菌株分别称为BLstarTolCAcrAB/pETduet-boxA株和BL21star/pETduet-boxA株。使用这些菌株，与实施例4同样制备菌体悬浮液。向1mL该菌体悬浮液中添加30μL的25mg/mL密实菌素(终浓度750μg/mL)，在28℃下、以220rpm振荡培养8小时。进一步追加添加30μL的25mg/mL密实菌素(终浓度1500μg/mL)，在28℃下、以220rpm振荡培养16小时。然后向该反应液中加入1mL甲醇和1mL乙腈，在室温下涡旋10分钟，然后通过Eppendorf离心机、以15,000rpm离心10分钟，将所得上清用HPLC分析，检测到由于底物密实菌素被氢氧化而生成的普伐他汀。该结果如表3所示。
[表3]
HPLC的测定条件如下。
分析装置：Agilent 100系列
柱：Chromolith Performance RP-18e 100mm×4.6mmI.D.
流动相：A：甲醇∶三乙胺∶乙酸＝100∶0.1∶0.1
B：水∶三乙胺∶乙酸＝100∶0.1∶0.1
梯度时间设定：
0分流动相A/B＝50∶50
3.00分流动相A/B＝90∶10
3.50分流动相A/B＝90∶10
3.51分流动相A/B＝50∶50
5.00分流动相A/B＝50∶50
流速：2.0mL/分钟
检测：UV 238nm
注射容量：15μL
柱温：40℃
分析时间：6分钟
保留时间：普伐他汀1.77分钟
密实菌素3.23分钟
在使用表达编码P-450酶BoxA的基因和编码该电子传递系统的基因boxD及acrC的大肠杆菌进行的密实菌素的微生物转化反应中，与以往的方法-使用野生型大肠杆菌作为表达宿主的情形比较，使用tolCacrAB破坏株时蓄积了33.1倍的普伐他汀。
实施例7：由(R)-α-甲基色胺向吲哚-3-丙酮的微生物转化
使用上述的质粒pTrcRat转化大肠杆菌BLstarTolCAcrAB株和BL21star(DE3)株，将所得菌株分别称为BLstarTolCAcrAB/pTrcRat株和BL21star/pTrcRat株。将这些株接种于含有羧苄西林钠(100μg/mL)的L液体培养基(1.0％聚胨、0.5％酵母提取物、0.5％氯化钠、pH7.2)中，在37℃下、以220rpm振荡培养8小时。将50μL该培养液添加到25mL含有羧苄西林钠(100μg/mL)和Overnight ExpressAutoinduction Systems(Novagen公司)的L液体培养基中，然后在30℃下、以220rpm振荡培养20小时。通过离心回收菌体，悬浮于2.5mL硼酸缓冲液(200mM、pH9.0)中，得到相对于培养液浓缩了10倍的菌体悬浮液。向0.5mL该菌体悬浮液中添加0.5mL L液体培养基、25μL50％甘油溶液、1.25μL 50mg/mL羧苄西林钠、10μL 100mM IPTG、以及250μL 25mM(R)-α-甲基色胺，在30℃下、以220rpm振荡培养18小时。然后向该反应液中加入50μL 5N氢氧化钠溶液和2mL乙酸乙酯，在室温下涡旋10分钟，然后通过Eppendorf离心机、以15,000rpm离心10分钟，将所得上清浓缩干燥，溶解于300μL甲醇中。将其用HPLC进行分析，检测到从底物(R)-α-甲基色胺(R-MT)中游离出氨基而生成的吲哚-3-丙酮。该结果如表4所示。
[表4]
HPLC的测定条件如下。
分析装置：Agilent 100系列
柱：CHILALPAK AS-H(DAICEL)250mm×4.6mmI.D.
流动相：A：己烷∶异丙醇∶二乙胺＝75∶25∶0.6
流速：0.7mL/分钟
检测：UV 238nm
注射容量：15μL
柱温：25℃
分析时间：15分钟
保留时间：(R)-α-甲基色胺6.5分钟
吲哚-3-丙酮 11.4分钟
在使用表达编码(R)-α-甲基色胺氨基转移酶RatA的基因的大肠杆菌进行的(R)-α-甲基色胺的微生物转化反应中，与以往的方法-使用野生型大肠杆菌作为表达宿主的情形比较，使用tolCacrAB破坏株时蓄积了1.2倍的吲哚-3-丙酮。
实施例8：由N-苄氧基羰基-L-赖氨酸(Z-Lys)向N-苄氧基羰基-6-羟基-L-正亮氨酸(Z-HNL)的微生物转化
通过质粒pHSG-ZAR的lat基因所编码的赖氨酸氨基转移酶，使Z-Lys转化为N-苄氧基羰基-L-氨基己二酸-δ-半醛(Z-ASA)，通过zar基因所编码的Z-ASA还原酶将Z-ASA转化为Z-HNL，进一步通过rocG基因所编码的谷氨酸脱氢酶再生辅酶NADPH。使用上述质粒pHSG-ZAR转化大肠杆菌BLstarTolCAcrAB株和BL21star(DE3)株，将所得株分别称为BLstarTolCAcrAB/pHSG-ZAR株和BL21star/pHSG-ZAR株。将这些株接种于含有卡那霉素硫酸盐(25μg/mL)的M9SEED液体培养基(3.39％Na2HPO4、1.5％KH2PO4、0.25％氯化钙、0.5％氯化铵、1％水解酪蛋白氨基酸、0.002％胸腺嘧啶、0.1mM氯化钙、0.1mM硫酸铁、0.4％葡萄糖、0.001mM氯化镁)中，在25℃下、以220rpm振荡培养24小时。将200μL该培养液添加到25mL含有卡那霉素硫酸盐(80μg/mL)和Overnight Express AutoinductionSystems(Novagen公司)的M9ZAR液体培养基(3.39％Na2HPO4、1.5％KH2PO4、0.25％氯化钠、0.5％氯化铵、1％水解酪蛋白氨基酸、0.002％胸腺嘧啶、0.1mM氯化钙)中，然后在30℃下、以220rpm振荡培养7小时，然后在25℃下、以140rpm振荡培养17小时。通过离心回收菌体，悬浮于5mL的CV3缓冲液(50mM磷酸钾缓冲液、2％甘油、20μg/mL卡那霉素硫酸盐、0.1M IPTG)中，得到相对于培养液浓缩了5倍的菌体悬浮液。向1mL该菌体悬浮液中添加40μL 25mg/mL Z-Lys溶液(终浓度1000μg/mL)和γ-环糊精(终浓度2％)，在28℃下、以220rpm振荡培养24小时。然后向该反应液中加入2mL甲醇，在室温下涡旋10分钟，然后通过Eppendorf离心机、以15,000rpm离心10分钟，将所得上清用HPLC分析，检测到由底物Z-Lys转化的Z-HNL。该结果如表5所示。
[表5]
HPLC的测定条件如下。
分析装置：Agilent 100系列
柱：J’sphere ODS-H80(YMC，Inc.)，75mm×4.6mmI.D.
流动相：A：乙腈
B：0.85％磷酸水溶液
梯度时间设定：
0分流动相A/B＝20∶80
6.00分流动相A/B＝20∶80
8.00分流动相A/B＝60∶40
10.00分流动相A/B＝20∶80
流速：1.5mL/分钟
检测：UV 220nm
注射容量：10μL
柱温：40℃
分析时间：10分钟
保留时间：Z-HNL 3.1分钟
在使用表达分别编码赖氨酸氨基转移酶、N-苄氧基羰基-L-氨基己二酸-δ-半醛还原酶和谷氨酸脱氢酶的基因的大肠杆菌进行的Z-Lys的微生物转化反应中，与以往的方法-使用野生型大肠杆菌作为表达宿主的情形比较，使用tolCacrAB破坏株时蓄积了1.5倍的Z-HNL。
产业实用性
本发明应用于利用微生物转化法的化合物的制备领域。
序列表
<110>美露香株式会社
<120>来自多药运出蛋白缺损株的转化株以及使用该转化株的微生物转化方法
<130>A75274H
<160>32
<210>1
<211>2011
<212>DNA
<213>自养假诺卡氏菌(Pseudonocardia autotrophica)ATCC33795
<220>
<221>CDS
<222>(320)..(1528)
<223>vdh
<400>1
gcgctcgggc tggaccggat cggcgaggtg acgacgctgg ggctgcgctc ggtgcggacc 60
gcatgggccg ggctgcggac gttcgccccg gaccgggccc cggtgctggg ggagtggccc 120
gatcatcccg ggttccactt cgtcgccggc cagggtggat ccggtatcga gtcggctccg 180
gcgctggccg cgctggcagc gtcgatgatc gtcgggcggc cggcgcccgc cgatgtcgcg 240
ctcgatcccg ctgtgtgctc ggtcactcgt ctccggtgac gtaagcgcgc gcttacgtcg 300
cgctggcacg atggggccc atg gcg ctg acc acc acc ggc acc gag cag cac 352
Met Ala Leu Thr Thr Thr Gly Thr Glu Gln His
1 5 10
gac ctg ttc tcg ggc acc ttc tgg cag aac ccg cat ccc gcc tac gcg 400
Asp Leu Phe Ser Gly Thr Phe Trp Gln Asn Pro His Pro Ala Tyr Ala
15 20 25
gca ctc cgt gcc gag gat ccg gta cgc aag ctc gcg ctg ccg gac ggg 448
Ala Leu Arg Ala Glu Asp Pro Val Arg Lys Leu Ala Leu Pro Asp Gly
30 35 40
ccg gtc tgg ctg ctc acc cgc tac gcc gac gtg cgc gag gcg ttc gtc 496
Pro Val Trp Leu Leu Thr Arg Tyr Ala Asp Val Arg Glu Ala Phe Val
45 50 55
gat ccg cgc ctg tcg aag gac tgg cgc cac acg ctg ccc gag gac cag 544
Asp Pro Arg Leu Ser Lys Asp Trp Arg His Thr Leu Pro Glu Asp Gln
60 65 70 75
cgg gcg gac atg ccg gcc acg ccg acg ccg atg atg atc ctg atg gat 592
Arg Ala Asp Met Pro Ala Thr Pro Thr Pro Met Met Ile Leu Met Asp
80 85 90
ccg ccg gat cac acc cgg ctg cgc aag ctg gtc ggc agg tcg ttc acc 640
Pro Pro Asp His Thr Arg Leu Arg Lys Leu Val Gly Arg Ser Phe Thr
95 100 105
gtc cgc cgg atg aac gag ctg gag ccg cgg atc acc gag atc gcc gac 688
Val Arg Arg Met Asn Glu Leu Glu Pro Arg Ile Thr Glu Ile Ala Asp
110 115 120
ggc ctg ctc gcc ggc ctg ccc acc gac ggc ccg gtc gac ctg atg cgc 736
Gly Leu Leu Ala Gly Leu Pro Thr Asp Gly Pro Val Asp Leu Met Arg
125 130 135
gag tac gcg ttc cag atc ccg gta cag gtg atc tgc gag ctg ctc ggg 784
Glu Tyr Ala Phe Gln Ile Pro Val Gln Val Ile Cys Glu Leu Leu Gly
140 145 150 155
gtg ccc gcc gag gac cgc gac gac ttc tcc gcg tgg tcg tcg gtg ctg 832
Val Pro Ala Glu Asp Arg Asp Asp Phe Ser Ala Trp Ser Ser Val Leu
160 165 170
gtc gac gac tcg ccg gcc gac gac aag aac gcg gcc atg ggc aag ctg 880
Val Asp Asp Ser Pro Ala Asp Asp Lys Asn Ala Ala Met Gly Lys Leu
175 180 185
cac ggc tac ctg tcc gac ctg ctg gag cgc aag cgc acc gag ccc gac 928
His Gly Tyr Leu Ser Asp Leu Leu Glu Arg Lys Arg Thr Glu Pro Asp
190 195 200
gac gcg ctg ttg tcg tcg ctg ctg gcg gtg tcc gac gag gac ggc gac 976
Asp Ala Leu Leu Ser Ser Leu Leu Ala Val Ser Asp Glu Asp Gly Asp
205 210 215
cgg ctc tcc cag gag gag ctc gtc gcg atg gcg atg ctg ctg ctg atc 1024
Arg Leu Ser Gln Glu Glu Leu Val Ala Met Ala Met Leu Leu Leu Ile
220 225 230 235
gcc ggg cac gag acg acg gtc aac ctg atc ggc aac ggc gtc ctc gcc 1072
Ala Gly His Glu Thr Thr Val Asn Leu Ile Gly Asn Gly Val Leu Ala
240 245 250
ctg ctc acg cac ccc gac cag cgg aag ctg ctg gcc gag gac ccg tcg 1120
Leu Leu Thr His Pro Asp Gln Arg Lys Leu Leu Ala Glu Asp Pro Ser
255 260 265
ctg atc agc tcg gcg gtc gag gag ttc ctg cgg ttc gac tct ccc gtc 1168
Leu Ile Ser Ser Ala Val Glu Glu Phe Leu Arg Phe Asp Ser Pro Val
270 275 280
tcg cag gcc ccg atc cgg ttc acc gcg gag gac gtc acc tac tcc ggc 1216
Ser Gln Ala Pro Ile Arg Phe Thr Ala Glu Asp Val Thr Tyr Ser Gly
285 290 295
gtg acc atc ccg gcc ggc gag atg gtc atg ctc ggg ctg gcc gcc gcc 1264
Val Thr Ile Pro Ala Gly Glu Met Val Met Leu Gly Leu Ala Ala Ala
300 305 310 315
aac cgg gac gcc gac tgg atg ccc gag ccg gac cgg ctc gac atc acc 1312
Asn Arg Asp Ala Asp Trp Met Pro Glu Pro Asp Arg Leu Asp Ile Thr
320 325 330
cgg gac gcc tcc ggc ggg gtg ttc ttc ggg cac ggc atc cac ttc tgc 1360
Arg Asp Ala Ser Gly Gly Val Phe Phe Gly His Gly Ile His Phe Cys
335 340 345
ctc ggt gcc cag ctg gcc cgg ctg gag ggc cgg gtc gcg atc gga cgg 1408
Leu Gly Ala Gln Leu Ala Arg Leu Glu Gly Arg Val Ala Ile Gly Arg
350 355 360
ctg ttc gcc gat cgc ccg gag ctg gcg ctc gcg gtc ggc ctc gac gag 1456
Leu Phe Ala Asp Arg Pro Glu Leu Ala Leu Ala Val Gly Leu Asp Glu
365 370 375
ctg gtc tac cgg gag tcg acg ctg gtc cgg ggg ctg tcg agg atg ccg 1504
Leu Val Tyr Arg Glu Ser Thr Leu Val Arg Gly Leu Ser Arg Met Pro
380 385 390 395
gtg acg atg ggg ccg cgc agc gcc tga tcccgttcgc ggacgggccg 1551
Val Thr Met Gly Pro Arg Ser Ala
400
ggcggcccgt ccgcgagtac ggtcagccgc tcagtggtgc cccggtcttc tcccgcacct 1611
cgtcggcggt gacgccggga gcggtctcga ccagcgcgag gccgcccggg gtgacgtcga 1671
tgacggcgag atcggtgacg atccgggtga cgcagcccag cccggtgatg ggcaggctgc 1731
acgactcgac gatcttgggc gtgccgtcgc gggacacgtg gtccatcatc acgatgacgg 1791
tgcgggcgcc gtgcacgagg tccatcgcgc cgcccatccc cttgatcatc ttcccgggca 1851
cggcccagtt ggcgagatcg ccgttggcgg cgacctgcat gccgccgagc acggcgacgt 1911
cgagcttccc ggcgcggatc tgggcgaagc tgtccgagga gccgaagtag gcggcgccgt 1971
cgttgacggt gacggtctcc ttgcccgcgt tgatcaggtc 2011
<210>2
<211>1203
<212>DNA
<213>指孢囊菌(Dactylosporangium variesporum)IFO14104
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(1200)
<223>BP195
<400>2
atg acc gaa acg ctg tac ccc gag ctg ccc acg act cgc agc tca ccg 48
Met Thr Glu Thr Leu Tyr Pro Glu Leu Pro Thr Thr Arg Ser Ser Pro
1 5 10 15
ctg gac ccg ccc gcg gaa ctg ggg gtg ttg cgc gag acc gaa ccc atc 96
Leu Asp Pro Pro Ala Glu Leu Gly Val Leu Arg Glu Thr Glu Pro Ile
20 25 30
agc cgg ctg gcg ttc ccg gac ggc acc ctg ggg tgg ctg gtg acc agc 144
Ser Arg Leu Ala Phe Pro Asp Gly Thr Leu Gly Trp Leu Val Thr Ser
35 40 45
cac gcg ctc gcg cgg gag gtg ctg gcc gac aac cgg ttc agc aac cgg 192
His Ala Leu Ala Arg Glu Val Leu Ala Asp Asn Arg Phe Ser Asn Arg
50 55 60
gcc gag cta cag cac tcg ccg atc cgg gcg ggc ggc aaa ccc atc ccg 240
Ala Glu Leu Gln His Ser Pro Ile Arg Ala Gly Gly Lys Pro Ile Pro
65 70 75 80
caa cag ccg ccg gcc aag ccc ggc atg ttc atc aac atg gac ggc cag 288
Gln Gln Pro Pro Ala Lys Pro Gly Met Phe Ile Asn Met Asp Gly Gln
85 90 95
gag cac gcc aag tac cgg cgg ctg ctg acc ggc cag ttc acc gtc cgg 336
Glu His Ala Lys Tyr Arg Arg Leu Leu Thr Gly Gln Phe Thr Val Arg
100 105 110
cgg atg aac cag ctc atc ccc cgg atc gag gcc atc gtg cgc gac cac 384
Arg Met Asn Gln Leu Ile Pro Arg Ile Glu Ala Ile Val Arg Asp His
115 120 125
ctg gcc gac gtg cgg gca cag ggg ccg ggc gtc gac ctc gtg gag gcg 432
Leu Ala Asp Val Arg Ala Gln Gly Pro Gly Val Asp Leu Val Glu Ala
130 135 140
ttc gcg ctg ccg gtg ccg tcg atg gtg atc tgc gag ctg ctg ggg gtg 480
Phe Ala Leu Pro Val Pro Ser Met Val Ile Cys Glu Leu Leu Gly Val
145 150 155 160
tcc tac gag gag cgc gag tcg ttc cag cgg aac acg aag gcg ctg ttt 528
Ser Tyr Glu Glu Arg Glu Ser Phe Gln Arg Asn Thr Lys Ala Leu Phe
165 170 175
cac cct gac caa gga gtt tcg ccg aga tca ggg cgg cct tcg agc gga 576
His Pro Asp Gln Gly Val Ser Pro Arg Ser Gly Arg Pro Ser Ser Gly
180 185 190
tcg agg act ttc gtc gcg gac ctc gtg cgg cgc aag cac gac gag ccg 624
Ser Arg Thr Phe Val Ala Asp Leu Val Arg Arg Lys His Asp Glu Pro
195 200 205
ggc gac gac atg ctc acg ggt ctg atc cag acc ggc gag ctg acc gac 672
Gly Asp Asp Met Leu Thr Gly Leu Ile Gln Thr Gly Glu Leu Thr Asp
210 215 220
gag gaa gtc gcc aac atg ggg ctc ctc ctg ctc gtc gcc ggc cac gag 720
Glu Glu Val Ala Asn Met Gly Leu Leu Leu Leu Val Ala Gly His Glu
225 230 235 240
acg acc gcg aac atg ctc ggc atc ggc acg ctc acc ctg ctc ggc cac 768
Thr Thr Ala Asn Met Leu Gly Ile Gly Thr Leu Thr Leu Leu Gly His
245 250 255
ccc gag cag ctg gcg gcg ctg aag gcc gac ccg tcc ttg atc gac aac 816
Pro Glu Gln Leu Ala Ala Leu Lys Ala Asp Pro Ser Leu Ile Asp Asn
260 265 270
acg gtc gag gag ctg atg cgg tac ctg tcg atc gtc cag ttc ggc gcg 864
Thr Val Glu Glu Leu Met Arg Tyr Leu Ser Ile Val Gln Phe Gly Ala
275 280 285
tcc agg gtc gcc ctg gag gac gtg gaa ctg ggc ggg gtc acc gtc aag 912
Ser Arg Val Ala Leu Glu Asp Val Glu Leu Gly Gly Val Thr Val Lys
290 295 300
gcg ggc gag ccg gtc agc atc tcg gtg atg gcc gcc aac cgc gac ccg 960
Ala Gly Glu Pro Val Ser Ile Ser Val Met Ala Ala Asn Arg Asp Pro
305 310 315 320
gcc aag ttc gac cgc ccg gag gag ttc gac atc cac cgg ccg gcg acc 1008
Ala Lys Phe Asp Arg Pro Glu Glu Phe Asp Ile His Arg Pro Ala Thr
325 330 335
ggc cac gtg gcc ttc ggg cac ggc gtg cac cag tgc ctg ggc cag cag 1056
Gly His Val Ala Phe Gly His Gly Val His Gln Cys Leu Gly Gln Gln
340 345 350
ttg gcg cgc atc gag atg cgc gtg ggg ttc aac gcc ctg ttc cgc gag 1104
Leu Ala Arg Ile Glu Met Arg Val Gly Phe Asn Ala Leu Phe Arg Glu
355 360 365
ttc ccg gac ctg cgg ctc gcg gtg ccg gcc tcg gag gtg ccg atg agg 1152
Phe Pro Asp Leu Arg Leu Ala Val Pro Ala Ser Glu Val Pro Met Arg
370 375 380
gac gac atg gcc atc tac ggc gtg cac aag ctg ccg gtg acg ttc tca 1200
Asp Asp Met Ala Ile Tyr Gly Val His Lys Leu Pro Val Thr Phe Ser
385 390 395 400
tga 1203
<210>3
<211>3192
<212>DNA
<213>不动杆菌(Acinetobacter sp.)0C4
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(318)
<223>aciB
<220>
<221>CDS
<222>(398)..(1888)
<223>aciA
<220>
<221>CDS
<222>(1978)..(3189)
<223>aciC
<400>3
atg ggc caa att aca ttt att gcc cac gat ggt gca caa acc agc gtt 48
Met Gly Gln Ile Thr Phe Ile Ala His Asp Gly Ala Gln Thr Ser Val
1 5 10 15
gca atc gaa gcg ggt aag tca cta atg cag ttg gcg gtt gaa aac ggt 96
Ala Ile Glu Ala Gly Lys Ser Leu Met Gln Leu Ala Val Glu Asn Gly
20 25 30
gtt gcc gga att gat ggg gat tgc ggt ggc gaa tgc gcc tgt ggt acc 144
Val Ala Gly Ile Asp Gly Asp Cys 6ly Gly Glu Cys Ala Cys Gly Thr
35 40 45
tgc cac gtg att gtc agt gct gag tgg tcg gat gtt gcg ggt acg gca 192
Cys His Val Ile Val Ser Ala Glu Trp Ser Asp Val Ala Gly Thr Ala
50 55 60
caa gcg aat gag cag cag atg ttg gaa atg acc cca gag cgt gct gcc 240
Gln Ala Asn Glu Gln Gln Met Leu Glu Met Thr Pro Glu Arg Ala Ala
65 70 75 80
acc tca cgt ttg gcg tgt tgt atc caa gtg acc gat gca atg gat ggc 288
Thr Ser Arg Leu Ala Cys Cys Ile Gln Val Thr Asp Ala Met Asp Gly
85 90 95
atg acg gta cat ctg cct gag ttt cag atg taa cacgtcagct gtaacccagc 341
Met Thr Val His Leu Pro Glu Phe Gln Met
100 105
ggatcaaccg ccttaacaaa cacacctcgt caacgatgct cagtcaggag accatc 397
atg aac tca gtc gca gaa att ttt gag aaa ata acc caa act gtc acc 445
Met Asn Ser Val Ala Glu Ile Phe Glu Lys Ile Thr Gln Thr Val Thr
110 115 120
agc acc gct gca gac gta gca acc acg gtt acg gat aaa gtc aag tct 493
Ser Thr Ala Ala Asp Val Ala Thr Thr Val Thr Asp Lys Val Lys Ser
125 130 135
aat gag cag ttt caa acg ggc aag cag ttt ttg cat ggt caa gtg acc 541
Asn Glu Gln Phe Gln Thr Gly Lys Gln Phe Leu His Gly Gln Val Thr
140 145 150
cgt ttt gtc cca ttg cac acg cag gtt cgc ggc att cag tgg atg caa 589
Arg Phe Val Pro Leu His Thr Gln Val Arg Gly Ile Gln Trp Met Gln
155 160 165 170
aaa gcc aaa ttc cgt gtg ttt aac gtg caa gaa ttt cct gca ttt atc 637
Lys Ala Lys Phe Arg Val Phe Asn Val Gln Glu Phe Pro Ala Phe Ile
175 180 185
gag caa ccg att cca gaa gtt gca aca ctg gca ctt gct gag att gat 685
Glu Gln Pro Ile Pro Glu Val Ala Thr Leu Ala Leu Ala Glu Ile Asp
190 195 200
gtt agc aac cca ttt tta tac aag caa aaa aaa tgg cag tct tac ttt 733
Val Ser Asn Pro Phe Leu Tyr Lys Gln Lys Lys Trp Gln Ser Tyr Phe
205 210 215
aag cgg ctg cgt gat gaa gca ccg gta cat tat caa gcc aac agt ccg 781
Lys Arg Leu Arg Asp Glu Ala Pro Val His Tyr Gln Ala Asn Ser Pro
220 225 230
ttt ggg gca ttt tgg tcg gtc acg cgt tac gat gat att gtc tat gtc 829
Phe Gly Ala Phe Trp Ser Val Thr Arg Tyr Asp Asp Ile Val Tyr Val
235 240 245 250
gat aaa aat cat gag att ttt tca gct gaa cct gtg atc gcg att ggc 877
Asp Lys Asn His Glu Ile Phe Ser Ala Glu Pro Val Ile Ala Ile Gly
255 260 265
aac acc cct cct ggg tta ggt gct gaa atg ttt att gca atg gac cca 925
Asn Thr Pro Pro Gly Leu Gly Ala Glu Met Phe Ile Ala Met Asp Pro
270 275 280
ccc aag cac gat gtg cag cgg cag gcc gta cag gat gta gtc gca cca 973
Pro Lys His Asp Val Gln Arg Gln Ala Val Gln Asp Val Val Ala Pro
285 290 295
aaa aat ctc aaa gag cta gag ggt ttg att cgg cta cgc gtg caa gag 1021
Lys Asn Leu Lys Glu Leu Glu Gly Leu Ile Arg Leu Arg Val Gln Glu
300 305 310
gtt ttg gat cag ttg cca acg gat cag ccg ttt gat tgg gtg cag aat 1069
Val Leu Asp Gln Leu Pro Thr Asp Gln Pro Phe Asp Trp Val Gln Asn
315 320 325 330
gtt tcg att gag ctg aca gcc cgt atg ttg gca aca tta ttt gat ttc 1117
Val Ser Ile Glu Leu Thr Ala Arg Met Leu Ala Thr Leu Phe Asp Phe
335 340 345
cca tac gaa aag cgg cac aaa ttg gtt gaa tgg tca gac ttg atg gct 1165
Pro Tyr Glu Lys Arg His Lys Leu Val Glu Trp Ser Asp Leu Met Ala
350 355 360
ggc act gcg gag gcc aca ggt ggg aca gtg aca aat ttg gat gag att 1213
Gly Thr Ala Glu Ala Thr Gly Gly Thr Val Thr Asn Leu Asp Glu Ile
365 370 375
ttt gat gca gca gtc gat gca gca aag cat ttt gcg gag tta tgg cat 1261
Phe Asp Ala Ala Val Asp Ala Ala Lys His Phe Ala Glu Leu Trp His
380 385 390
aga aaa gcc gca caa aaa tct gca ggc gct gaa atg ggc tat gat ttg 1309
Arg Lys Ala Ala Gln Lys Ser Ala Gly Ala Glu Met Gly Tyr Asp Leu
395 400 405 410
atc agc ttg atg cag tca aac gaa gcg act aaa gac ctg att tat cgg 1357
Ile Ser Leu Met Gln Ser Asn Glu Ala Thr Lys Asp Leu Ile Tyr Arg
415 420 425
ccg atg gag ttt atg ggc aat ttg gtc ttg cta att gtc ggc ggc aac 1405
Pro Met Glu Phe Met Gly Asn Leu Val Leu Leu Ile Val Gly Gly Asn
430 435 440
gat acc aca cgc aac tcg atg acg ggt ggg gta tac gca ctt aac ctg 1453
Asp Thr Thr Arg Asn Ser Met Thr Gly Gly Val Tyr Ala Leu Asn Leu
445 450 455
ttt cca aat gag ttc gtc aaa ctc aaa aac aat ccg agc ttg atc ccg 1501
Phe Pro Asn Glu Phe Val Lys Leu Lys Asn Asn Pro Ser Leu Ile Pro
460 465 470
aac atg gta tcc gaa att att cgc tgg caa acc ccg ctg gcc tat atg 1549
Asn Met Val Ser Glu Ile Ile Arg Trp Gln Thr Pro Leu Ala Tyr Met
475 480 485 490
cgt cgg att gcc aag caa gat gta gag ctt aac ggt cag acc atc aaa 1597
Arg Arg Ile Ala Lys Gln Asp Val Glu Leu Asn Gly Gln Thr Ile Lys
495 500 505
aaa ggc gac aag gtg gtg atg tgg tac gtt tct ggc aac cgc gat gag 1645
Lys Gly Asp Lys Val Val Met Trp Tyr Val Ser Gly Asn Arg Asp Glu
510 515 520
cga gtg att gag cga cct gat gaa ttg atc att gat cgt aaa ggt gcg 1693
Arg Val Ile Glu Arg Pro Asp Glu Leu Ile Ile Asp Arg Lys Gly Ala
525 530 535
cgt aat cat ctg tca ttt ggt ttt ggt gtg cat cgc tgt atg ggt aat 1741
Arg Asn His Leu Ser Phe Gly Phe Gly Val His Arg Cys Met Gly Asn
540 545 550
cgc ttg gcc gag atg cag ttg cga atc tta tgg gaa gag ctg ctt cag 1789
Arg Leu Ala Glu Met Gln Leu Arg Ile Leu Trp Glu Glu Leu Leu Gln
555 560 565 570
cgt ttt gaa aat att gag gtt ttg ggt gag cca gaa att gtg caa tct 1837
Arg Phe Glu Asn Ile Glu Val Leu Gly Glu Pro Glu Ile Val Gln Ser
575 580 585
aac ttt gtg cgc ggc tat gcc aag atg atg gtc aaa ctg act gcc aaa 1885
Asn Phe Val Arg Gly Tyr Ala Lys Met Met Val Lys Leu Thr Ala Lys
590 595 600
gcg tag gtatcaaaat aggcgacaga ggcattttgc aactgtcgtc ggcaacgatt ga 1943
Ala
tgctgtgcat caaccatgaa ctgagtgaat tcat atg caa aca atc gtc atc att 1998
Met Gln Thr Ile Val Ile Ile
610
ggc gca agt cat gct gcg gcg cag ttg gcg gca agt ctg cgg cca gat 2046
Gly Ala Ser His Ala Ala Ala Gln Leu Ala Ala Ser Leu Arg Pro Asp
615 620 625
ggc tgg cag ggc gag att gtg gtg atc ggc gat gag ccg tat ttg ccg 2094
Gly Trp Gln Gly Glu Ile Val Val Ile Gly Asp Glu Pro Tyr Leu Pro
630 635 640
tat cat cga ccg ccg ttg tcc aag acc ttt tta cgc ggt gca caa ctg 2142
Tyr His Arg Pro Pro Leu Ser Lys Thr Phe Leu Arg Gly Ala Gln Leu
645 650 655
gtc gat gag tta ttg att cgg cca gcc gct ttt tat caa aaa aat cag 2190
Val Asp Glu Leu Leu Ile Arg Pro Ala Ala Phe Tyr Gln Lys Asn Gln
660 665 670
atc gaa ttt cgg cac ggg cgg gtg gtt gcg att gat cgg gca gcg cgc 2238
Ile Glu Phe Arg His Gly Arg Val Val Ala Ile Asp Arg Ala Ala Arg
675 680 685 690
agc gtg aca cta caa gat ggc agt acg ctt gcg tat gac cag ttg gcg 2286
Ser Val Thr Leu Gln Asp Gly Ser Thr Leu Ala Tyr Asp Gln Leu Ala
695 700 705
ctg tgt acc ggt gca cga gtc agg acg gtg tcg ctg gct ggg tct gat 2334
Leu Cys Thr Gly Ala Arg Val Arg Thr Val Ser Leu Ala Gly Ser Asp
710 715 720
ttg gca ggt gtg cat tat ctt aga aat atc agc gat gta cag gct atc 2382
Leu Ala Gly Val His Tyr Leu Arg Asn Ile Ser Asp Val Gln Ala Ile
725 730 735
cag cca ttt gta caa ccc aac ggc aaa gca gtg gtg atc ggt ggt ggc 2430
Gln Pro Phe Val Gln Pro Asn Gly Lys Ala Val Val Ile Gly Gly Gly
740 745 750
tat atc ggt ctt gaa aca gcc gcc gca ttg acc gag cag ggc atg cag 2478
Tyr Ile Gly Leu Glu Thr Ala Ala Ala Leu Thr Glu Gln Gly Met Gln
755 760 765 770
gtg gtg gtc ttg gaa gcc gcc gag cgg att ttg cag cgg gta act gca 2526
Val Val Val Leu Glu Ala Ala Glu Arg Ile Leu Gln Arg Val Thr Ala
775 780 785
ccg gaa gtg tcg gac ttt tat acg cgg att cat cgc gaa cag ggt gtg 2574
Pro Glu Val Ser Asp Phe Tyr Thr Arg Ile His Arg Glu Gln Gly Val
790 795 800
acg att cat acc ggt gtg tcg gtc acg gcg atc acg ggt gag ggg cgg 2622
Thr Ile His Thr Gly Val Ser Val Thr Ala Ile Thr Gly Glu Gly Arg
805 810 815
gcg cag gcg gtg ctg tgt gcc gat ggt tcg atg ttc gat gca gat ctg 2670
Ala Gln Ala Val Leu Cys Ala Asp Gly Ser Met Phe Asp Ala Asp Leu
820 825 830
gtg atc atc ggg gtc ggg gtt gta ccg aat atc gag ttg gcg ctg gac 2718
Val Ile Ile Gly Val Gly Val Val Pro Asn Ile Glu Leu Ala Leu Asp
835 840 845 850
gcg ggc ttg cag gtg gac aat ggt att gtg att gat gag tat tgc cga 2766
Ala Gly Leu Gln Val Asp Asn Gly Ile Val Ile Asp Glu Tyr Cys Arg
855 860 865
acc agt gcg cca gag att gtg gcc atc ggg gat tgt gcc aat gcg ttt 2814
Thr Ser Ala Pro Glu Ile Val Ala Ile Gly Asp Cys Ala Asn Ala Phe
870 875 880
aat ccg att tat cag cgg cgg atg cgc ttg gag tcg gta cca aac gcc 2862
Asn Pro Ile Tyr Gln Arg Arg Met Arg Leu Glu Ser Val Pro Asn Ala
885 890 895
aat gaa cag gcc aaa att gcc tcg gcg acc ttg tgt ggc tta cag cgg 2910
Asn Glu Gln Ala Lys Ile Ala Ser Ala Thr Leu Cys Gly Leu Gln Arg
900 905 910
acc tcg aag agt ttg cct tgg ttt tgg tca gat cag tat gat cta aag 2958
Thr Ser Lys Ser Leu Pro Trp Phe Trp Ser Asp Gln Tyr Asp Leu Lys
915 920 925 930
ttg cag att gcg gga ctc agt cag ggg tat gat cag atc gtg att cgg 3006
Leu Gln Ile Ala Gly Leu Ser Gln Gly Tyr Asp Gln Ile Val Ile Arg
935 940 945
ggt gat gtg cag caa agg cgt agc ttt gca gcg ttt tat ttg cag gcg 3054
Gly Asp Val Gln Gln Arg Arg Ser Phe Ala Ala Phe Tyr Leu Gln Ala
950 955 960
ggt cgc ctg att gcg gcg gat tgt gtg aat cgt ccg cag gag ttt atg 3102
Gly Arg Leu Ile Ala Ala Asp Cys Val Asn Arg Pro Gln Glu Phe Met
965 970 975
cta agc aaa aag ctg atc acg gct ggt acg gcg gtc gat cca ctg cgg 3150
Leu Ser Lys Lys Leu Ile Thr Ala Gly Thr Ala Val Asp Pro Leu Arg
980 985 990
ttg gcg gat gag tcg att gcg gta cag gcg ttg atg ggg tag 3192
Leu Ala Asp Glu Ser Ile Ala Val Gln Ala Leu Met Gly
995 1000 1005
<210>4
<211>1992
<212>DNA
<213>链霉菌(Streptomyces sp.)TM-7
<220>
<22l>CDS
<222>(544)..(1758)
<223>boxA
<220>
<221>CDS
<222>(1782)..(1970)
<223>boxB
<400>4
tcgccgggcc cggcggtgtg gaccgttcgc ggaccagccg ggcgaattcg gggtcgtgca 60
tgacctcggt gagcaggccg cggagtatgt ccgccgtgcg aggcggccaa cctggcggag 120
agtcgccgta gcgcggtgat gacatcggtg cgcagggcgc cggtgtcggg caggtcggcg 180
tcggacagcc ggtgggccgc gcaggcgtcg acgacgagtt cggcacggcc gggccacctc 240
cggtacaggg tggccttgcc ggtacgggcc cgtgcggcca cgcgctccat cgtcagtccc 300
ggcgtagtcc gacctcggtc agtttcctcg agggtcgcgg ccaggatggc cctctccagt 360
tcctctcctc ggccggcgag ggtttttcga tggtcgcggt cgtccggtcc ggcgcgtccc 420
cgtgggttgg aggcatgact cccagccatt tgtcgagcac ccgttgtgag cgtcgggtgg 480
gtaagcctag ccttccgtta gagaactgac cgttctttaa gcgtcgagtg catcgaggga 540
ccg atg acc gag acc gtt acg acg ccc aca tca ggc gcc ccc gcc ttc 588
Met Thr Glu Thr Val Thr Thr Pro Thr Ser Gly Ala Pro Ala Phe
1 5 10 15
ccc agt gac cgc acc tgc ccc tac cac ctc ccc gac cgg tac aac gac 636
Pro Ser Asp Arg Thr Cys Pro Tyr His Leu Pro Asp Arg Tyr Asn Asp
20 25 30
ctc cgg gac cgg gag ggt tcg ctg cag cgg gtc acc ctc tac gac ggc 684
Leu Arg Asp Arg Glu Gly Ser Leu Gln Arg Val Thr Leu Tyr Asp Gly
35 40 45
cgg cag gca tgg ctg gtg acc ggg tac gac acg gca cgc aag ctg ctg 732
Arg Gln Ala Trp Leu Val Thr Gly Tyr Asp Thr Ala Arg Lys Leu Leu
50 55 60
gcc gac ccc cgg ctc tcg tcc gac cgg aca cac gcc gac ttc ccc gcc 780
Ala Asp Pro Arg Leu Ser Ser Asp Arg Thr His Ala Asp Phe Pro Ala
65 70 75
acc tcc ggg cgg gtg gag agc ttc cgg gac cgc cgg ccg gcg ttc atc 828
Thr Ser Gly Arg Val Glu Ser Phe Arg Asp Arg Arg Pro Ala Phe Ile
80 85 90 95
agc ctg gac ccg ccc gag cac ggg ccg aaa cgg cgc atg acc atc agc 876
Ser Leu Asp Pro Pro Glu His Gly Pro Lys Arg Arg Met Thr Ile Ser
100 105 110
gag ttc acc gtc cgg cgc atc aag ggc atg cgg gcc gac gtc gag cag 924
Glu Phe Thr Val Arg Arg Ile Lys Gly Met Arg Ala Asp Val Glu Gln
115 120 125
atc gtg cac ggc ttc ctg gac gag atg atc gca ggc ggc ccg ccc gcc 972
Ile Val His Gly Phe Leu Asp Glu Met Ile Ala Gly Gly Pro Pro Ala
130 135 140
gac ctg gtc agc cag ttc gcg ctg ccc gtc ccg tcc ctg gtg atc tgc 1020
Asp Leu Val Ser Gln Phe Ala Leu Pro Val Pro Ser Leu Val Ile Cys
145 150 155
cgt ctg ctc ggt gtg ccc tac gcg gac cac gac ttc ttc cag gac gcc 1068
Arg Leu Leu Gly Val Pro Tyr Ala Asp His Asp Phe Phe Gln Asp Ala
160 165 170 175
agc gca cgg ctg atc cag tcc ccg gac gcg gcg ggt gcg cgt gcc gcc 1116
Ser Ala Arg Leu Ile Gln Ser Pro Asp Ala Ala Gly Ala Arg Ala Ala
180 185 190
cgg gac gac ctg gag agc tat ctg ggc gct ctg gtg gac agc ctg cga 1164
Arg Asp Asp Leu Glu Ser Tyr Leu Gly Ala Leu Val Asp Ser Leu Arg
195 200 205
ggc gag tcc cgg ccg ggc ctg ctg agc acg ctc gtc agg gag cag ctg 1212
Gly Glu Ser Arg Pro Gly Leu Leu Ser Thr Leu Val Arg Glu Gln Leu
210 215 220
gag aag ggc gcg atc gac cgg gag gag ctg gtg tcg acg gcg atc ctg 1260
Glu Lys Gly Ala Ile Asp Arg Glu Glu Leu Val Ser Thr Ala Ile Leu
225 230 235
ctg ctg gtc gcc gga cac gag acg acg gcg tcg atg acg tcg ctc agc 1308
Leu Leu Val Ala Gly His Glu Thr Thr Ala Ser Met Thr Ser Leu Ser
240 245 250 255
gtc atc acc ctc ctc gaa cat ccc gac cag cac gcc gcg ttg cgc gcc 1356
Val Ile Thr Leu Leu Glu His Pro Asp Gln His Ala Ala Leu Arg Ala
260 265 270
gat ccg tcg ctg gtg ccc ggc gcg gtg gag gag ctg ctg cgc tat ctg 1404
Asp Pro Ser Leu Val Pro Gly Ala Val Glu Glu Leu Leu Arg Tyr Leu
275 280 285
gcc atc gcc gac atc gcc ggc ggg cgg atc gcg acg gcg gac atc gag 1452
Ala Ile Ala Asp Ile Ala Gly Gly Arg Ile Ala Thr Ala Asp Ile Glu
290 295 300
atc gac ggg cag cgc atc cgg gcg ggg gag ggg gtc atc gtc acc aac 1500
Ile Asp Gly Gln Arg Ile Arg Ala Gly Glu Gly Val Ile Val Thr Asn
305 310 315
tcg atc gcc aac cgc gac ggc tcc gtc ttc gcc gac ccg gac gcc ttc 1548
Ser Ile Ala Asn Arg Asp Gly Ser Val Phe Ala Asp Pro Asp Ala Phe
320 325 330 335
gac gtg cgg cgc gag gcc cgc cac cac ctg gcg ttc ggc tac ggg gtg 1596
Asp Val Arg Arg Glu Ala Arg His His Leu Ala Phe Gly Tyr Gly Val
340 345 350
cat cag tgc ctc ggc cag aac ctg gcc cgc ctc gaa ctg gag gtc atc 1644
His Gln Cys Leu Gly Gln Asn Leu Ala Arg Leu Glu Leu Glu Val Ile
355 360 365
ctc acg gcg ctg ttc gag cgg ctg ccc ggt ctg cgg ctg gcg gtg ccg 1692
Leu Thr Ala Leu Phe Glu Arg Leu Pro Gly Leu Arg Leu Ala Val Pro
370 375 380
gtg gac cgg ctg acc ctg cgc ccg ggc acg acg atc cag ggc gtg aac 1740
Val Asp Arg Leu Thr Leu Arg Pro Gly Thr Thr Ile Gln Gly Val Asn
385 390 395
gaa ctc ccg gtc acc tgg tga ccgcggcgaa aggagcagcc atg cgt gtg acg 1793
Glu Leu Pro Val Thr Trp Met Arg Val Thr
400 405
gcc gac cgg gag gtc tgc gtg gga gcg ggc ctg tgc gcc ttg acg gcg 1841
Ala Asp Arg Glu Val Cys Val Gly Ala Gly Leu Cys Ala Leu Thr Ala
410 415 420 425
ccg gag gtc ttc gac cag gac gac gac ggt gtg gtg acg gtg ctg gcc 1889
Pro Glu Val Phe Asp Gln Asp Asp Asp Gly Val Val Thr Val Leu Ala
430 435 440
gcg gaa ccc ggc gag gcc ggc cgt gcg gcg gca ctc gaa gcc ggc gcg 1937
Ala Glu Pro Gly Glu Ala Gly Arg Ala Ala Ala Leu Glu Ala Gly Ala
445 450 455
ctg tgc ccg tcc ggc gcg gta cgc gtc gtc gag tag gggccgtgcg gggccg 1989
Leu Cys Pro Ser Gly Ala Val Arg Val Val Glu
460 465
tga 1992
<210>5
<211>1860
<212>DNA
<213>洋葱伯克霍尔德氏菌(Burkholderia cepacia)895-3
<220>
<221>CDS
<222>(230)..(1327)
<223>ratA
<400>5
cgggcaacgg atgatcgcgc tcgcgctgga cggctggccc gacgtgatcg tgaacccccg 60
aaattcgtgt ggcgcagcgg cgcgcggatg acgctgtggg acgactgcat gtgctttccc 120
cgacctgttc gtgcgtgtcg agcgccacgc gtcggtgagc gtgcagtaca cgacgcttga 180
cggcgagctg catcggcgcg acgcgctgtc gcctgatgtg tcggagctg atg cag cac 238
Met Gln His
1
gag atc gac cat ctc gac ggc aag ctg tcg ttc gat cgc gcg gcg ggg 286
Glu Ile Asp His Leu Asp Gly Lys Leu Ser Phe Asp Arg Ala Ala Gly
5 10 15
ccg aat gcg gtc gtg cat cgc agc gtg ttc gac gcc gat cgc gca tcg 334
Pro Asn Ala Val Val His Arg Ser Val Phe Asp Ala Asp Arg Ala Ser
20 25 30 35
ttt gtc gcg cag gtc gac tac gcg ccg cat gtg ccc gac gtg aaa cgt 382
Phe Val Ala Gln Val Asp Tyr Ala Pro His Val Pro Asp Val Lys Arg
40 45 50
tcg gcg ccg gag atc att cag tct gcc gaa gca tcc gcg tat cca ccg 430
Ser Ala Pro Glu Ile Ile Gln Ser Ala Glu Ala Ser Ala Tyr Pro Pro
55 60 65
ggc gcc gcg tac atg aat gga cgc ttc att ccg atc gcc gac gcg cgc 478
Gly Ala Ala Tyr Met Asn Gly Arg Phe Ile Pro Ile Ala Asp Ala Arg
70 75 80
gtg tcg gtg ctc gac tgg ggt ttc ctg cat tcc gac gtc acg tac gac 526
Val Ser Val Leu Asp Trp Gly Phe Leu His Ser Asp Val Thr Tyr Asp
85 90 95
acc gtg cac gtg tgg aac ggc cgc ttc ttc cgc ctc gac cgg cac atc 574
Thr Val His Val Trp Asn Gly Arg Phe Phe Arg Leu Asp Arg His Ile
100 105 110 115
gcg cgg ttc agg cgc tcg ctg gcg cgg ctg cgg ctg gac gta ccg ttg 622
Ala Arg Phe Arg Arg Ser Leu Ala Arg Leu Arg Leu Asp Val Pro Leu
120 125 130
ggc gac gac gcg ctg cgc gac atc ctc gtc gaa tgc gtg cgc cgc tcg 670
Gly Asp Asp Ala Leu Arg Asp Ile Leu Val Glu Cys Val Arg Arg Ser
135 140 145
ggc ctg cgc aac gcg tat gtc gaa atg ctg tgc acg cgc ggc gta tcg 718
Gly Leu Arg Asn Ala Tyr Val Glu Met Leu Cys Thr Arg Gly Val Ser
150 155 160
ccc acc ttc agc cgc gac ccg cgc gac gcg gtg aac cag ttc atc gcg 766
Pro Thr Phe Ser Arg Asp Pro Arg Asp Ala Val Asn Gln Phe Ile Ala
165 170 175
ttc gcg gtg ccg tac ggc tcg gtc gcg aac gag cgg cag ttg cgc gag 814
Phe Ala Val Pro Tyr Gly Ser Val Ala Asn Glu Arg Gln Leu Arg Glu
180 185 190 195
ggc ctg cac ctg cat ctg atc gac gac gtt cga cgg att ccg ccc gaa 862
Gly Leu His Leu His Leu Ile Asp Asp Val Arg Arg Ile Pro Pro Glu
200 205 210
tcg gtc gat ccg cag atc aag aac tac cac tgg ctc gac ctt gtc gcc 910
Ser Val Asp Pro Gln Ile Lys Asn Tyr His Trp Leu Asp Leu Val Ala
215 220 225
ggg ctg ctg aag ggg tat gac gcg ggg gcg gag tcg gtc gtg ctg aag 958
Gly Leu Leu Lys Gly Tyr Asp Ala Gly Ala Glu Ser Val Val Leu Lys
230 235 240
tgc acg gac ggc agc atc gcc gaa ggg ccc ggg ttc aac gtc ttc atc 1006
Cys Thr Asp Gly Ser Ile Ala Glu Gly Pro Gly Phe Asn Val Phe Ile
245 250 255
gtg cgc gac ggc cgg ctt cgg acg ccc gag cgc ggc gtg ctg cac ggc 1054
Val Arg Asp Gly Arg Leu Arg Thr Pro Glu Arg Gly Val Leu His Gly
260 265 270 275
atc acg cgg cag acc gtg ttc gag ctg gcg gcg tcg atg ggc atc gac 1102
Ile Thr Arg Gln Thr Val Phe Glu Leu Ala Ala Ser Met Gly Ile Asp
280 285 290
gcg cag gcc ggt cgt gtc gac gat gcg caa ctg cgc gaa gcg gac gag 1150
Ala Gln Ala Gly Arg Val Asp Asp Ala Gln Leu Arg Glu Ala Asp Glu
295 300 305
gtg ttc atc acg tcg acg gcc ggc ggg atc atg ccc gtc acg cgg ctg 1198
Val Phe Ile Thr Ser Thr Ala Gly Gly Ile Met Pro Val Thr Arg Leu
310 315 320
aac ggc gca ccg gtc ggc gac ggc cgg ccg ggc ccg atg acg cgc cgg 1246
Asn Gly Ala Pro Val Gly Asp Gly Arg Pro Gly Pro Met Thr Arg Arg
325 330 335
ctg ttc gac gcg tac tgg gcg aag cac gag gat ccg gcg tgg agc ctg 1294
Leu Phe Asp Ala Tyr Trp Ala Lys His Glu Asp Pro Ala Trp Ser Leu
340 345 350 355
gcg gtc gac tac gcg gcc aac tgc gcg gcc ggc tga tcgcggcggc gcgggc 1346
Ala Val Asp Tyr Ala Ala Asn Cys Ala Ala Gly
360 365
gcgattcctt acctcgtacg taatcgaccg cccgcgcgag gccggcgacg atgacggcac 1406
gcgaatacga aacacgcaac gttcgcgacc tcgtcccctc gtcgacacaa ggagcctcgc 1466
catgagcacc gctcaatccg cttcgtccgc ctcgtccatt cacgccgacc tgatcgaccg 1526
ctacttcgac gcatggaacg aacccgacgt cgcgcgccgc cgcgcgctga tcgatgcgac 1586
ctacgcgagc gacgcggcct atcgcgatcc gctgatggcc ggcgacggcc acgcaggcat 1646
cgacgcgatg atcgcggccg tgcaggcgcg cttccccgcg ttccgctttc gccgcacgac 1706
cgacgtcgac gcgttcggcc agcacctgcg gttctcgtgg gcgctcgtgt cgcccggcgg 1766
cgcggcgatc gtgaagggtt cggacttcgg cacggtcgac gcatcgggcc gccttgcgac 1826
ggtcaccggt ttcatcgacg agatgccggc cgcg 1860
<210>6
<211>33
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物A
<400>6
catggatcct gaactgagtg aattgatatg caa 33
<210>7
<211>31
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物B
<400>7
cccaagcttc taccccatca acgcctgtac c 31
<210>8
<211>53
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物C
<400>8
gtaagatcta aataaggagg aataacatat ggcgctgacc accaccggca ccg 53
<210>9
<211>29
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物D
<400>9
tcaggatcct cggcacggag tgccgcgta 29
<210>10
<211>32
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物E
<400>10
taacatatga actcagtcgc agaaattttt ga 32
<210>11
<211>32
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物F
<400>11
cgaactagtg gtcacttgac catgcaaaaa ct 32
<210>12
<211>30
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物BP195F
<400>12
ccgactagta ccgaaacgct gtaccccgag 30
<210>13
<211>30
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物BP195R
<400>13
cctggatcct catgagaacg tcaccggcag 30
<210>14
<211>31
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物vdhF
<400>14
accactagtg cgctgaccac caccggcacc g 31
<210>15
<211>31
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物vdhR
<400>15
gggagatctt caggcgctgc gcggccccat c 31
<210>16
<211>31
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物boxBNcoF
<400>16
cagccatggg tgtgacggcc gaccgggagg t 31
<210>17
<211>30
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物boxBBamR
<400>17
cacggatcct actcgacgac gcgtaccgcg ccgga 35
<210>18
<211>30
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物boxANdeF
<400>18
ggacatatga ccgagaccgt tacgacgccc a 31
<210>19
<211>36
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物boxAXhoR
<400>19
tcgctcgagt caccaggtga ccgggagttc gt 32
<210>20
<211>30
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物ExratF
<400>20
gcgctgcagg tgcccgacgt gaaacgttcg 30
<210>21
<211>29
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物ExratR
<400>20
ttcgaattcg cgtgccgtca tcgtcgccg 29
<210>22
<211>2011
<212>DNA
<213>大肠杆菌(Escherichia coli)K-12
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(1485)
<223>tolC
<400>1
atg caa atg aag aaa ttg ctc ccc att ctt atc ggc ctg agc ctt tct 48
Met Gln Met Lys Lys Leu Leu Pro Ile Leu Ile Gly Leu Ser Leu Ser
1 5 10 15
ggg ttc agt tcg ttg agc cag gcc gag aac ctg atg caa gtt tat cag 96
Gly Phe Ser Ser Leu Ser Gln Ala Glu Asn Leu Met Gln Val Tyr Gln
20 25 30
caa gca cgc ctt agt aac ccg gaa ttg cgt aag tct gcc gcc gat cgt 144
Gln Ala Arg Leu Ser Asn Pro Glu Leu Arg Lys Ser Ala Ala Asp Arg
35 40 45
gat gct gcc ttt gaa aaa att aat gaa gcg cgc agt cca tta ctg cca 192
Asp Ala Ala Phe Glu Lys Ile Asn Glu Ala Arg Ser Pro Leu Leu Pro
50 55 60
cag cta ggt tta ggt gca gat tac acc tat agc aac ggc tac cgc gac 240
Gln Leu Gly Leu Gly Ala Asp Tyr Thr Tyr Ser Asn Gly Tyr Arg Asp
65 70 75 80
gcg aac ggc atc aac tct aac gcg acc agt gcg tcc ttg cag tta act 288
Ala Asn Gly Ile Asn Ser Asn Ala Thr Ser Ala Ser Leu Gln Leu Thr
85 90 95
caa tcc att ttt gat atg tcg aaa tgg cgt gcg tta acg ctg cag gaa 336
Gln Ser Ile Phe Asp Met Ser Lys Trp Arg Ala Leu Thr Leu Gln Glu
100 105 110
aaa gca gca ggg att cag gac gtc acg tat cag acc gat cag caa acc 384
Lys Ala Ala Gly Ile Gln Asp Val Thr Tyr Gln Thr Asp Gln Gln Thr
115 120 125
ttg atc ctc aac acc gcg acc gct tat ttc aac gtg ttg aat gct att 432
Leu Ile Leu Asn Thr Ala Thr Ala Tyr Phe Asn Val Leu Asn Ala Ile
130 135 140
gac gtt ctt tcc tat aca cag gca caa aaa gaa gcg atc tac cgt caa 480
Asp Val Leu Ser Tyr Thr Gln Ala Gln Lys Glu Ala Ile Tyr Arg Gln
145 150 155 160
tta gat caa acc acc caa cgt ttt aac gtg ggc ctg gta gcg atc acc 528
Leu Asp Gln Thr Thr Gln Arg Phe Asn Val Gly Leu Val Ala Ile Thr
165 170 175
gac gtg cag aac gcc cgc gca cag tac gat acc gtg ctg gcg aac gaa 576
Asp Val Gln Asn Ala Arg Ala Gln Tyr Asp Thr Val Leu Ala Asn Glu
180 185 190
gtg acc gca cgt aat aac ctt gat aac gcg gta gag cag ctg cgc cag 624
Val Thr Ala Arg Asn Asn Leu Asp Asn Ala Val Glu Gln Leu Arg Gln
195 200 205
atc acc ggt aac tac tat ccg gaa ctg gct gcg ctg aat gtc gaa aac 672
Ile Thr Gly Asn Tyr Tyr Pro Glu Leu Ala Ala Leu Asn Val Glu Asn
210 215 220
ttt aaa acc gac aaa cca cag ccg gtt aac gcg ctg ctg aaa gaa gcc 720
Phe Lys Thr Asp Lys Pro Gln Pro Val Asn Ala Leu Leu Lys Glu Ala
225 230 235 240
gaa aaa cgc aac ctg tcg ctg tta cag gca cgc ttg agc cag gac ctg 768
Glu Lys Arg Asn Leu Ser Leu Leu Gln Ala Arg Leu Ser Gln Asp Leu
245 250 255
gcg cgc gag caa att cgc cag gcg cag gat ggt cac tta ccg act ctg 816
Ala Arg Glu Gln Ile Arg Gln Ala Gln Asp Gly His Leu Pro Thr Leu
260 265 270
gat tta acg gct tct acc ggg att tct gac acc tct tat agc ggt tcg 864
Asp Leu Thr Ala Ser Thr Gly Ile Ser Asp Thr Ser Tyr Ser Gly Ser
275 280 285
aaa acc cgt ggt gcc gct ggt acc cag tat gac gat agc aat atg ggc 912
Lys Thr Arg Gly Ala Ala Gly Thr Gln Tyr Asp Asp Ser Asn Met Gly
290 295 300
cag aac aaa gtt ggc ctg agc ttc tcg ctg ccg att tat cag ggc gga 960
Gln Asn Lys Val Gly Leu Ser Phe Ser Leu Pro Ile Tyr Gln Gly Gly
305 310 315 320
atg gtt aac tcg cag gtg aaa cag gca cag tac aac ttt gtc ggt gcc 1008
Met Val Asn Ser Gln Val Lys Gln Ala Gln Tyr Asn Phe Val Gly Ala
325 330 335
agc gag caa ctg gaa agt gcc cat cgt agc gtc gtg cag acc gtg cgt 1056
Ser Glu Gln Leu Glu Ser Ala His Arg Ser Val Val Gln Thr Val Arg
340 345 350
tcc tcc ttc aac aac att aat gca tct atc agt agc att aac gcc tac 1104
Ser Ser Phe Asn Asn Ile Asn Ala Ser Ile Ser Ser Ile Asn Ala Tyr
355 360 365
aaa caa gcc gta gtt tcc gct caa agc tca tta gac gcg atg gaa gcg 1152
Lys Gln Ala Val Val Ser Ala Gln Ser Ser Leu Asp Ala Met Glu Ala
370 375 380
ggc tac tcg gtc ggt acg cgt acc att gtt gat gtg ttg gat gcg acc 1200
Gly Tyr Ser Val Gly Thr Arg Thr Ile Val Asp Val Leu Asp Ala Thr
385 390 395 400
acc acg ttg tac aac gcc aag caa gag ctg gcg aat gcg cgt tat aac 1248
Thr Thr Leu Tyr Asn Ala Lys Gln Glu Leu Ala Asn Ala Arg Tyr Asn
405 410 415
tac ctg att aat cag ctg aat att aag tca gct ctg ggt acg ttg aac 1296
Tyr Leu Ile Asn Gln Leu Asn Ile Lys Ser Ala Leu Gly Thr Leu Asn
420 425 430
gag cag gat ctg ctg gca ctg aac aat gcg ctg agc aaa ccg gtt tcc 1344
Glu Gln Asp Leu Leu Ala Leu Asn Asn Ala Leu Ser Lys Pro Val Ser
435 440 445
act aat ccg gaa aac gtt gca ccg caa acg ccg gaa cag aat gct att 1392
Thr Asn Pro Glu Asn Val Ala Pro Gln Thr Pro Glu Gln Asn Ala Ile
450 455 460
gct gat ggt tat gcg cct gat agc ccg gca cca gtc gtt cag caa aca 1440
Ala Asp Gly Tyr Ala Pro Asp Ser Pro Ala Pro Val Val Gln Gln Thr
465 470 475 480
tcc gca cgc act acc acc agt aac ggt cat aac cct ttc cgt aac tga 1488
Ser Ala Arg Thr Thr Thr Ser Asn Gly His Asn Pro Phe Arg Asn
485 490 495
<210>23
<211>2011
<212>DNA
<213>大肠杆菌(Escherichia coli)K-12
<220>
<221>CDS
<222>(329)..(1519)
<223>acrA
<220>
<221>CDS
<222>(1545)..(4691)
<223>acrB
<400>23
agatctcact gaacaaatcc gacttgtctt taaaatgcca gtagattgca ccgcgcgtaa 60
cgccagctgc ttttgcaatc tcgcccagcg aggtggatga taccccctgc tgtgagaaaa 120
gacgtagagc cacatcgagg atgtgttggc gcgtttcttg cgcttcttgt ttggtttttc 180
gtgccatatg ttcgtgaatt tacaggcgtt agatttacat acatttgtga atgtatgtac 240
catagcacga cgataatata aacgcagcaa tgggtttatt aacttttgac cattgaccaa 300
tttgaaatcg gacactcgag gtttacat atg aac aaa aac aga ggg ttt acg 352
Met Asn Lys Asn Arg Gly Phe Thr
1 5
cct ctg gcg gtc gtt ctg atg ctc tca ggc agc tta gcc cta aca gga 400
Pro Leu Ala Val Val Leu Met Leu Ser Gly Ser Leu Ala Leu Thr Gly
10 15 20
tgt gac gac aaa cag gcc caa caa ggt ggc cag cag atg ccc gcc gtt 448
Cys Asp Asp Lys Gln Ala Gln Gln Gly Gly Gln Gln Met Pro Ala Val
25 30 35 40
ggc gta gta aca gtc aaa act gaa cct ctg cag atc aca acc gag ctt 496
Gly Val Val Thr Val Lys Thr Glu Pro Leu Gln Ile Thr Thr Glu Leu
45 50 55
ccg ggt cgc acc agt gcc tac cgg atc gca gaa gtt cgt cct caa gtt 544
Pro Gly Arg Thr Ser Ala Tyr Arg Ile Ala Glu Val Arg Pro Gln Val
60 65 70
agc ggg att atc ctg aag cgt aat ttc aaa gaa ggt agc gac atc gaa 592
Ser Gly Ile Ile Leu Lys Arg Asn Phe Lys Glu Gly Ser Asp Ile Glu
75 80 85
gca ggt gtc tct ctc tat cag att gat cct gcg acc tat cag gcg aca 640
Ala Gly Val Ser Leu Tyr Gln Ile Asp Pro Ala Thr Tyr Gln Ala Thr
90 95 100
tac gac agt gcg aaa ggt gat ctg gcg aaa gcc cag gct gca gcc aat 688
Tyr Asp Ser Ala Lys Gly Asp Leu Ala Lys Ala Gln Ala Ala Ala Asn
105 110 115 120
atc gcg caa ttg acg gtg aat cgt tat cag aaa ctg ctc ggt act cag 736
Ile Ala Gln Leu Thr Val Asn Arg Tyr Gln Lys Leu Leu Gly Thr Gln
125 130 135
tac atc agt aag caa gag tac gat cag gct ctg gct gat gcg caa cag 784
Tyr Ile Ser Lys Gln Glu Tyr Asp Gln Ala Leu Ala Asp Ala Gln Gln
140 145 150
gcg aat gct gcg gta act gcg gcg aaa gct gcc gtt gaa act gcg cgg 832
Ala Asn Ala Ala Val Thr Ala Ala Lys Ala Ala Val Glu Thr Ala Arg
155 160 165
atc aat ctg gct tac acc aaa gtc acc tct ccg att agc ggt cgc att 880
Ile Asn Leu Ala Tyr Thr Lys Val Thr Ser Pro Ile Ser Gly Arg Ile
170 175 180
ggt aag tcg aac gtg acg gaa ggc gca ttg gta cag aac ggt cag gcg 928
Gly Lys Ser Asn Val Thr Glu Gly Ala Leu Val Gln Asn Gly Gln Ala
185 190 195 200
act gcg ctg gca acc gtg cag caa ctt gat ccg atc tac gtt gat gtg 976
Thr Ala Leu Ala Thr Val Gln Gln Leu Asp Pro Ile Tyr Val Asp Val
205 210 215
acc cag tcc agc aac gac ttc ctg cgc ctg aaa cag gaa ctg gcg aat 1024
Thr Gln Ser Ser Asn Asp Phe Leu Arg Leu Lys Gln Glu Leu Ala Asn
220 225 230
ggc acg ctg aaa caa gag aac ggc aaa gcc aaa gtg tca ctg atc acc 1072
Gly Thr Leu Lys Gln Glu Asn Gly Lys Ala Lys Val Ser Leu Ile Thr
235 240 245
agt gac ggc att aag ttc ccg cag gac ggt acg ctg gaa ttc tct gac 1120
Ser Asp Gly Ile Lys Phe Pro Gln Asp Gly Thr Leu Glu Phe Ser Asp
250 255 260
gtt acc gtt gat cag acc act ggg tct atc acc cta cgc gct atc ttc 1168
Val Thr Val Asp Gln Thr Thr Gly Ser Ile Thr Leu Arg Ala Ile Phe
265 270 275 280
ccg aac ccg gat cac act ctg ctg ccg ggt atg ttc gtg cgc gca cgt 1216
Pro Asn Pro Asp His Thr Leu Leu Pro Gly Met Phe Val Arg Ala Arg
285 290 295
ctg gaa gaa ggg ctt aat cca aac gct att tta gtc ccg caa cag ggc 1264
Leu Glu Glu Gly Leu Asn Pro Asn Ala Ile Leu Val Pro Gln Gln Gly
300 305 310
gta acc cgt acg ccg cgt ggc gat gcc acc gta ctg gta gtt ggc gcg 1312
Val Thr Arg Thr Pro Arg Gly Asp Ala Thr Val Leu Val Val Gly Ala
315 320 325
gat gac aaa gtg gaa acc cgt ccg atc gtt gca agc cag gct att ggc 1360
Asp Asp Lys Val Glu Thr Arg Pro Ile Val Ala Ser Gln Ala Ile Gly
330 335 340
gat aag tgg ctg gtg aca gaa ggt ctg aaa gca ggc gat cgc gta gta 1408
Asp Lys Trp Leu Val Thr Glu Gly Leu Lys Ala Gly Asp Arg Val Val
345 350 355 360
ata agt ggg ctg cag aaa gtg cgt cct ggt gtc cag gta aaa gca caa 1456
Ile Ser Gly Leu Gln Lys Val Arg Pro Gly Val Gln Val Lys Ala Gln
365 370 375
gaa gtt acc gct gat aat aac cag caa gcc gca agc ggt gct cag cct 1504
Glu Val Thr Ala Asp Asn Asn Gln Gln Ala Ala Ser Gly Ala Gln Pro
380 385 390
gaa cag tcc aag tct taa cttaaacagg agccgttaag ac atg cct aat ttc 1556
Glu Gln Ser Lys Ser Met Pro Asn Phe
395 400
ttt atc gat cgc ccg att ttt gcg tgg gtg atc gcc att atc atc atg 1604
Phe Ile Asp Arg Pro Ile Phe Ala Trp Val Ile Ala Ile Ile Ile Met
405 410 415
ttg gca ggg ggg ctg gcg atc ctc aaa ctg ccg gtg gcg caa tat cct 1652
Leu Ala Gly Gly Leu Ala Ile Leu Lys Leu Pro Val Ala Gln Tyr Pro
420 425 430
acg att gca ccg ccg gca gta acg atc tcc gcc tcc tac ccc ggc gct 1700
Thr Ile Ala Pro Pro Ala Val Thr Ile Ser Ala Ser Tyr Pro Gly Ala
435 440 445
gat gcg aaa aca gtg cag gac acg gtg aca cag gtt atc gaa cag aat 1748
Asp Ala Lys Thr Val Gln Asp Thr Val Thr Gln Val Ile Glu Gln Asn
450 455 460 465
atg aac ggt atc gat aac ctg atg tac atg tcc tct aac agt gac tcc 1796
Met Asn Gly Ile Asp Asn Leu Met Tyr Met Ser Ser Asn Ser Asp Ser
470 475 480
acg ggt acc gtg cag atc acc ctg acc ttt gag tct ggt act gat gcg 1844
Thr Gly Thr Val Gln Ile Thr Leu Thr Phe Glu Ser Gly Thr Asp Ala
485 490 495
gat atc gcg cag gtt cag gtg cag aac aaa ctg cag ctg gcg atg ccg 1892
Asp Ile Ala Gln Val Gln Val Gln Asn Lys Leu Gln Leu Ala Met Pro
500 505 510
ttg ctg ccg caa gaa gtt cag cag caa ggg gtg agc gtt gag aaa tca 1940
Leu Leu Pro Gln Glu Val Gln Gln Gln Gly Val Ser Val Glu Lys Ser
515 520 525
tcc agc agc ttc ctg atg gtt gtc ggc gtt atc aac acc gat ggc acc 1988
Ser Ser Ser Phe Leu Met Val Val Gly Val Ile Asn Thr Asp Gly Thr
530 535 540 545
atg acg cag gag gat atc tcc gac tac gtg gcg gcg aat atg aaa gat 2036
Met Thr Gln Glu Asp Ile Ser Asp Tyr Val Ala Ala Asn Met Lys Asp
550 555 560
gcc atc agc cgt acg tcg ggc gtg ggt gat gtt cag ttg ttc ggt tca 2084
Ala Ile Ser Arg Thr Ser Gly Val Gly Asp Val Gln Leu Phe Gly Ser
565 570 575
cag tac gcg atg cgt atc tgg atg aac ccg aat gag ctg aac aaa ttc 2132
Gln Tyr Ala Met Arg Ile Trp Met Asn Pro Asn Glu Leu Asn Lys Phe
580 585 590
cag cta acg ccg gtt gat gtc att acc gcc atc aaa gcg cag aac gcc 2180
Gln Leu Thr Pro Val Asp Val Ile Thr Ala Ile Lys Ala Gln Asn Ala
595 600 605
cag gtt gcg gcg ggt cag ctc ggt ggt acg ccg ccg gtg aaa ggc caa 2228
Gln Val Ala Ala Gly Gln Leu Gly Gly Thr Pro Pro Val Lys Gly Gln
610 615 620 625
cag ctt aac gcc tct att att gct cag acg cgt ctg acc tct act gaa 2276
Gln Leu Asn Ala Ser Ile Ile Ala Gln Thr Arg Leu Thr Ser Thr Glu
630 635 640
gag ttc ggc aaa atc ctg ctg aaa gtg aat cag gat ggt tcc cgc gtg 2324
Glu Phe Gly Lys Ile Leu Leu Lys Val Asn Gln Asp Gly Ser Arg Val
645 650 655
ctg ctg cgt gac gtc gcg aag att gag ctg ggt ggt gag aac tac gac 2372
Leu Leu Arg Asp Val Ala Lys Ile Glu Leu Gly Gly Glu Asn Tyr Asp
660 665 670
atc atc gca gag ttt aac ggc caa ccg gct tcc ggt ctg ggg atc aag 2420
Ile Ile Ala Glu Phe Asn Gly Gln Pro Ala Ser Gly Leu Gly Ile Lys
675 680 685
ctg gcg acc ggt gca aac gcg ctg gat acc gct gcg gca atc cgt gct 2468
Leu Ala Thr Gly Ala Asn Ala Leu Asp Thr Ala Ala Ala Ile Arg Ala
690 695 700 705
gaa ctg gcg aag atg gaa ccg ttc ttc ccg tcg ggt ctg aaa att gtt 2516
Glu Leu Ala Lys Met Glu Pro Phe Phe Pro Ser Gly Leu Lys Ile Val
710 715 720
tac cca tac gac acc acg ccg ttc gtg aaa atc tct att cac gaa gtg 2564
Tyr Pro Tyr Asp Thr Thr Pro Phe Val Lys Ile Ser Ile His Glu Val
725 730 735
gtt aaa acg ctg gtc gaa gcg atc atc ctc gtg ttc ctg gtt atg tat 2612
Val Lys Thr Leu Val Glu Ala Ile Ile Leu Val Phe Leu Val Met Tyr
740 745 750
ctg ttc ctg cag aac ttc cgc gcg acg ttg att ccg acc att gcc gta 2660
Leu Phe Leu Gln Asn Phe Arg Ala Thr Leu Ile Pro Thr Ile Ala Val
755 760 765
ccg gtg gta ttg ctc ggg acc ttt gcc gtc ctt gcc gcc ttt ggc ttc 2708
Pro Val Val Leu Leu Gly Thr Phe Ala Val Leu Ala Ala Phe Gly Phe
770 775 780 785
tcg ata aac acg cta aca atg ttc ggg atg gtg ctc gcc atc ggc ctg 2756
Ser Ile Asn Thr Leu Thr Met Phe Gly Met Val Leu Ala Ile Gly Leu
790 795 800
ttg gtg gat gac gcc atc gtt gtg gta gaa aac gtt gag cgt gtt atg 2804
Leu Val Asp Asp Ala Ile Val Val Val Glu Asn Val Glu Arg Val Met
805 810 815
gcg gaa gaa ggt ttg ccg cca aaa gaa gct acc cgt aag tcg atg ggg 2852
Ala Glu Glu Gly Leu Pro Pro Lys Glu Ala Thr Arg Lys Ser Met Gly
820 825 830
cag att cag ggc gct ctg gtc ggt atc gcg atg gta ctg tcg gcg gta 2900
Gln Ile Gln Gly Ala Leu Val Gly Ile Ala Met Val Leu Ser Ala Val
835 840 845
ttc gta ccg atg gcc ttc ttt ggc ggt tct act ggt gct atc tat cgt 2948
Phe Val Pro Met Ala Phe Phe Gly Gly Ser Thr Gly Ala Ile Tyr Arg
850 855 860 865
cag ttc tct att acc att gtt tca gca atg gcg ctg tcg gta ctg gtg 2996
Gln Phe Ser Ile Thr Ile Val Ser Ala Met Ala Leu Ser Val Leu Val
870 875 880
gcg ttg atc ctg act cca gct ctt tgt gcc acc atg ctg aaa ccg att 3044
Ala Leu Ile Leu Thr Pro Ala Leu Cys Ala Thr Met Leu Lys Pro Ile
885 890 895
gcc aaa ggc gat cac ggg gaa ggt aaa aaa ggc ttc ttc ggc tgg ttt 3092
Ala Lys Gly Asp His Gly Glu Gly Lys Lys Gly Phe Phe Gly Trp Phe
900 905 910
aac cgc atg ttc gag aag agc acg cac cac tac acc gac agc gta ggc 3140
Asn Arg Met Phe Glu Lys Ser Thr His His Tyr Thr Asp Ser Val Gly
915 920 925
ggt att ctg cgc agt acg ggg cgt tac ctg gtg ctg tat ctg atc atc 3188
Gly Ile Leu Arg Ser Thr Gly Arg Tyr Leu Val Leu Tyr Leu Ile Ile
930 935 940 945
gtg gtc ggc atg gcc tat ctg ttc gtg cgt ctg cca agc tcc ttc ttg 3236
Val Val Gly Met Ala Tyr Leu Phe Val Arg Leu Pro Ser Ser Phe Leu
950 955 960
cca gat gag gac cag ggc gtg ttt atg acc atg gtt cag ctg cca gca 3284
Pro Asp Glu Asp Gln Gly Val Phe Met Thr Met Val Gln Leu Pro Ala
965 970 975
ggt gca acg cag gaa cgt aca cag aaa gtg ctc aat gag gta acg cat 3332
Gly Ala Thr Gln Glu Arg Thr Gln Lys Val Leu Asn Glu Val Thr His
980 985 990
tac tat ctg acc aaa gaa aag aac aac gtt gag tcg gtg ttc gcc gtt 3380
Tyr Tyr Leu Thr Lys Glu Lys Asn Asn Val Glu Ser Val Phe Ala Val
995 1000 1005
aac ggc ttc ggc ttt gcg gga cgt ggt cag aat acc ggt att gcg ttc 3428
Asn Gly Phe Gly Phe Ala Gly Arg Gly Gln Asn Thr Gly Ile Ala Phe
1010 1015 1020 1025
gtt tcc ttg aag gac tgg gcc gat cgt ccg ggc gaa gaa aac aaa gtt 3476
Val Ser Leu Lys Asp Trp Ala Asp Arg Pro Gly Glu Glu Asn Lys Val
1030 1035 1040
gaa gcg att acc atg cgt gca aca cgc gct ttc tcg caa atc aaa gat 3524
Glu Ala Ile Thr Met Arg Ala Thr Arg Ala Phe Ser Gln Ile Lys Asp
1045 1050 1055
gcg atg gtt ttc gcc ttt aac ctg ccc gca atc gtg gaa ctg ggt act 3572
Ala Met Val Phe Ala Phe Asn Leu Pro Ala Ile Val Glu Leu Gly Thr
1060 1065 1070
gca acc ggc ttt gac ttt gag ctg att gac cag gct ggc ctt ggt cac 3620
Ala Thr Gly Phe Asp Phe Glu Leu Ile Asp Gln Ala Gly Leu Gly His
1075 1080 1085
gaa aaa ctg act cag gcg cgt aac cag ttg ctt gca gaa gca gcg aag 3668
Glu Lys Leu Thr Gln Ala Arg Asn Gln Leu Leu Ala Glu Ala Ala Lys
1090 1095 1100 1105
cac cct gat atg ttg acc agc gta cgt cca aac ggt ctg gaa gat acc 3716
His Pro Asp Met Leu Thr Ser Val Arg Pro Asn Gly Leu Glu Asp Thr
1110 1115 1120
ccg cag ttt aag att gat atc gac cag gaa aaa gcg cag gcg ctg ggt 3764
Pro Gln Phe Lys Ile Asp Ile Asp Gln Glu Lys Ala Gln Ala Leu Gly
1125 1130 1135
gtt tct atc aac gac att aac acc act ctg ggc gct gca tgg ggc ggc 3812
Val Ser Ile Asn Asp Ile Asn Thr Thr Leu Gly Ala Ala Trp Gly Gly
1140 1145 1150
agc tat gtg aac gac ttt atc gac cgc ggt cgt gtg aag aaa gtt tat 3860
Ser Tyr Val Asn Asp Phe Ile Asp Arg Gly Arg Val Lys Lys Val Tyr
1155 1160 1165
gtc atg tca gaa gcg aaa tac cgt atg ctg ccg gat gat atc ggc gac 3908
Val Met Ser Glu Ala Lys Tyr Arg Met Leu Pro Asp Asp Ile Gly Asp
1170 1175 1180 1185
tgg tat gtt cgt gct gct gat ggt cag atg gtg cca ttc tcg gcg ttc 3956
Trp Tyr Val Arg Ala Ala Asp Gly Gln Met Val Pro Phe Ser Ala Phe
1190 1195 1200
tcc tct tct cgt tgg gag tac ggt tcg ccg cgt ctg gaa cgt tac aac 4004
Ser Ser Ser Arg Trp Glu Tyr Gly Ser Pro Arg Leu Glu Arg Tyr Asn
1205 1210 1215
ggc ctg cca tcc atg gaa atc tta ggc cag gcg gca ccg ggt aaa agt 4052
Gly Leu Pro Ser Met Glu Ile Leu Gly Gln Ala Ala Pro Gly Lys Ser
1220 1225 1230
acc ggt gaa gca atg gag ctg atg gaa caa ctg gcg agc aaa ctg cct 4100
Thr Gly Glu Ala Met Glu Leu Met Glu Gln Leu Ala Ser Lys Leu Pro
1235 1240 1245
acc ggt gtt ggc tat gac tgg acg ggg atg tcc tat cag gaa cgt ctc 4148
Thr Gly Val Gly Tyr Asp Trp Thr Gly Met Ser Tyr Gln Glu Arg Leu
1250 1255 1260 1265
tcc ggc aac cag gca cct tca ctg tac gcg att tcg ttg att gtc gtg 4196
Ser Gly Asn Gln Ala Pro Ser Leu Tyr Ala Ile Ser Leu Ile Val Val
1270 1275 1280
ttc ctg tgt ctg gcg gcg ctg tac gag agc tgg tcg att ccg ttc tcc 4244
Phe Leu Cys Leu Ala Ala Leu Tyr Glu Ser Trp Ser Ile Pro Phe Ser
1285 1290 1295
gtt atg ctg gtc gtt ccg ctg ggg gtt atc ggt gcg ttg ctg gct gcc 4292
Val Met Leu Val Val Pro Leu Gly Val Ile Gly Ala Leu Leu Ala Ala
1300 1305 1310
acc ttc cgt ggc ctg acc aat gac gtt tac ttc cag gta ggc ctg ctc 4340
Thr Phe Arg Gly Leu Thr Asn Asp Val Tyr Phe Gln Val Gly Leu Leu
1315 1320 1325
aca acc att ggg ttg tcg gcg aag aac gcg atc ctt atc gtc gaa ttc 4388
Thr Thr Ile Gly Leu Ser Ala Lys Asn Ala Ile Leu Ile Val Glu Phe
1330 1335 1340 1345
gcc aaa gac ttg atg gat aaa gaa ggt aaa ggt ctg att gaa gcg acg 4436
Ala Lys Asp Leu Met Asp Lys Glu Gly Lys Gly Leu Ile Glu Ala Thr
1350 1355 1360
ctt gat gcg gtg cgg atg cgt tta cgt ccg atc ctg atg acc tcg ctg 4484
Leu Asp Ala Val Arg Met Arg Leu Arg Pro Ile Leu Met Thr Ser Leu
1365 1370 1375
gcg ttt atc ctc ggc gtt atg ccg ctg gtt atc agt act ggt gct ggt 4532
Ala Phe Ile Leu Gly Val Met Pro Leu Val Ile Ser Thr Gly Ala Gly
1380 1385 1390
tcc ggc gcg cag aac gca gta ggt acc ggt gta atg ggc ggg atg gtg 4580
Ser Gly Ala Gln Asn Ala Val Gly Thr Gly Val Met Gly Gly Met Val
1395 1400 1405
acc gca acg gta ctg gca atc ttc ttc gtt ccg gta ttc ttt gtg gtg 4628
Thr Ala Thr Val Leu Ala Ile Phe Phe Val Pro Val Phe Phe Val Val
1410 1415 1420 1425
gtt cgc cgc cgc ttt agc cgc aag aat gaa gat atc gag cac agc cat 4676
Val Arg Arg Arg Phe Ser Arg Lys Asn Glu Asp Ile Glu His Ser His
1430 1435 1440
act gtc gat cat cat tga tacaacgtgt aatcactaag gccgcgtaag cggcctt 4732
Thr Val Asp His His
1445
tttatgcata acctacgaac attaaggagt aattgaacca ccaactcagg atctcatacg 4792
aaaaccagta ttaaccacgg ataaaattca taaaaaatac tgattgttag ttaatttata 4852
ttaagtagcg ctaatagatt taataat 4879
<210>24
<211>33
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物latSacF
<400>24
ttcgagctcg tcccttcttg ccccgctcgc ccc 33
<210>25
<211>34
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物latXhoR
<400>25
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<210>26
<211>50
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物ZARXhoF
<400>26
cacctcgaga agaaggagat atagatatgc actaccgccg cctcggctct 丂50
<210>27
<211>34
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物ZARBamF
<400>27
atgggatcca ttctcatcta cagatcaaga cttc 34
<210>28
<211>50
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物rocGBamF
<400>28
cttggatcca gaaggagata tagatatgtc agcaaagcaa gtctcgaaag 50
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<211>33
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物rocGXbaR
<400>29
ctttctagat tagacccatc cgcggaaacg cga 29
<210>30
<211>1482
<212>DNA
<213>泥色黄杆菌(Flavobacterium lutescens)IFO3084
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(1479)
<223>lat
<400>30
atg tcc ctt ctt gcc ccg ctc gcc ccg ctc cgc gcc cat gcc ggc acc 48
Met Ser Leu Leu Ala Pro Leu Ala Pro Leu Arg Ala His Ala Gly Thr
1 5 10 15
cgc ctt acc cag ggc ctg tct gac ccg cag gtc gag cag ctg gcc gcc 96
Arg Leu Thr Gln Gly Leu Ser Asp Pro Gln Val Glu Gln Leu Ala Ala
20 25 30
aac cac cct gac ctg cgc gcc gcc atc gac gcc gct gcc gac gaa tac 144
Asn His Pro Asp Leu Arg Ala Ala Ile Asp Ala Ala Ala Asp Glu Tyr
35 40 45
gcg cgc atc aaa ccg cag gcc gcg gca ttg ctg gac ctg gat gaa agc 192
Ala Arg Ile Lys Pro Gln Ala Ala Ala Leu Leu Asp Leu Asp Glu Ser
50 55 60
gcg cag atc gcc gcc gtg cag gat ggc ttc gtc aac ttc tat gcc gat 240
Ala Gln Ile Ala Ala Val Gln Asp Gly Phe Val Asn Phe Tyr Ala Asp
65 70 75 80
gat gcg gtg gtg ccc tat atc gcc ctg gcc gcc cgc ggg ccg tgg gtg 288
Asp Ala Val Val Pro Tyr Ile Ala Leu Ala Ala Arg Gly Pro Trp Val
85 90 95
gtc agc ctg aag ggc gcg gtg ctg tat gac gcc ggc ggc tac ggc atg 336
Val Ser Leu Lys Gly Ala Val Leu Tyr Asp Ala Gly Gly Tyr Gly Met
100 105 110
ctc ggc ttc ggc cat acc ccg gcc gat atc ctg gag gcg gtc ggc aag 384
Leu Gly Phe Gly His Thr Pro Ala Asp Ile Leu Glu Ala Val Gly Lys
115 120 125
ccg cag gtg atg gcc aac atc atg act ccc tcg ctg gcc cag ggc cgc 432
Pro Gln Val Met Ala Asn Ile Met Thr Pro Ser Leu Ala Gln Gly Arg
130 135 140
ttc att gcc gca atg cgc cgc gaa atc ggc cat acc cgc ggc ggc tgc 480
Phe Ile Ala Ala Met Arg Arg Glu Ile Gly His Thr Arg Gly Gly Cys
145 150 155 160
ccg ttc tcg cac ttc atg tgc ctg aac tcc ggc tcc gaa gcg gtc ggg 528
Pro Phe Ser His Phe Met Cys Leu Asn Ser Gly Ser Glu Ala Val Gly
165 170 175
ctg gcc gcg cgc atc gcc gac atc aac gcc aag ctg atg acc gac ccg 576
Leu Ala Ala Arg Ile Ala Asp Ile Asn Ala Lys Leu Met Thr Asp Pro
180 185 190
ggc gcc cgg cat gcc ggc gcc acg atc aag cgc gtg gtg atc aag ggc 624
Gly Ala Arg His Ala Gly Ala Thr Ile Lys Arg Val Val Ile Lys Gly
195 200 205
agt ttc cac ggc cgt acc gac cgt ccg gcg ctg tat tcc gat tcc acc 672
Ser Phe His Gly Arg Thr Asp Arg Pro Ala Leu Tyr Ser Asp Ser Thr
210 215 220
cgc aag gcc tac gat gcg cat ctg gcc agc tac cgc gac gag cac agc 720
Arg Lys Ala Tyr Asp Ala His Leu Ala Ser Tyr Arg Asp Glu His Ser
225 230 235 240
gtc att gcc atc gcc ccg tat gac cag cag gcc ctg cgc cag gtg ttt 768
Val Ile Ala Ile Ala Pro Tyr Asp Gln Gln Ala Leu Arg Gln Val Phe
245 250 255
gcc gat gcc cag gcc aac cac tgg ttc atc gag gcg gtg ttc ctg gag 816
Ala Asp Ala Gln Ala Asn His Trp Phe Ile Glu Ala Val Phe Leu Glu
260 265 270
ccg gtg atg ggc gaa ggc gac ccg ggc cgt gcg gtg ccg gtg gac ttc 864
Pro Val Met Gly Glu Gly Asp Pro Gly Arg Ala Val Pro Val Asp Phe
275 280 285
tac cgc ctg gcc cgt gag ctg acc cgc gaa cac ggc agc ctg ctg ctg 912
Tyr Arg Leu Ala Arg Glu Leu Thr Arg Glu His Gly Ser Leu Leu Leu
290 295 300
atc gat tcg atc cag gcc gcg ctg cgc gtg cac ggc acc ctg tcc ttc 960
Ile Asp Ser Ile Gln Ala Ala Leu Arg Val His Gly Thr Leu Ser Phe
305 310 315 320
gtc gac tac ccc ggc cac cag gag ctg gag gca ccg gac atg gag acc 1008
Val Asp Tyr Pro Gly His Gln Glu Leu Glu Ala Pro Asp Met Glu Thr
325 330 335
tac tcc aag gcc ctg aac ggc gcc cag ttc ccg ctg tcg gta gtg gcc 1056
Tyr Ser Lys Ala Leu Asn Gly Ala Gln Phe Pro Leu Ser Val Val Ala
340 345 350
gtg acc gag cac gcc gcc gcg ctg tac cgc aag ggc gtg tac ggc aac 1104
Val Thr Glu His Ala Ala Ala Leu Tyr Arg Lys Gly Val Tyr Gly Asn
355 360 365
acc atg acc acc aac ccg cgg gcg ctg gac gtg gcc tgc gcc acc ctg 1152
Thr Met Thr Thr Asn Pro Arg Ala Leu Asp Val Ala Cys Ala Thr Leu
370 375 380
gca cgc ctg gat gag ccg gtc cgc aac aat atc cgc ctg cgt ggc cag 1200
Ala Arg Leu Asp Glu Pro Val Arg Asn Asn Ile Arg Leu Arg Gly Gln
385 390 395 400
cag gcg atg cag aag ctg gaa gca ttg aag gaa cgg ctg ggg ggc gcg 1248
Gln Ala Met Gln Lys Leu Glu Ala Leu Lys Glu Arg Leu Gly Gly Ala
405 410 415
atc acc aag gtg cag ggc acc ggc ctg ctg ttc tcc tgc gag ctg gcc 1296
Ile Thr Lys Val Gln Gly Thr Gly Leu Leu Phe Ser Cys Glu Leu Ala
420 425 430
ccg cag tac aag tgc tac ggg gcc ggc tcc acc gag gag tgg ctg cgc 1344
Pro Gln Tyr Lys Cys Tyr Gly Ala Gly Ser Thr Glu Glu Trp Leu Arg
435 440 445
atg cac ggg gtc aat gtg atc cac ggc ggc gag aat tcg ctg cgc ttc 1392
Met His Gly Val Asn Val Ile His Gly Gly Glu Asn Ser Leu Arg Phe
450 455 460
acc ccg cac ttc ggc atg gac gag gcc gaa ctg gac ctg ctg gtg gag 1440
Thr Pro His Phe Gly Met Asp Glu Ala Glu Leu Asp Leu Leu Val Glu
465 470 475 480
atg gtc ggg cgt gcg ctg gtc gaa ggc cca cgc cgg gcc tga 1482
Met Val Gly Arg Ala Leu Val Glu Gly Pro Arg Arg Ala
485 490
<210>31
<211>969
<212>DNA
<213>泥色黄杆菌(Flavobacterium lutescens)IFO3084
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(966)
<223>zar
<400>31
atg cac tac cgc cgc ctc ggc tct acc ggc ctg cag ttg tca gcc ctg 48
Met His Tyr Arg Arg Leu Gly Ser Thr Gly Leu Gln Leu Ser Ala Leu
1 5 10 15
tcc ttt ggt gcc tgg gtc acc ttt ggc gcg cag atc ggg cgc ggc gag 96
Ser Phe Gly Ala Trp Val Thr Phe Gly Ala Gln Ile Gly Arg Gly Glu
20 25 30
gcg cgc aac ctg att gcc tgc gcc tgg gac aac ggg atc aat ttc ttt 144
Ala Arg Asn Leu Ile Ala Cys Ala Trp Asp Asn Gly Ile Asn Phe Phe
35 40 45
gac aac gcc gaa ggc tat gcg cgc ggc gag gcc gaa gcg gtg atg ggc 192
Asp Asn Ala Glu Gly Tyr Ala Arg Gly Glu Ala Glu Ala Val Met Gly
50 55 60
gat gtg atc gct gaa ctg cgc ctg cca cgg gat ggt ttc tgc gtt tcc 240
Asp Val Ile Ala Glu Leu Arg Leu Pro Arg Asp Gly Phe Cys Val Ser
65 70 75 80
agc aag gtt ttt ttc ggt tcg gcc agc gag ccc ttg ccg acc cag cgc 288
Ser Lys Val Phe Phe Gly Ser Ala Ser Glu Pro Leu Pro Thr Gln Arg
85 90 95
ggg ctg tcg cgc aag cat gta ctc gat gcc tgc cat ggc gca ctg cgc 336
Gly Leu Ser Arg Lys His Val Leu Asp Ala Cys His Gly Ala Leu Arg
100 105 110
cgg ctg cgg gtg gac tac ctg gac ctg tac ttc tgc cat cgt ccc gat 384
Arg Leu Arg Val Asp Tyr Leu Asp Leu Tyr Phe Cys His Arg Pro Asp
115 120 125
ccg cag acc ccg att gcc gag acc gtg cat gcg atg aac ctg ttg gtc 432
Pro Gln Thr Pro Ile Ala Glu Thr Val His Ala Met Asn Leu Leu Val
130 135 140
gag cag ggc aag gtg ctg tat tgg ggc acc tcg cag tgg tcg gcc gcg 480
Glu Gln Gly Lys Val Leu Tyr Trp Gly Thr Ser Gln Trp Ser Ala Ala
145 150 155 160
cag atc agc gaa gcc atc gcc att gcc gat gcg cgt ggc tgg cag cgt 528
Gln Ile Ser Glu Ala Ile Ala Ile Ala Asp Ala Arg Gly Trp Gln Arg
165 170 175
ccg gcc atg gag cag ccc cag tac agc ctg ctc gaa cgt gac cgt gtc 576
Pro Ala Met Glu Gln Pro Gln Tyr Ser Leu Leu Glu Arg Asp Arg Val
180 185 190
gag cag gaa ctg gcg ccg ctg tgc gcg cag ggg ctg ggc acc acc acc 624
Glu Gln Glu Leu Ala Pro Leu Cys Ala Gln Gly Leu Gly Thr Thr Thr
195 200 205
tgg tca cca ctg gcc agc ggc ctg ctg acg ggc aag tac aac gat ggc 672
Trp Ser Pro Leu Ala Ser Gly Leu Leu Thr Gly Lys Tyr Asn Asp Gly
210 215 220
gtg ccc gcc ggc tcg cgc ctg gac cag ccc gag ttg ggg tgg ctg cag 720
Val Pro Ala Gly Ser Arg Leu Asp Gln Pro Glu Leu Gly Trp Leu Gln
225 230 235 240
cac gca cag ctg gaa gat ccg ggc cgt ctg cac agg gtc cgc gcg ttc 768
His Ala Gln Leu Glu Asp Pro Gly Arg Leu His Arg Val Arg Ala Phe
245 250 255
acg gcc ctg gcc gaa gaa ctg gcg gtc gta ccg gcg cag ttg gcc atc 816
Thr Ala Leu Ala Glu Glu Leu Ala Val Val Pro Ala Gln Leu Ala Ile
260 265 270
gcc tgg tgc ccg cgc aac cgg cat gta tcc agc gtg atc ctg ggg gcc 864
Ala Trp Cys Pro Arg Asn Arg His Val Ser Ser Val Ile Leu Gly Ala
275 280 285
agc cgg gtg gcc cag ctg gaa cag aac ctg gcc gcg ctg gag gtt gcc 912
Ser Arg Val Ala Gln Leu Glu Gln Asn Leu Ala Ala Leu Glu Val Ala
290 295 300
gag cgg ctg gac gca tcg gcc tgg aca gcg gtg gag gcg atc ttc ccg 960
Glu Arg Leu Asp Ala Ser Ala Trp Thr Ala Val Glu Ala Ile Phe Pro
305 310 315 320
cgc ggg tga 969
Arg Gly
<210>32
<211>1275
<212>DNA
<213>枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)str.168ATCC23857
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(1272)
<223>rocG
<400>32
atg tca gca aag caa gtc tcg aaa gat gaa gaa aaa gaa gct ctt aac 48
Met Ser Ala Lys Gln Val Ser Lys Asp Glu Glu Lys Glu Ala Leu Asn
1 5 10 15
tta ttt ctg tct acc caa aca atc att aag gaa gcc ctt cgg aag ctg 96
Leu Phe Leu Ser Thr Gln Thr Ile Ile Lys Glu Ala Leu Arg Lys Leu
20 25 30
ggt tat ccg gga gat atg tat gaa ctc atg aaa gag ccg cag aga atg 144
Gly Tyr Pro Gly Asp Met Tyr Glu Leu Met Lys Glu Pro Gln Arg Met
35 40 45
ctc act gtc cgc att ccg gtc aaa atg gac aat ggg agc gtc aaa gtg 192
Leu Thr Val Arg Ile Pro Val Lys Met Asp Asn Gly Ser Val Lys Val
50 55 60
ttc aca ggc tac cgg tca cag cac aat gat gct gtc ggt ccg aca aag 240
Phe Thr Gly Tyr Arg Ser Gln His Asn Asp Ala Val Gly Pro Thr Lys
65 70 75 80
ggg ggc gtt cgc ttc cat cca gaa gtt aat gaa gag gaa gta aag gca 288
Gly Gly Val Arg Phe His Pro Glu Val Asn Glu Glu Glu Val Lys Ala
85 90 95
tta tcc att tgg atg acg ctc aaa tgc ggg att gcc aat ctt cct tac 336
Leu Ser Ile Trp Met Thr Leu Lys Cys Gly Ile Ala Asn Leu Pro Tyr
100 105 110
ggc ggc ggg aag ggc ggt att att tgt gat ccg cgg aca atg tca ttt 384
Gly Gly Gly Lys Gly Gly Ile Ile Cys Asp Pro Arg Thr Met Ser Phe
115 120 125
gga gaa ctg gaa agg ctg agc agg ggg tat gtc cgt gcc atc agc cag 432
Gly Glu Leu Glu Arg Leu Ser Arg Gly Tyr Val Arg Ala Ile Ser Gln
130 135 140
atc gtc ggt ccg aca aag gat att cca gct ccc gat gtg tac acc aat 480
Ile Val Gly Pro Thr Lys Asp Ile Pro Ala Pro Asp Val Tyr Thr Asn
145 150 155 160
tcg cag att atg gcg tgg atg atg gat gag tac agc cgg ctg cgg gaa 528
Ser Gln Ile Met Ala Trp Met Met Asp Glu Tyr Ser Arg Leu Arg Glu
165 170 175
ttc gat tct ccg ggc ttt att aca ggt aaa ccg ctt gtt ttg gga gga 576
Phe Asp Ser Pro Gly Phe Ile Thr Gly Lys Pro Leu Val Leu Gly Gly
180 185 190
tcg caa gga cgg gaa aca gcg acg gca cag ggc gtc acg att tgt att 624
Ser Gln Gly Arg Glu Thr Ala Thr Ala Gln Gly Val Thr Ile Cys Ile
195 200 205
gaa gag gcg gtg aag aaa aaa ggg atc aag ctg caa aac gcg cgc atc 672
Glu Glu Ala Val Lys Lys Lys Gly Ile Lys Leu Gln Asn Ala Arg Ile
210 215 220
atc ata cag ggc ttt gga aac gcg ggt agc ttc ctg gcc aaa ttc atg 720
Ile Ile Gln Gly Phe Gly Asn Ala Gly Ser Phe Leu Ala Lys Phe Met
225 230 235 240
cac gat gcg ggc gcg aag gtg atc ggg att tct gat gcc aat ggc ggg 768
His Asp Ala Gly Ala Lys Val Ile Gly Ile Ser Asp Ala Asn Gly Gly
245 250 255
ctc tac aac cca gac ggc ctt gat atc cct tat ttg ctc gat aaa cgg 816
Leu Tyr Asn Pro Asp Gly Leu Asp Ile Pro Tyr Leu Leu Asp Lys Arg
260 265 270
gac agc ttt ggt atg gtc acc aat tta ttt act gac gtc atc aca aat 864
Asp Ser Phe Gly Met Val Thr Asn Leu Phe Thr Asp Val Ile Thr Asn
275 280 285
gag gag ctg ctt gaa aag gat tgc gat att tta gtg cct gcc gcg atc 912
Glu Glu Leu Leu Glu Lys Asp Cys Asp Ile Leu Val Pro Ala Ala Ile
290 295 300
tcc aat caa atc aca gcc aaa aac gca cat aac att cag gcg tca atc 960
Ser Asn Gln Ile Thr Ala Lys Asn Ala His Asn Ile Gln Ala Ser Ile
305 310 315 320
gtc gtt gaa cgg gcg aac ggc ccg aca acc att gat gcc act aag atc 1008
Val Val Glu Arg Ala Asn Gly Pro Thr Thr Ile Asp Ala Thr Lys Ile
325 330 335
ctg aat gaa aga ggc gtg ctg ctt gtg ccg gat atc cta gcg agt gcc 1056
Leu Asn Glu Arg Gly Val Leu Leu Val Pro Asp Ile Leu Ala Ser Ala
340 345 350
ggc ggc gtc acg gtt tct tat ttt gaa tgg gtg caa aac aac caa gga 1104
Gly Gly Val Thr Val Ser Tyr Phe Glu Trp Val Gln Asn Asn Gln Gly
355 360 365
tat tat tgg tcg gaa gaa gag gtt gca gaa aaa ctg aga agc gtc atg 1152
Tyr Tyr Trp Ser Glu Glu Glu Val Ala Glu Lys Leu Arg Ser Val Met
370 375 380
gtc agc tcg ttc gaa aca att tat caa aca gcg gca aca cat aaa gtg 1200
Val Ser Ser Phe Glu Thr Ile Tyr Gln Thr Ala Ala Thr His Lys Val
385 390 395 400
gat atg cgt ttg gcg gct tac atg acg ggc atc aga aaa tcg gca gaa 1248
Asp Met Arg Leu Ala Ala Tyr Met Thr Gly Ile Arg Lys Ser Ala Glu
405 410 415
gca tcg cgt ttc cgc gga tgg gtc taa 1275
Ala Ser Arg Phe Arg Gly Trp Val
420 425
机译： 长链脂肪酸生物转化的转化大肠杆菌突变株及使用相同方法的长链脂肪酸生物转化方法
机译： 纤维素转化株和使用所述转化株生产丁香酚
机译： 来自螺旋藻的H型硫氧还蛋白和使用相同的抗氧化能力增强的转化株
