缓释性的含有带负电荷基团的低分子药物的纳米粒子

具体实施方式

本发明的含有带负电荷基团的低分子药物的纳米粒子是如下得到的：利用金属离子对带负电荷基团的低分子药物进行疏水化，并使其与聚L-乳酸或聚(L-乳酸/乙醇酸)共聚物、和聚DL-或L-乳酸-聚乙二醇嵌段共聚物或聚(DL-或L-乳酸/乙醇酸)-聚乙二醇嵌段共聚物发生作用。此外，其中还可以混合有表面活性剂，通过混合表面活性剂，可以使生成的纳米粒子稳定化。

本发明的含有带负电荷基团的低分子药物的纳米粒子的一个特征在于，作为用于形成纳米粒子的生物降解性高分子，使用L异构体聚L-乳酸或聚(L-乳酸/乙醇酸)共聚物。

与聚-DL-乳酸相比，已知聚-L-乳酸对有机溶剂的溶解性不同，此外结晶性高。本发明通过将聚-L-乳酸与聚DL-或L-乳酸-聚乙二醇嵌段共聚物或聚(DL-或L-乳酸/乙醇酸)-聚乙二醇嵌段共聚物一同混合形成纳米粒子，能够抑制聚-L-乳酸在水相中的结晶化，能够制备可稳定分散的纳米粒子。

聚-L-乳酸在丙酮中为不溶性，因此为了提高其溶解性，使用丙酮/二氧六环或者丙酮/四氢呋喃的混合液来制备纳米粒子。

上述含有带负电荷基团的低分子药物的纳米粒子中还可以混合有表面活性剂，通过混合表面活性剂，可以使生成的纳米粒子稳定化，抑制粒子间的凝集。

上述提供的本发明的含有带负电荷基团的低分子药物的纳米粒子，可以通过制成静脉注射用制剂、局部注射用制剂、滴鼻剂、滴眼剂、吸入剂、喷雾剂等非口服给药制剂来进行给药。

本发明提供的含有带负电荷基团的低分子药物的纳米粒子可以按照如下制作。

也就是说，将带负电荷基团的低分子药物和金属离子在有机溶剂或含水有机溶剂的溶剂中混合，制成疏水性药物，在该混合液中加入聚L-乳酸或聚(L-乳酸/乙醇酸)共聚物、和聚DL-或L-乳酸-聚乙二醇嵌段共聚物或聚(DL-或L-乳酸/乙醇酸)-聚乙二醇嵌段共聚物，进行搅拌，将该溶液添加在水中进行扩散，由此进行制备。

此外，也可以通过同时加入在溶剂中溶解有聚L-乳酸或聚(L-乳酸/乙醇酸)共聚物、和聚DL-或L-乳酸-聚乙二醇嵌段共聚物或聚(DL-或L-乳酸/乙醇酸)-聚乙二醇嵌段共聚物的溶液、带负电荷基团的低分子药物的水溶液和金属离子水溶液并混合来制备同样的纳米粒子。

通过使用聚DL-或L-乳酸-聚乙二醇嵌段共聚物或聚(DL-或L-乳酸/乙醇酸)-聚乙二醇嵌段共聚物作为纳米粒子的表面改性剂，可以抑制聚L-乳酸或聚(L-乳酸/乙醇酸)共聚物在水相中的结晶化，结果可以得到粒子大小均匀的稳定的纳米粒子。

所使用的金属离子是锌离子、铁离子、铜离子、镍离子、铍离子、锰离子、钴离子中的任意离子，使用它们的水溶性金属盐中的一种或两种以上。其中优选锌离子、铁离子，优选使用氯化锌、氯化铁等。

上述反应中使用的溶液是丙酮、乙腈、乙醇、甲醇、丙醇、二甲基甲酰胺、二甲亚砜、二氧六环、四氢呋喃等有机溶剂，或者是这些的含水溶剂，优选丙酮、二甲基甲酰胺、二氧六环、四氢呋喃。

带负电荷基团的低分子药物优选在分子内具有磷酸基、硫酸基或羧基以便易于与上述金属离子结合而疏水化，此外，该低分子药物的分子量为1,000以下是适宜的。

作为这种带负电荷基团的低分子药物，可以举出各种药物，其中适宜的是水溶性的抗炎甾体、非甾体抗炎药、前列腺素或其衍生物、抗微生物药或抗癌药，更具体地说，可以举出磷酸倍他米松、磷酸地塞米松、磷酸泼尼松龙、磷酸氢化可的松、琥珀酸泼尼松龙、琥珀酸氢化可的松等抗炎甾体；洛索洛芬、布洛芬、酮洛芬、双氯芬酸、芬布芬等非甾体抗炎药；前列腺素E₁、前列腺素E₂或其衍生物；万古霉素、琥珀酸氯霉素、拉氧头孢、头孢匹罗、磷酸克林霉素、卡芦莫南等抗微生物药；长春新碱、长春碱等抗癌药等，但并不受限于此。

聚DL-或L-乳酸-聚乙二醇嵌段共聚物(有时也将DL-型称为PDLLA-PEG，将L-型称为PLLA-PEG)或聚(DL-或L-乳酸/乙醇酸)-聚乙二醇嵌段共聚物(有时也将DL-型称为PDLLGA-PEG，将L-型称为PLLGA-PEG)可以通过将聚DL-乳酸(有时也称为PDLLA)或聚L-乳酸(有时也称为PLLA)或聚(DL-乳酸/乙醇酸)共聚物(有时也称为PDLLGA)或聚(L-乳酸/乙醇酸)共聚物(有时也称为PLLGA)(将这些聚合物称为嵌段A)与聚乙二醇(有时也称为PEG)(称为嵌段B)在乙烯二甲氨基丙基碳二亚胺等缩合剂的存在下进行反应而生成，但也可以使用市售的相同的嵌段共聚物。

作为嵌段共聚物的构成，A-B型、A-B-A型、B-A-B型中的任一个都可以达到本发明的目的。此外，这些嵌段共聚物的重均分子量优选为3,000～30,000。

此外，对于本发明的含有带负电荷基团的低分子药物的纳米粒子来说，相对于聚DL-或L-乳酸-聚乙二醇嵌段共聚物或聚(DL-或L-乳酸/乙醇酸)-聚乙二醇嵌段共聚物，提高聚L-乳酸或聚(L-乳酸/乙醇酸)共聚物的混合比时，具有生成大的纳米粒子以及增大药物在纳米粒子中的包封率的倾向。

本发明的含有带负电荷基团的低分子药物的纳米粒子中，通过进一步混合碱性低分子化合物可以增加药物在纳米粒子中的包封率，包封至10％左右。

作为这种碱性低分子化合物，可以举出(二甲氨基)吡啶、吡啶、哌啶、嘧啶、吡嗪、哒嗪、喹啉、奎宁环、异喹啉、双(二甲氨基)萘、萘胺、吗啉、金刚烷胺、苯胺、精胺、亚精胺、1，6-己二胺、腐胺、尸胺、苯乙胺、组胺、二氮杂二环辛烷、二异丙基乙胺、单乙醇胺、二乙醇胺、三乙醇胺、乙胺、二乙胺、三乙胺、甲胺、二甲胺、三甲胺、三乙二胺、二乙三胺、乙二胺、1，3-丙二胺等，优选为仲胺类或叔胺类，特别优选为二乙醇胺。

如此制备的含有带负电荷基团的低分子药物的纳米粒子中还可以混合有表面活性剂，通过混合表面活性剂，可以使生成的纳米粒子稳定化，并且能够抑制粒子间的凝集。因此，对于含有纳米粒子的制剂的制剂化工序来说是优选的。

作为可使用的表面活性剂，可以举出磷脂酰胆碱、聚氧乙烯(20)山梨糖醇酐单油酸酯、聚氧乙烯(20)山梨糖醇酐单月桂酸酯、聚氧乙烯(20)山梨糖醇酐单硬脂酸酯、聚氧乙烯(20)山梨糖醇酐单棕榈酸酯、聚氧乙烯(20)山梨糖醇酐三油酸酯、聚氧乙烯(80)辛基苯基醚、聚氧乙烯(20)胆固醇酯、脂质-聚乙二醇、聚氧乙烯氢化蓖麻油和脂肪酸-聚乙二醇共聚物等，优选使用从这些表面活性剂中选择的一种或两种以上。

本发明提供的含有带负电荷基团的低分子药物的纳米粒子中，其粒子的直径为20～300nm的范围内，优选为50～200nm，可以依据各药物所目的的靶位患部来决定其粒径。

例如，当药物使用在关节炎、癌、闭塞性动脉硬化症等中时，优选静脉注射具有50～200nm粒径的纳米粒子。此粒径可以通过调节溶解PDLLA-PEG或PLLA-PEG或PDLLGA-PEG或PLLGA-PEG的溶剂(优选丙酮或二氧六环)的量来进行调整，可以通过增加丙酮或二氧六环的量来获得小粒径的纳米粒子。此外，存在纳米粒子的粒径越大，药物的包封率越高的倾向。

对于如此制备的本发明的含有带负电荷基团的低分子药物的纳米粒子来说，利用离心分离、超滤、凝胶过滤、过滤器过滤、纤维透析等操作对纳米粒子的溶液或悬浮液进行适当精制后冷冻干燥，由此获取并保存。

此时，优选加入稳定剂和/或分散剂后进行冷冻干燥，以便能够将冷冻干燥的制剂再悬浮并给药，作为这种稳定剂、分散剂，优选使用蔗糖、海藻糖、羧甲基纤维素钠等。

本发明提供的含有带负电荷基团的低分子药物的纳米粒子可以制成静脉注射用制剂、局部注射用制剂、滴鼻剂、滴眼剂、吸入剂、喷雾剂等非口服给药制剂的药物来使用，其中，通过制成静脉注射用制剂，可以更好地发挥该纳米粒子的特性、效果。

作为制备这些非口服给药制剂时使用的主剂及其他添加剂成分，可以举出制剂学上容许使用的各种主剂、成分。具体地说，可以根据剂型适当选择使用生理盐水、单糖类、双糖类、糖醇类、多糖类等糖类；羟乙基纤维素、羟丙基纤维素、甲基纤维素等高分子添加剂；离子型或非离子型表面活性剂；等等。

实施例

以下通过实施例更详细说明本发明，但本发明并不限于这些实施例。

实施例1：聚DL-乳酸-聚乙二醇嵌段共聚物(PDLLA-PEG)的合成

在二口圆底烧瓶中添加40g甲氧基-PEG(Mw5200、日本油脂社制)、40g D，L-丙交酯(Purac社制)、辛酸锡(400mg)，充分混合。用油压泵脱气后，在油浴中于110℃加热、使之溶解。溶解后升温至155℃，反应4小时。冷却反应物(固体物质)后，溶解在250mL程度的二氯甲烷中，缓慢添加在2.5L冰冷却的异丙醇中，再沉淀精制，冷冻干燥，从而合成出聚DL-乳酸-聚乙二醇嵌段共聚物(PDLLA-PEG)。利用凝胶渗透色谱法(GPC)或者质子NMR对合成物进行评价。

通过GPC确认到与甲氧基-PEG相比分子量的增大，并且通过质子NMR确认到聚乳酸的存在，由此确认合成了PDLLA-PEG。此外，改变D，L-丙交酯的量与上述同样地进行操作，得到了分子量不同的PDLLA-PEG。

此外，除了将D，L-丙交酯改为D，L-丙交酯和乙交酯的混合物之外，进行与上述相同的操作，合成了PDLLGA-PEG。

实施例2：包封有前列腺素E₁(PGE₁)的由PLLA和PDLLA-PEG构成的纳米粒子的制造方法

称取预定量的PLLA(多木化学社制)，溶解在225μL的二氧六环中。称取预定量的实施例1合成的PDLLA-PEG，溶解在175μL丙酮中，并与上述二氧六环溶液一同混合。在该混合液中添加溶解有5mg PGE₁的丙酮溶液250μL，接着添加溶解有预定量的二乙醇胺的丙酮溶液100μL。立即添加预定量的500mM的无水氯化铁丙酮溶液，进行混合，在室温下放置10分钟。在50mL的样品瓶中加水25mL，一边用2cm的搅拌子搅拌，一边用带有26G注射针的3mL注射器在其中缓慢滴入上述反应液(搅拌器转速：1000rpm、注射针：26G、注射器：尼普洛3mL、滴加速度：48L/hr)。在得到的悬浮液中添加500mM的EDTA水溶液(pH7)2.5mL和200mg/mL的Tween 80[聚氧乙烯(20)山梨糖醇酐单油酸酯]水溶液12μL。通过超滤(YM-50、Amicon社制)浓缩后，添加50mM的EDTA水溶液(pH7)，再次进行浓缩(此操作重复2次)。对得到的浓缩悬浮液超声波照射30秒后，离心(1000rpm、5分钟)除去凝集块，用动态光散射测定装置测定粒径，用HPLC对粒子内PGE₁的包封率进行定量。

表1给出氯化铁和二乙醇胺的使用量对PGE₁在纳米粒子中的包封率的关系，表2给出氯化铁的添加量对PGE₁在纳米粒子中的的包封率的关系，表3给出PDLLA-PEG与PLLA的混合比例与纳米粒子的粒径和PGE₁的包封率的关系。

表1：通过使用固定铁量(7.5μmol)、改变二乙醇胺的量所制备的纳米粒子的PGE₁包封率

[表1]

从表1的结果可以确认，PGE₁包封率受二乙醇胺量的影响，存在提高包封率的最佳的二乙醇胺量。

表2：通过改变铁的总添加量所制备的纳米粒子的PGE₁包封率

[表2]

从表2的结果可以确认，PGE₁包封率受添加的铁量的影响，铁量越多，包封率越高。

表3：通过改变PDLLA-PEG与和PLLA的混合比所制备的纳米粒子的粒径和PGE₁包封率。

[表3]

从表3给出的结果可以确认，PDLLA-PEG相对于PLLA的混合比越高，越能够制备出较小的粒子，但PGE₁的包封率变低。

此外，上述表1～3中的任一个粒子中，通过利用PDLLA-PEG制备粒子，能够制备出在水中PLLA也不结晶化、可维持粒径的稳定的粒子。

实施例3：包封有前列腺素E₁(PGE₁)的由PLLA和PDLLA-PEG构成的纳米粒子的缓释性

实施例2中，使用PGE₁ 5mg、PLLA 13mg、PDLLA-PEG 12mg、二乙醇胺4.7mg和氯化铁7.5μmol，除此以外，利用相同的方法制作包封有PGE₁的由PLLA和PDLLA-PEG构成的纳米粒子(称为PLLA粒子)。

作为对照，使用DL-型的聚DL-乳酸(PDLLA)来代替PLLA，制作出包封有PGE₁的由PDLLA和PDLLA-PEG构成的纳米粒子(称为PDLLA粒子)。

将制作的PLLA粒子或PDLLA粒子分散在磷酸缓冲液/牛血清(等量混合液)中，在37℃进行培养。为了测定两种粒子的缓释性，利用HPLC经时地对粒子内残留的PGE₁量进行定量。

其结果见表4。

表4：由PGE₁纳米粒子中的释放(缓释性)

[表4]

ND：未检测出

从表4中给出的结果可以确认，与由PDLLA(DL型)制备的纳米粒子相比，由PLLA(L型)制备的纳米粒子更缓慢、长时间地释放PGE₁，因此缓释性优异。

实施例4：包封有前列腺素E₁(PGE₁)的由PLLA和PDLLA-PEG构成的纳米粒子的细胞内摄入

除了在丙酮溶液中添加罗丹明之外，利用与实施例3相同的方法制备包封有荧光色素罗丹明的纳米粒子。此外，作为对照，同样地制备不使用PDLLA-PEG而仅由PLLA构成的包封有罗丹明和PGE₁的纳米粒子。将得到的各种纳米粒子添加到RAW细胞(小鼠巨噬细胞状细胞)中，于37℃培养2小时后，利用荧光显微镜观察细胞。

其结果见图1。从图1可以确认，作为对照的仅由PLLA制备的纳米粒子被显著地摄入细胞内，与此相对，由PLLA和PDLLA-PEG制备的纳米粒子的细胞内摄入受到抑制。

图1中，蓝色表示基于DAPI(4′，6-二氨基-2-苯基吲哚)的核染色，红色表示罗丹明的分布。此外，照片A)表示仅添加罗丹明时的浓度分布，照片B)表示仅由PLLA制备的包封有罗丹明和PGE₁的纳米粒子的浓度分布，照片C)表示由PLLA和PDLLA-PEG制备的包封有罗丹明和PGE₁的纳米粒子的浓度分布。比例尺表示50μm。

实施例5：包封有磷酸倍他米松的由PLLA和PDLLA-PEG构成的纳米粒子的制造方法

称取PLLA(多木化学社制)36mg，溶解在450μL的二氧六环中。称取实施例1合成的14mg PDLLA-PEG和7.5mg二乙醇胺，溶解在1050μL丙酮中，并与上述二氧六环溶液一同混合。在该混合液中添加1M氯化锌水溶液68μL，接着添加350mg/mL的磷酸倍他米松水溶液28μL。在室温下静置30分钟程度。在50mL的样品瓶中加水25mL，一边用2cm的搅拌子搅拌，一边用带有26G注射针的3mL注射器在其中缓慢滴入上述反应液(搅拌器转速：1000rpm、注射针：26G、注射器：尼普洛3mL、滴加速度：48L/hr)。在得到的悬浮液中添加0.5M的柠檬酸钠水溶液(pH7)500μL和Tween 80[聚氧乙烯(20)山梨糖醇酐单油酸酯]水溶液(200mg/mL)125μL。通过超滤(YM-50、Amicon社制)浓缩后，添加水，再次进行浓缩(此操作重复2次)。对得到的浓缩悬浮液超声波照射30秒后，离心(1000rpm、5分钟)除去凝集块。

用动态光散射测定装置测定所得到的纳米粒子的粒径，用HPLC对磷酸倍他米松在纳米粒子内的包封率进行定量。

其结果，制备出了在PLLA和PDLLA-PEG的粒子中包封有磷酸倍他米松的纳米粒子，其中磷酸倍他米松在纳米粒子内的包封率为8.6重量％，粒径约为100nm。

实施例6：包封有磷酸泼尼松龙的由PLLA和PDLLA-PEG构成的纳米粒子的制造方法

通过与上述实施例5相同的方法，在丙酮中溶解PLLA(多木化学社制)、实施例1合成的PDLLA-PEG、二乙醇胺，并与PLLA的二氧六环溶液一同混合。在该混合液中添加1M氯化锌水溶液，接着添加磷酸泼尼松龙水溶液，然后与实施例5同样地进行处理，得到包封有磷酸泼尼松龙的纳米粒子。

用动态光散射测定装置测定所得到的纳米粒子的粒径，用HPLC对磷酸泼尼松龙在纳米粒子内的包封率进行定量，其结果，制备出了在PLLA和PDLLA-PEG的粒子中包封有磷酸泼尼松龙的纳米粒子，其中包封率为8.5重量％，粒径约为100nm。

工业实用性

如上所述，本发明的含有带负电荷基团的低分子药物的纳米粒子将带负电荷基团的药物导向患部，药物的缓释性优异，并且通过降低在肝脏中的蓄积而减轻了副作用，并且血中的滞留性优异，因此作为药物是有用的，其工业实用性很大。