法律状态公告日
法律状态信息
法律状态
2014-01-15
未缴年费专利权终止 IPC(主分类):C12Q1/68 授权公告日:20111207 终止日期:20121125 申请日:20091125
专利权的终止
2011-12-07
授权
授权
2010-07-21
实质审查的生效 IPC(主分类):C12Q1/68 申请日:20091125
实质审查的生效
2010-06-02
公开
公开
技术领域
本发明属于一种检测有机小分子与结合蛋白相互作用的生物传感方法，包括末端有机小分子修饰的寡核苷酸DNA链与蛋白质相互作用及其核酸外切酶I保护分析和基于标记有有机小分子寡核苷酸DNA链修饰的Au纳米颗粒进行保护的比色检测方法。
背景技术
有机小分子与结合蛋白相互作用、药物与化学毒素等有机小分子以及小分子结合蛋白的快速筛查与检测对于临床诊断、医学研究、食品与公共安全、药物筛选、环境监测等领域具有极其重要的意义。目前常用的有机小分子与结合蛋白相互作用法的检测技术主要有表面等离子共振、酶互补片段免疫分析以及荧光各向异性分析等。这些检测技术需要复杂的操作，精密的仪器，成本较高。
发明内容
本发明要解决的技术问题是，针对现有技术存在的不足，提出一种基于核酸外切酶1保护分析检测有机小分子和蛋白质相互作用的可视传感方法，此方法对DNA序列没有依赖性，操作简单，只需要把标记有机小分子的DNA链通过Au-S键相互作用修饰到Au纳米颗粒上，核酸外切酶I作用后Au纳米颗粒在不同程度上发生团聚，使溶液的颜色和紫外吸光度都会有很大变化，通过此方法可检测小分子和结合蛋白相互作用、也可以检测结合蛋白，或通过竞争反应检测小分子；该方法操作简单、快速、灵敏，可直接目视进行定性分析。
本发明的技术方案是，所述基于核酸外切酶I保护分析检测有机小分子和蛋白质相互作用的可视传感方法包括：
(1)Au纳米颗粒上末端有机小分子修饰的寡核苷酸DNA单链与蛋白质的相互作用以及核酸外切酶I的保护分析；
(2)Au纳米颗粒上修饰的标记有机小分子的寡核苷酸DNA单链在保护分析过程中进行定性分析和定量检测。
以下对本发明做出进一步说明。
本发明中，所述Au纳米颗粒上末端有机小分子修饰的寡核苷酸DNA单链与蛋白质的相互作用以及核酸外切酶I的保护分析为：
对于有机小分子与结合蛋白的相互作用以及核酸外切酶I的保护分析，检测步骤是：取所述用有机小分子修饰的寡核苷酸DNA单链标记的Au纳米颗粒的储备液置于微量管中；在微量管中加入包含有小分子结合蛋白的样品溶液；然后加入核酸外切酶I反应，得末端保护后的Au纳米颗粒的溶液；
对于有机小分子的检测以及核酸外切酶I的保护分析，采用竞争反应检测步骤是：取所述用有机小分子修饰的寡核苷酸DNA单链标记的Au纳米颗粒的储备液置于微量管中；再加包含有待测小分子的样品溶液，均匀混合后加入小分子结合蛋白或单克隆抗体溶液；再加入核酸外切酶I，得末端保护后的Au纳米颗粒的溶液；
Au纳米颗粒上修饰的标记有机小分子的寡核苷酸DNA单链在保护分析过程中进行定性分析和定量检测；定性分析为采用直接目视观察颜色的改变，定量检测为采用标准的紫外分光光度计对保护前后纳米金的紫外吸收进行检测。
本发明中，所述单链寡核苷酸DNA末端有机小分子的修饰是通过现有的交联反应技术实现。对于带有羧基的有机小分子，可以采用1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)-碳二亚胺与琥珀酰亚胺交联反应技术与3’端NH2标记的寡核苷酸DNA单链进行交联；交联反应产物可用透析纯化。
本发明中，所述的有机小分子修饰的单链寡核苷酸DNA标记的金纳米颗粒通过文献成熟的标记方法实现。修饰有小分子的单链寡核苷酸DNA链的另一端修饰有-SH官能团，通过Au-S键相互作用实现Au纳米颗粒的修饰。通过离心去除未标记的DNA链，离心后的金纳米颗粒悬浮于ExoI标准缓冲溶液(67mM Glycine-KOH(pH 9.5)，5mM MgCL2)备用。
进一步地，在本发明中，所述Au纳米颗粒上末端有机小分子修饰的寡核苷酸DNA单链与蛋白质的相互作用以及核酸外切酶I的保护分析采用以下步骤实现：
a.对于有机小分子与结合蛋白的相互作用以及核酸外切酶I的保护分析，检测步骤是：取5μL修饰有机小分子的单链寡核苷酸DNA标记的金纳米颗粒的储备液于微量管中，加入10μL 5×ExoI标准缓冲溶液，该缓冲溶液为67mM Glycine-KOH(pH 9.5)，5mM MgCL2；再加入5μL包含待测小分子结合蛋白的溶液和30μL的灭菌水，37℃反应30min，然后加入0.5μL的核酸外切酶I，置于37℃反应5min，得到核酸外切酶I处理后的纳米金溶液a。
b.对于有机小分子的检测以及核酸外切酶I的保护分析，采用竞争反应检测步骤是：取5μL所述的修饰有机小分子的单链寡核苷酸DNA链标记的金纳米颗粒的储备液于微量管中，加入10μL 5×ExoI标准缓冲溶液，该溶液为67mM Glycine-KOH(pH 9.5)，5mM MgCL2；再加入5μL包含待测小分子的样品溶液，混合均匀后加入一定浓度的小分子的结合蛋白或(鼠源)单克隆抗体3μL，小分子的结合蛋白或(鼠源)单克隆抗体终当量浓度为加入的有机小分子修饰寡核苷酸DNA单链浓度的5倍；在37℃恒温反应0.5小时；然后加入0.5μL核酸外切酶I，置于37℃反应5分钟，得核酸外切酶处理后的纳米金溶液b。
注意，以上反应条件为最优条件，所述溶液体积均可成倍变化不改变最优结果。改变比例或试剂加入顺序可使有机小分子修饰寡核苷酸DNA单链的保护效率在3％～100％内变化。
本发明中，所述的末端保护单链寡核酸DNA标记的金纳米颗粒可采用的检测方法：
(1)通过肉眼观察酶切处理后的溶液a或b颜色从红到紫到兰的差异。
(2)吸收广度法检测：直接检测酶切处理后的溶液a或b纳米金最大吸收处紫外光吸光度的变化值。
本发明建立的基于核酸外切酶I端点保护分析检测有机小分子与结合蛋白相互作用的生物传感技术，利用小分子修饰的单链寡核苷酸DNA链修饰的纳米金在核酸外切酶I作用下，没有被保护的DNA链被核酸外切酶I降解，从而使纳米金团聚变色，但是被修饰的小分子和结合蛋白相互作用后，被保护的DNA链仍能使纳米金分散在溶液中，呈现酒红色。因此，该技术可直接用于小分子结合蛋白的检测，也可通过样品溶液中小分子与小分子标记的寡核苷酸DNA单链竞争与抗体结合间接检测有机小分子。它灵敏度高，操作快速简便，可望为临床诊断、药物研发、药毒物分析、环境监测等提供一个通用技术平台。
具体实施方式：
实施例1：基于核酸外切酶末端保护分析所介导的纳米金变色检测赭曲霉素A
1)3’端NH2标记的寡核苷酸DNA链和赭曲霉素A的交联
称取9.3mg的赭曲霉素A溶于2.5mL磷酸盐缓冲溶液(0.1M NaH2PO4，pH 7.4)，再加入1mg的1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)-碳二亚胺(EDC)，在室温下搅拌15min，再加入2.8mg琥珀酰亚胺(NHS)，在室温反应30分钟；取260μl活化后的赭曲霉素A溶液加入到260μl浓度为10μM的3’端NH2标记5’端SH或Dual SH标记的单链寡核苷酸DNA(序列为5’-TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTGCTGAGTCTTTTATATCTCTTTTT-3’(注：序列是任意的))的溶液中，用1M的NaOH调其pH为7.4，在轻微搅拌下室温反应2小时。
把交联反应产物移到1mL的透析管中，透析管的截留分子量为6000D。把透析管放入500ml磷酸盐缓冲溶液(0.1M NaH2PO4，pH 7.4)中在4℃透析12小时，每隔3小时更换一次透析液，最后一次用超纯水透析。透析之后的寡核苷酸DNA链分管保存于-20℃的冰箱中备用。
2)赭曲霉素A修饰的单链寡核苷酸DNA标记金纳米颗粒
取上述赭曲霉素A标记的寡核苷酸DNA单链储备液(1μM)1mL加入到离心后纳米金中，室温老化24h；随后加入0.1M磷酸缓冲溶液(KH2PO4，Na2HPO4 pH 7.0)和10mM磷酸盐缓冲溶液(10mM KH2PO4，Na2HPO4 pH 7.0和2M NaCL)，使最终的磷酸缓冲溶液的浓度为10mM，NaCl的浓度为0.1M，室温老化48h；最后再加10mM磷酸盐缓冲溶液(10mM KH2PO4，Na2HPO4 pH 7.0和2M NaCL)，使最终NaCL的浓度为0.3M；通过在15000转速离心去除没有标记上的DNA，离心之后的金纳米颗粒复溶于200μl ExoI缓冲溶液中(67mM Glycine-KOH(pH 9.5)5mM MgCL2)4℃保存备用。
3)赭曲霉素A的检测
取5μL所述的修饰有机小分子的单链寡核苷酸DNA标记的金纳米颗粒的储备液于微量管中，加入10μL 5×ExoI标准缓冲溶液，该溶液为67mM Glycine-KOH(pH 9.5)5mMMgCL2，再加入5μl待检测的赭曲霉素A样品溶液，混合均匀后加入3μl浓度为1μL的赭曲霉素A鼠源单克隆抗体，再加入27μL灭菌水，室温反应15分钟，反应后加入0.5μl核酸外切酶I(NEB公司)在37℃酶切30分钟；反应后的终产物直接加入到50μl的紫外比色杯中进行紫外分光光度检测在其最大吸收值的吸光度变化。
按上述1)、2)和3)步骤对7个配制的赭曲霉素A标准溶液(浓度从1nM到200nM，共做7个不同的浓度)进行检测，记录各标准溶液样品最大吸收值的吸光度变化。用紫外吸光度变化值对标准溶液中赭曲霉素A浓度作图获得标准曲线。
实施例2：基于核酸外切酶末端保护分析所介导的纳米金变色检测叶酸结合蛋白
1)3’端NH2标记的寡核苷酸DNA链和叶酸的交联
称取10mg的叶酸溶于2.5mL磷酸盐缓冲溶液(0.1M KH2PO4和Na2HPO4，pH 7.4)，再加入1mg的1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)-碳二亚胺(EDC)，在室温下搅拌15分钟，再加入2.8mg琥珀酰亚胺(NHS)，在室温反应30分钟；取260μl活化后的叶酸溶液加入到260μl浓度为1μM的3’端NH2标记5’端SH或Dual SH标记的单链寡核苷酸DNA(序列5’-TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTGCTGAGTCTTTTATATCTCTTTTT-3’(注：序列是任意的))的溶液中，用1M的NaOH调其pH为7.4，在轻微搅拌下室温反应2小时。
把交联反应产物移到1mL的透析管中，透析管的截留分子量为6000D。把透析管放入500ml磷酸盐缓冲溶液(00.1M KH2PO4和Na2HPO4，pH 7.4)中在4℃透析12小时，每隔3小时更换一次透析液，最后一次用超纯水透析。透析之后的寡核苷酸DNA链分保存于-20℃的冰箱中备用。
2)叶酸修饰的单链寡核苷酸DNA标记纳米金颗粒
取上述叶酸标记的寡核苷酸DNA单链储备液(1μM)1mL加入到离心后纳米金中，室温老化24h；随后加入0.1M磷酸缓冲溶液(KH2PO4，Na2HPO4 pH 7.0)和10mM磷酸盐缓冲溶液(10mM KH2PO4，Na2HPO4 pH 7.0和2M NaCL)，使最终的磷酸缓冲溶液的浓度为10mM，NaCl的浓度为0.1M，室温老化48h；最后再加10mM磷酸盐缓冲溶液(10mMKH2PO4，Na2HPO4 pH 7.0和2M NaCL)，使最终NaCL的浓度为0.3M；通过在15000转速离心去除没有标记上的DNA，离心之后的纳米金复溶于200μl ExoI缓冲溶液中(67mMGlycine-KOH(pH 9.5)5mM MgCL2)4℃保存备用。
3)叶酸结合蛋白的检测
取5μL所述的修饰有机小分子的单链寡核苷酸DNA标记的金纳米颗粒的储备液于微量管中，加入10μL 5×ExoI标准缓冲溶液，该溶液为67mM Glycine-KOH(pH 9.5)5mMMgCL2，再加入5μl待检测的叶酸结合蛋白样品溶液，再加入30μL灭菌水，室温反应15分钟，反应后加入0.5μl核酸外切酶I(NEB公司)在37℃酶切30分钟；反应后的终产物直接加入到50μl的紫外比色杯中进行紫外分光光度检测在其最大吸收值的吸光度变化。
按上述1)、2)和3)步骤对7个配制的叶酸结合蛋白标准溶液(浓度从1nM到200nM)进行检测，记录各标准溶液样品的最大吸收值的吸光度变化值做叶酸结合蛋白的浓度和荧光强度的标准曲线，未知样品中叶酸结合蛋白所产生的紫外吸光度的变化和标准的曲线对照确定其浓度。
机译： 基于功能的蛋白质-蛋白质相互作用数据的提取方法和可视化方法及使用该方法的装置
机译： 蛋白质相互作用数据的基于函数的抽象方法以及使用该方法的可视化方法和装置
机译： 基于单分子孔的蛋白质和瞬时蛋白质-蛋白质相互作用的传感器
