腰果梨的原花色素、含有原花色素的组合物、及其用途

技术领域

本发明提供源于腰果梨的高分子原花色素和含有其的腰果梨处理物，以及其用途。

背景技术

腰果树(Anacardium occidentale)是原产于巴西的属于漆树科的常绿乔木，将花柄肥大而形成5～6cm的黄色西洋梨型的称作腰果梨，其具有类似于苹果的芳香，有时生食或以果汁等的形式食用。在该肥大的柄的前端结有2～3cm、弯曲勾玉状的、包着壳的果实。盛放在该壳中的仁的部分为腰果。腰果在世界范围内被广泛用于食用。

另一方面，花色素是指属于类黄酮、将花色素苷水解而得到的着色的糖苷配基，其根据羟基的结合数可大致分为花翠素型、矢车菊素型、天竺葵色素型这三种。原花色素是指通过在酸性条件下加热而生成花色素的成分，其是以缩合型丹宁、即黄烷-3-醇或黄烷-3，4-二醇为构成单元并通过缩合或聚合结合而成的化合物组。将通过酸性条件下的加热而产生花翠素的原花色素称作原花翠素、产生矢车菊素的原花色素称作原矢车菊素、产生天竺葵色素的原花色素称作原天竺葵色素。原花翠素已知是没食子儿茶素、表没食子儿茶素、没食子儿茶素没食子酸酯、和表没食子儿茶素没食子酸酯的聚合物，原矢车菊素已知是儿茶素、表儿茶素、儿茶素没食子酸酯、和表儿茶素没食子酸酯的聚合物。

已知腰果梨中含有腰果酸等成分，但没有原花色素存在的报道。

专利文献1（日本特开平9-291039）中公开了来自罗望子种皮提取物的以聚合度为2～80聚体的原矢车菊素为有效成分的抗肥胖剂。另外，专利文献2（日本特开2006-151944）中，报道了含有多酚的中性脂肪代谢控制剂，所述多酚源于含有原矢车菊素类的苹果。对于该原矢车菊素的脂肪酶抑制活性，非专利文献2（J. Agric. Food Chem. 2007, 55, 4604-4609）中，精密地纯化了每种聚合度的源于苹果的原矢车菊素，并对各自的脂肪酶抑制活性进行了研究。非专利文献2中指出9聚体以上的原矢车菊素的脂肪酶抑制IC₅₀为0.9μg/ml，同时测定的氯原酸（Chlorogenic acid）为59.8μg/ml。对于高分子原花翠素的α-淀粉酶抑制活性和脂肪酶抑制活性，尚且未知。

关于高分子原花翠素有以下报道。对于专利文献3（日本特开2008-138129）“淀粉酶抑制剂”，报道了含有选自表儿茶素、表儿茶素没食子酸酯、表没食子儿茶素没食子酸酯和表没食子儿茶素中的儿茶素类的聚合物的α淀粉酶抑制剂。其是利用酶反应而人工合成的聚合物，在权利要求中限定了其数均分子量为10000以下、聚合度为2～20。实施例中记载了合成全部表没食子儿茶素没食子酸酯的聚合物和表没食子儿茶素没食子酸酯与醛的缩聚物的结果。由专利文献3可以理解，将表没食子儿茶素没食子酸酯聚合化得到的原花翠素中具有α-淀粉酶抑制活性。但是，专利文献3记载的聚合物是利用人工反应得到的化合物，结构上不清楚的地方较多，食用时的安全性也要注意。

关于原花翠素的专利文献列举了以下文献。专利文献4（日本特开2006-16367）中报道了具有2聚体的多个分子结构的原花翠素的脂肪酶抑制活性。另外，专利文献5（日本特开2006-1909）中报道了具有脂肪酶抑制活性的新型化合物。这些专利文献指出，表没食子儿茶素没食子酸酯（（-）-epigallocatechin 3-O-gallate）的脂肪酶抑制IC₅₀为0.284μM和0.349μM（0.16μg/ml）。非专利文献1（J.Agric.Food Chem, 2003, 51, 7513-7521）中记载了对多种植物的原花色素的构成成分进行分析的结果。没有记载平均聚合度（mDP）为50以上的物质，另外也没有报道以表没食子儿茶素没食子酸酯作为构成成分的物质。另外，非专利文献1中记载了坚果类中“腰果”的原花色素存在（表）儿茶素的2聚体，但没有腰果梨的记载。

作为与源于葡萄的原花色素有关的专利文献，列举了以下文献。专利文献6（日本特开2000-44472）报道了作为“糖尿病并发症的预防或治疗药物”，从葡萄果实的种子、果皮等中得到的原花色素低聚物（2～30聚体，优选2～10聚体）具有血糖值升高抑制作用，其作为糖尿病治疗药物是有效的。专利文献6中没有记载关于淀粉酶酶抑制活性的报告，但其报道了原矢车菊素B-3（2聚体）和原花色素（葡萄种子提取物的原花色素低聚物）使糖尿病大鼠的血糖值降低的实施例。认为葡萄种子中提取物中的原花青素是原矢车菊素（（表）儿茶素聚合物）（参考非专利文献4（香粧会誌　Vol.27, No.4　（2003））和非专利文献1（J.Agric.Food Chem, 2003, 51, 7513-7521））。

另一方面，作为脂肪酶抑制剂，已知有各种活性成分。

专利文献7(日本特开2008-19180)中，记载了将圣诞秋海棠提取物的脂肪酶抑制活性与作为阳性对照的布洛芬吡啶甲醇和四环素盐酸盐进行比较的实验结果。

专利文献8(日本特开2005-53891)公开了一种要解决的课题在于提供脂肪酶抑制剂的发明，该脂肪酶抑制剂具有优异的胰脂肪酶或细菌性脂肪酶的抑制效果，且含有在多种植物中，安全性优异，并可有效地应对肥胖化倾向或粉刺、皮肤炎等。在专利文献8的实施例中，记载了咖啡酸（咖啡因酸或3,4－二羟基肉桂酸）、没食子酸、迷迭香酸作为脂肪酶抑制剂是有效的，还记载了其测定值。

专利文献9(日本特开2004-115466)中公开了含有原花色素的粉刺预防和治疗效果用皮肤外用剂。根据专利文献9的权利要求，原花色素来源于松树皮、葡萄、蓝莓、草莓、鳄梨、刺槐、越橘的果实或种子、大麦、小麦、大豆、黑大豆、可可、花生的薄皮、银杏叶。另外，实施例中没有关于脂肪酶抑制活性的记载，而记载了采用松树皮提取物进行粉刺菌等的最小抑菌试验的结果。

专利文献10(专利第3966689号)记载了含有属于景天科的蔷薇根景天和/或红景天的提取物的粉刺用皮肤疾病改善剂。在专利文献10中，实施例对于多种植物提取物研究了源于牛胰脏的脂肪酶抑制活性。其中，关于脂肪酶抑制活性IC₅₀为40μg/ml的蔷薇根景天和红景天的提取物，授予有专利权。

另一方面，粉刺主要是在青春期男女的脸面等上发生的一种皮肤疾病。作为其原因，认为是皮脂分泌的增加、表皮或粉刺菌的脂肪酶所生成的脂肪酸引起炎症、或粉刺菌的异常增殖等。粉刺的预防治疗一直以来使用抗菌剂（专利文献11、12等）。但是，存在抗菌剂所致的副作用、或针对抗菌剂的耐性菌的出现等问题、或抗菌剂所致的皮肤常在菌被过量杀菌等问题。需求安全性高、可抑制粉刺菌的过量增殖的制剂。

专利文献1：日本特开平9-291039号公报

专利文献2：日本特开2006-151944号公报

专利文献3：日本特开2008-138129号公报

专利文献4：日本特开2006-16367号公报

专利文献5：日本特开2006-1909号公报

专利文献6：日本特开2000-44472号公报

专利文献7：日本特开2008-19180号公报

专利文献8：日本特开2005-53891号公报

专利文献9：日本特开2004-115466号公报

专利文献10：日本专利第3966689号公报

专利文献11：日本特开2004-189656号公报

专利文献12：日本特开2006-213633号公报

非专利文献1：J. Agric. Food Chem., 2003, 51, 7513-7521

非专利文献2：J. Agric. Food Chem., 2007, 55, 4604-4609

非专利文献3：J. Agric. Food Chem., 2002, 50, 4852-4860

非专利文献4：香粧会誌, Vol.27, No.4 (2003)。

发明内容

发明要解决的课题

腰果梨在腰果采摘时多被废弃。期望对腰果梨进行有效利用。

因此，本发明的目的在于提供腰果梨的有用的用途。

本发明的目的还在于提供源于天然物的、具有α-淀粉酶抑制活性、脂肪酶抑制活性、针对粉刺菌的抗菌活性等有益活性的活性成分。

用于解决课题的手段

作为用于解决上述课题的手段，本发明提供以下发明。

(1) 含有源于腰果梨的原花色素的组合物，其利用含有下述工序的方法来制备：使植物纤维分解酶作用于腰果梨的工序、和利用截留分子量为10,000以上的超滤膜将该工序中得到的酶分解物进行浓缩的工序。

(2) （1）所述的组合物，其中，上述方法进一步含有在使植物纤维分解酶作用于腰果梨的工序之后进行的、将多酚浓缩或分离的工序。

(3) （1）或（2）所述的组合物，其中，上述方法进一步含有在使植物纤维分解酶作用于腰果梨的工序之后进行的、将原花色素浓缩或分离的工序。

(4) (1)～(3)中任一项所述的组合物，其中，上述原花色素含有原花翠素。

(5) 饮食品组合物、化妆品组合物或药物组合物，其含有(1)～(4)中任一项所述的组合物。

(6) 原花色素，其是至少含有（表）没食子儿茶素和（表）没食子儿茶素没食子酸酯作为构成单元的、平均聚合度为20以上的聚合物。

(7) （6）所述的原花色素，其中，作为构成单元，含有（表）没食子儿茶素50～80摩尔％、（表）没食子儿茶素没食子酸酯20～50摩尔％。

(8) （6）或(7)所述的原花色素，其中，进一步含有表儿茶素和表儿茶素没食子酸酯作为构成单元。

(9) (6)～(8)中任一项所述的原花色素，其中，聚合物的至少一个末端为表没食子儿茶素没食子酸酯。

(10) (6)～(9)中任一项所述的原花色素，其是从浓缩物中分离出的原花色素，所述浓缩物通过使植物纤维分解酶作用于腰果梨，并利用截留分子量为10,000以上的超滤膜将所得酶分解物进行浓缩而得。

(11) 饮食品组合物、化妆品组合物或药物组合物，其含有(6)～(10)中任一项所述的原花色素。

(12) α-淀粉酶抑制剂，其含有(1)～(4)中任一项所述的组合物作为有效成分。

(13) 症状通过抑制α-淀粉酶活性而被预防或改善的状态或疾病的预防剂或治疗剂，其含有(1)～(4)中任一项所述的组合物作为有效成分。

(14) 脂肪酶抑制剂，其含有(1)～(4)中任一项所述的组合物作为有效成分。

(15) 症状通过抑制脂肪酶活性而被预防或改善的状态或疾病的预防剂或治疗剂，其含有(1)～(4)中任一项所述的组合物作为有效成分。

(16) 脂质劣化抑制剂，其含有(1)～(4)中任一项所述的组合物作为有效成分。

(17) 针对粉刺菌（Propionibacterium acnes）的抗菌剂，其含有(1)～(4)中任一项所述的组合物作为有效成分。

(18) 症状通过抑制粉刺菌（Propionibacterium acnes）的增殖而被预防或改善的状态或疾病的预防剂或治疗剂，其含有(1)～(4)中任一项所述的组合物作为有效成分。

(19)α-淀粉酶抑制剂，其含有(6)～(10)中任一项所述的原花色素作为有效成分。

(20) 症状通过抑制α-淀粉酶活性而被预防或改善的状态或疾病的预防剂或治疗剂，其含有(6)～(10)中任一项所述的原花色素作为有效成分。

(21) 脂肪酶抑制剂，其含有(6)～(10)中任一项所述的原花色素作为有效成分。

(22) 症状通过抑制脂肪酶活性而被预防或改善的状态或疾病的预防剂或治疗剂，其含有(6)～(10)中任一项所述的原花色素作为有效成分。

(23) 脂质劣化抑制剂，其含有(6)～(10)中任一项所述的原花色素作为有效成分。

(24) 针对粉刺菌（Propionibacterium acnes）的抗菌剂，其含有(6)～(10)中任一项所述的原花色素作为有效成分。

(25) 症状通过抑制粉刺菌（Propionibacterium acnes）的增殖而被预防或改善的状态或疾病的预防剂或治疗剂，其含有(6)～(10)中任一项所述的原花色素作为有效成分。

本发明还可以是如以下记载的内容。

饮食品组合物、化妆品组合物或药物组合物，其含有相对于组合物总重量为0.025重量％以上、更优选0.05重量％以上的上述原花色素。

饮食品组合物、化妆品组合物或药物组合物，其不含有通过了截留分子量为10,000以上的超滤膜的、源于腰果梨的原花色素，而含有没有通过截留分子量为10,000以上的超滤膜的、源于腰果梨的原花色素。

通过在体内或体外给予上述含有原花色素的组合物或上述原花色素来抑制α-淀粉酶的方法。

通过在生物体内或生物体外的α-淀粉酶存在环境中给予上述含有原花色素的组合物或上述原花色素来抑制α-淀粉酶的方法。

上述含有原花色素的组合物或上述原花色素，其用作体内或体外的α-淀粉酶抑制剂。

上述含有原花色素的组合物或上述原花色素在制造体内或体外的α-淀粉酶抑制剂中的用途。

症状通过抑制α-淀粉酶而被预防或改善的状态或者疾病的预防或治疗方法，其含有对于患者（人等）给予上述含有原花色素的组合物或上述原花色素。上述含有原花色素的组合物或上述原花色素以用于预防或治疗该状态或疾病的有效量来给予。患者是需要预防或治疗该状态或疾病的患者。给药途径优选口服给药。

上述含有原花色素的组合物或上述原花色素，其用作症状通过抑制α-淀粉酶而被预防或改善的状态或疾病的预防药或治疗药。

上述含有原花色素的组合物或上述原花色素在制造用于症状通过抑制α-淀粉酶而被预防或改善的状态或疾病的预防或治疗的药物中的用途。

足够抑制α-淀粉酶的量的上述含有原花色素的组合物或上述原花色素在用于抑制α-淀粉酶的饮食品组合物中的非医疗性用途。上述饮食品组合物，典型地，对于摄取其的人来说，是用于降低症状通过抑制α-淀粉酶而被预防或改善的状态或疾病的风险的饮食品组合物，或者是用于引起形成上述状态或疾病的预防或治疗的基础的生理效果的饮食品组合物。

足够抑制α-淀粉酶的量的上述含有原花色素的组合物或上述原花色素在制造用于抑制α-淀粉酶的医疗性饮食品组合物中的用途。上述医疗性饮食品组合物，典型地，对于摄取其的人来说，是用于症状通过抑制α-淀粉酶而被预防或改善的状态或疾病的预防或治疗的饮食品组合物。

通过在体内或体外给予上述含有原花色素的组合物或上述原花色素来抑制脂肪酶的方法。

通过在生物体内或生物体外的脂肪酶存在环境中给予上述含有原花色素的组合物或上述原花色素来抑制脂肪酶的方法。

上述含有原花色素的组合物或上述原花色素，其用作体内或体外的脂肪酶抑制剂。

上述含有原花色素的组合物或上述原花色素在制造体内或体外的脂肪酶抑制剂中的用途。

症状通过抑制脂肪酶而被预防或改善的状态或疾病的预防或治疗方法，其含有对患者（人等）给予上述含有原花色素的组合物或上述原花色素。上述含有原花色素的组合物或上述原花色素以用于该状态或疾病的预防或治疗的有效量来给予。患者是需要该状态或疾病的预防或治疗的患者。给药途径优选口服给药或透皮给药。

上述含有原花色素的组合物或上述原花色素，其用作症状通过抑制脂肪酶而被预防或改善的状态或疾病的预防药或治疗药。

上述含有原花色素的组合物或上述原花色素在制造用于症状通过抑制脂肪酶而被预防或改善的状态或疾病的预防或治疗的药物中的用途。

脂质劣化抑制剂，其含有上述含有原花色素的组合物或上述原花色素。

通过在生物体内或生物体外的脂质存在环境（皮肤或含脂质组合物等）中，给予上述含有原花色素的组合物或上述原花色素来抑制脂质的劣化的方法。

上述含有原花色素的组合物或上述原花色素在抑制脂质劣化中的用途。

足够抑制脂肪酶的量的上述含有原花色素的组合物或上述原花色素在用于抑制脂肪酶的饮食品组合物中的非医疗性用途。上述饮食品组合物，典型地，对于摄取其的人来说，是用于降低症状通过抑制脂肪酶而被预防或改善的状态或疾病的风险的饮食品组合物，或者是用于引起形成上述状态或疾病的预防或治疗的基础的生理效果的饮食品组合物。

足够抑制脂肪酶的量的上述含有原花色素的组合物或上述原花色素在制造用于抑制脂肪酶的医疗性饮食品组合物中的用途。上述医疗性饮食品组合物，典型地，对于摄取其的人来说，是用于症状通过抑制脂肪酶而被预防或改善的状态或者疾病的预防或治疗的饮食品组合物。

足够抑制脂肪酶的量的上述含有原花色素的组合物或上述原花色素在用于抑制脂肪酶的化妆品组合物中的非医疗性用途。上述化妆品组合物，典型地，对于使用其的人来说，是用于降低症状通过抑制脂肪酶而被预防或改善的状态或疾病的风险的化妆品组合物，或者是用于引起形成上述状态或疾病的预防或治疗的基础的生理效果的化妆品组合物。

足够抑制脂肪酶的量的上述含有原花色素的组合物或上述原花色素在制造用于抑制脂肪酶的医疗性化妆品组合物中的用途。上述医疗性化妆品组合物，典型地，对于使用其的人来说，是用于症状通过抑制脂肪酶而被预防或改善的状态或疾病的预防或治疗的化妆品组合物。

上述含有原花色素的组合物或上述原花色素，其用作针对体内或体外的粉刺菌的抗菌剂。

上述含有原花色素的组合物或上述原花色素在制造针对体内或体外的粉刺菌的抗菌剂中的用途。

症状通过抑制粉刺菌的增殖而被预防或改善的状态或疾病的预防或治疗方法，其含有对于患者（人等）给予上述含有原花色素的组合物或上述原花色素。上述含有原花色素的组合物或上述原花色素以用于该状态或疾病的预防或治疗的有效量来给予。患者是需要该状态或疾病的预防或治疗的患者。给药途径优选透皮给药。

上述含有原花色素的组合物或上述原花色素，其用作症状通过抑制粉刺菌的增殖而被预防或改善的状态或疾病的预防药或治疗药。

上述含有原花色素的组合物或上述原花色素在制造用于症状通过抑制粉刺菌的增殖而被预防或改善的状态或疾病的预防或治疗的药物中的用途。

足够抑制粉刺菌的增殖的量的上述含有原花色素的组合物或上述原花色素在用于抑制粉刺菌增殖的化妆品组合物中的非医疗性用途。上述化妆品组合物，典型地，对于使用其的人来说，是用于降低症状通过抑制粉刺菌的增殖而被预防或改善的状态或疾病的风险的化妆品组合物，或者是用于引起形成上述状态或疾病的预防或治疗的基础的生理效果的化妆品组合物。

足够抑制粉刺菌的增殖的量的上述含有原花色素的组合物或上述原花色素在制造用于抑制粉刺菌的增殖的医疗性化妆品组合物中的用途。上述医疗性化妆品组合物，典型地，对于使用其的人来说，是用于症状通过抑制粉刺菌的增殖而被预防或改善的状态或疾病的预防或治疗的化妆品组合物。

上述含有原花色素的组合物或上述原花色素，其用作药物。

发明效果

根据本发明，可以有效利用以往多被废弃的腰果梨。

另外，根据本发明，可以提供源于天然物的、安全性高的、具有α-淀粉酶抑制活性、脂肪酶抑制活性、针对粉刺菌的抗菌活性等有益活性的活性成分。

附图说明

[图1]表示源于腰果梨的原花色素在酸性条件下的加热处理物的HPLC分析结果。

[图2]表示NBP-A（100K以上截留物）的硫醇分解后的HPLC分析结果。

[图3]NBP 硫醇分解纯化品Peak 1 的ESI(+)-MS谱图

[图4-1]NBP 硫醇分解纯化品Peak 1 的¹H NMR谱图

[图4-2]NBP 硫醇分解纯化品Peak 1 的¹H NMR谱图（续图4-1）

[图5-1]NBP 硫醇分解纯化品Peak 1 的¹H NMR谱图（放大图）

[图5-2]NBP 硫醇分解纯化品Peak 1 的¹H NMR谱图（放大图）（续图5-1）

[图6-1]NBP 硫醇分解纯化品Peak 1 的¹³C NMR谱图

[图6-2]NBP 硫醇分解纯化品Peak 1 的¹³C NMR谱图（续图6-1）

[图7-1]NBP 硫醇分解纯化品Peak 1 的¹³C NMR谱图（放大图）

[图7-2]NBP 硫醇分解纯化品Peak 1 的¹³C NMR谱图（放大图）（续图7-1）

[图8]NBP 硫醇分解纯化品Peak 2 的ESI(+)-MS谱图

[图9-1]NBP 硫醇分解纯化品Peak 2 的¹H NMR谱图

[图9-2]NBP 硫醇分解纯化品Peak 2 的¹H NMR谱图（续图9-1）

[图10-1]NBP 硫醇分解纯化品Peak 2 的¹H NMR谱图（放大图）

[图10-2]NBP 硫醇分解纯化品Peak 2 的¹H NMR谱图（放大图）（续图10-1）

[图11-1]NBP 硫醇分解纯化品Peak 2 的¹³C NMR谱图

[图11-2]NBP 硫醇分解纯化品Peak 2 的¹³C NMR谱图（续图11-1）

[图12-1]NBP 硫醇分解纯化品Peak 2 的¹³C NMR谱图（放大图1）

[图12-2]NBP 硫醇分解纯化品Peak 2 的¹³C NMR谱图（放大图1）（续图12-1）

[图13-1]NBP 硫醇分解纯化品Peak 2 的¹³C NMR谱图（放大图2）

[图13-2]NBP 硫醇分解纯化品Peak 2 的¹³C NMR谱图（放大图2）（续图13-1）

[图14]NBP-A的10K级分的硫醇分解溶液的HPLC 色谱图

[图15]NBP-A的10K级分的硫醇分解溶液的HPLC 色谱图和TIC [ESI(+)]

[图16-1]NBP-A的10K级分的硫醇分解溶液，峰(1)的LC-MS 测定结果

[图16-2]NBP-A的10K级分的硫醇分解溶液，峰(1)的精密质量谱图

[图16-3]NBP-A的10K级分的硫醇分解溶液，峰(1)（m/z 459.0922）的组成演算结果

[图16-4]NBP-A的10K级分的硫醇分解溶液，峰(1)（m/z 459.0922）的组成演算结果（续）

[图17-1]NBP-A的10K级分的硫醇分解溶液，峰(2)的LC-MS 测定结果

[图17-2]NBP-A的10K级分的硫醇分解溶液，峰(2)的精密质量谱图

[图17-3]NBP-A的10K级分的硫醇分解溶液，峰(2)（m/z 413.1041）的组成演算结果

[图17-4]NBP-A的10K级分的硫醇分解溶液，峰(2)（m/z 413.1041）的组成演算结果（续）

[图18-1]NBP-A的10K级分的硫醇分解溶液，峰(3)的LC-MS 测定结果

[图18-2]NBP-A的10K级分的硫醇分解溶液，峰(3)的精密质量谱图

[图18-3]NBP-A的10K级分的硫醇分解溶液，峰(3)（m/z 565.1229）的组成演算结果

[图18-4]NBP-A的10K级分的硫醇分解溶液，峰(3)（m/z 565.1229）的组成演算结果（续）

[图19]表示使用三种果胶酶制剂进行处理的果泥提取物的α-淀粉酶抑制活性。

本说明书包含作为本申请优先权基础的国际申请PCT/JP2008/073843的说明书和/或附图中记载的内容。

具体实施方式

1. 腰果梨

本发明中，作为腰果梨，可以使用腰果树的柄肥大而得的黄色西洋梨型部位。除去结在该部位的前端的腰果和其壳来使用。

在本发明中，“腰果梨”并不仅限于腰果梨原本的形状，还包含腰果梨的粉碎物、果泥、果汁、果汁榨汁残渣等对腰果梨进行物理性处理而得的物质。其中，腰果梨的果泥在本发明的用途中是优选的。果泥是指将除去了壳的部分的成熟腰果梨用粉碎机或搅拌机等进行粉碎处理并液状化而得的物质。成熟腰果梨的果肉非常柔软，可以容易地液状化。

高分子量的原花色素可以通过使果胶酶等植物纤维分解酶作用于腰果梨，而从果胶等水不溶性成分中分离。因此，使植物纤维分解酶作用时，作为“腰果梨”，也可以使用果汁榨汁残渣等腰果梨的水不溶性成分。

2. 腰果梨的处理物

本发明人等发现，腰果梨的利用植物纤维分解酶得到的分解物具有高的α-淀粉酶抑制活性、脂肪酶抑制活性、针对粉刺菌的抗菌活性。推定这些活性与具有新型结构的高分子量原花色素有关。因此，以下对于腰果梨的植物纤维分解酶分解物等含有原花色素的组合物、和原花色素详细地进行说明。

2.1. 源于腰果梨的含有原花色素的组合物

在本发明中，“含有原花色素的组合物”或“原花色素含有组合物”是指，使植物纤维分解酶作用于腰果梨（也包含粉碎物、果泥、果汁、水不溶性成分（果汁榨汁残渣）等），进而对所得植物纤维分解酶分解物实施利用超滤膜的浓缩处理而得到的以可发挥作用的状态含有原花色素的浓缩物、以及对该浓缩物实施纯化等进一步处理而制备的、含有源于腰果梨的原花色素的、作为腰果梨处理物的组合物。

源于腰果梨的原花色素含有原花翠素作为主成分。典型地，源于腰果梨的原花色素的构成单元中70～100摩尔％为原花翠素（（表）没食子儿茶素和（表）没食子儿茶素没食子酸酯）。

“植物纤维分解酶”优选果胶酶、纤维素酶、半纤维素酶、β-淀粉酶、或具有2种以上的上述酶活性的酶、或这些酶的混合物，特别优选果胶酶。果胶酶已知具有果汁澄清化作用。本发明中，植物纤维分解酶可以使用市售的酶制剂。在本发明中，果胶酶不仅可以使用市售为果胶酶的酶制剂，而且还可以使用市售为纤维素酶等具有其它活性的酶但可作为果胶酶使用的酶制剂。

对于植物纤维分解酶的处理条件，可以根据使用的酶制剂和酶浓度适当决定，没有特别地限定。酶处理物优选进行酶处理直至成为可用离心分离处理等容易地使固体成分沉降的状态或通过过滤可容易地进行分离的状态。例如，酶处理时的pH条件可以为3～5的范围，温度条件可以为50～60℃，处理时间可以为1～24小时。

植物纤维分解酶优选作用于腰果梨果泥或水不溶性成分。腰果梨果泥也可以进而用水等溶剂稀释。从废弃物的有效利用的观点考虑，优选使用果汁榨汁残渣等水不溶性成分的实施方式。

由植物纤维分解酶作用工序得到的酶分解物可以直接供于以后的进一步处理中，但由于原花色素溶出于液体部分中，因而可以通过离心分离、过滤等通常的分离手段仅分离液体部分，供于以后的进一步处理中。

进一步地，优选对于由植物纤维分解酶作用工序得到的酶分解物，实施利用超滤膜的浓缩处理（以下有时称作“超滤工序”）、多酚的浓缩或分离处理（以下有时称作“多酚分离工序”）、原花色素的浓缩或分离处理（以下有时称作“原花色素分离工序”）等的处理。

通过利用超滤膜的浓缩处理，可以除去腰果梨中所含的果糖、葡萄糖等单糖类和二糖类，能够抑制腰果梨植物纤维分解酶分解物的热量、甜味。另外，在通过利用超滤膜的浓缩处理进行浓缩的高分子成分中，含有高分子量的原花色素，因此利用了该处理的浓缩物具有高的α-淀粉酶抑制活性、脂肪酶抑制活性和针对粉刺菌的抗菌活性。

超滤膜一般是阻止0.1μm～2nm（分子量为数百～数百万）的范围的粒子或高分子的膜。作为本发明中使用的超滤膜，优选为具有可除去单糖类和二糖类的截留分子量的膜，优选额定截留分子量为10,000以上的膜，更优选30,000以上的膜，进而优选50,000以上的膜。例如可以使用额定截留分子量为10,000～200,000的膜、或10,000～100,000的膜。

超滤的条件没有特别地限定。超滤膜的构成材料也没有特别地限定，可以优选使用聚醚砜系材料的膜、或纤维素系材料的膜。

由超滤膜得到的浓缩物可以直接用于本发明的用途，或者进一步使其浓缩或干燥而用于本发明的用途。

作为多酚的浓缩或分离处理，可以列举使用吸附多酚的合成吸附剂，将利用植物纤维分解酶作用工序得到的酶分解物或上述超滤工序后的浓缩物中的多酚进行浓缩或分离的处理。特别地，优选对于上述超滤工序后的浓缩物实施多酚的浓缩或分离处理。作为可使用的合成吸附剂，可举出具有微孔的不溶性三维交联结构聚合物的、比表面积高的树脂，树脂的化学组成为芳香族（苯乙烯-二乙烯基苯）系的物质。具体的市售品可以列举Diaion Sepabeads HP-20（注册商标）（三菱化学株式会社制）等。进一步地，还可以优选使用对上述芳香族系的树脂实施了化学修饰而得的物质，或改变微孔的尺寸而得的物质。进一步地，也可以使用在键合型硅胶中引入了十八烷基（Ｃ18）或辛基（Ｃ8）作为官能团的树脂来进行多酚的浓缩或分离处理。

使用了合成吸附剂的多酚的浓缩或分离处理的步骤没有特别地限定，例如可以如下述那样进行，即，使由植物纤维分解酶作用工序得到的酶分解物、或上述超滤工序后的浓缩物通过填充了合成吸附剂的柱子中，利用水等清洗液进行清洗，接着利用丙酮、醇水溶液等溶出液使多酚溶出。溶出物可以适当地进行浓缩或干燥。在这样得到的多酚成分中含有下述的原花色素作为粗纯化物。

原花色素的浓缩或分离处理，可以列举使用吸附原花色素的合成吸附剂，将由植物纤维分解酶作用工序得到的酶分解物、上述超滤工序后的浓缩物、或者在上述多酚分离工序中得到的多酚浓缩物或分离物中的原花色素进行浓缩或分离的处理。特别地，优选对于多酚浓缩物或分离物实施原花色素的浓缩或分离处理。可使用的合成吸附剂可以列举以羟丙基化的右旋糖酐作为基础的树脂，特别地，优选干燥时的粒径为18～111μm、甲醇所致的膨胀时的粒径为27～163μm、且对于水、盐溶液、有机溶剂和变性剂具有稳定性质的吸附剂。具体的市售品可以列举Sephadex LH-20树脂（GE Helthcare制）。

使用了合成吸附剂的原花色素的浓缩或分离处理的步骤没有特别地限定，例如可以如下述那样进行，即，使由植物纤维分解酶作用工序得到的酶分解物、上述超滤工序后的浓缩物或者上述多酚分离工序中得到的多酚浓缩物或分离物通过填充了合成吸附剂的柱子中，利用水等清洗液进行清洗，接着利用丙酮、醇等溶出液使原花色素溶出。溶出物可以适当地进行浓缩或干燥。在这样得到的原花色素成分中，下述的原花色素以实质上经纯化的状态存在。本发明的“含有原花色素的组合物”的范围还包含以这种实质上经纯化的状态存在的原花色素。

经过上述步骤得到的多酚浓缩物或分离物、或者原花色素的浓缩物或分离物进而还可以利用超滤膜根据分子量来截留。此时使用的超滤膜的种类和超滤的条件可以与上述同样。

利用上述步骤得到的源于腰果梨的含有原花色素的组合物是目前不存在的组合物，且具有α-淀粉酶抑制活性、脂肪酶抑制活性和针对粉刺菌的抗菌活性是高的有利特征。

本发明的含有原花色素的组合物是通过下述方法制备的组合物，所述方法含有使植物纤维分解酶作用于腰果梨的植物纤维分解酶作用工序、和利用上述超滤膜将在植物纤维分解酶作用工序中得到的酶分解物进行浓缩的超滤工序。植物纤维分解酶作用工序中使用的腰果梨优选至少含有果胶等水不溶性成分。

本发明的含有原花色素的组合物更优选是通过下述方法制备的组合物，所述方法含有上述植物纤维分解酶作用工序、上述超滤工序、和从由超滤工序得到的浓缩物中浓缩或分离多酚的多酚分离工序。

本发明的含有原花色素的组合物更优选是通过下述方法制备的组合物，所述方法含有上述植物纤维分解酶作用工序、上述超滤工序、和从由超滤工序得到的浓缩物中浓缩或分离原花色素的原花色素分离工序。

本发明的含有原花色素的组合物更优选是通过下述方法制备的组合物，所述方法含有上述植物纤维分解酶作用工序、上述超滤工序、从由超滤工序得到的浓缩物中浓缩或分离多酚的多酚分离工序、和从由多酚分离工序得到的含有多酚的组合物中浓缩或分离原花色素的原花色素分离工序。

在利用植物纤维分解酶作用工序得到的植物纤维分解酶分解中，以可发挥活性的状态含有腰果梨中的原花色素。

对于经过超滤工序得到的组合物，原花色素中的没有通过超滤膜的高分子量的成分的含有浓度得到提高。

经过多酚分离工序得到的组合物同时含有原花色素和其它的多酚组分。该组合物相当于原花色素的粗纯化物。

经过原花色素分离工序得到的组合物以更高的浓度含有原花色素。该组合物相当于原花色素的纯化物。

2.2. 原花色素

从腰果梨植物纤维分解酶分解物中分离出的原花色素是新的化合物，所述腰果梨植物纤维分解酶分解物通过含有使植物纤维分解酶作用于腰果梨的工序的方法而制备。该原花色素如实施例所示，具有高α-淀粉酶抑制活性、脂肪酶抑制活性和针对粉刺菌的抗菌活性的有利特征。即，本发明还提供新型原花色素。

本发明的原花色素是至少含有没食子儿茶素或表没食子儿茶素（本说明书中记载为“（表）没食子儿茶素”）、和没食子儿茶素没食子酸酯或表没食子儿茶素没食子酸酯（本说明书中记载为“（表）没食子儿茶素没食子酸酯”）作为构成单元的、平均聚合度为20以上的聚合物。平均聚合度优选为25以上，更优选在25～100的范围，特别优选25～75的范围。本发明的原花色素优选进而含有表儿茶素和表儿茶素没食子酸酯作为构成单元。

本发明的原花色素优选含有（表）没食子儿茶素50～80摩尔％、（表）没食子儿茶素没食子酸酯20～50摩尔％作为构成单元，更优选含有（表）没食子儿茶素50～75摩尔％、（表）没食子儿茶素没食子酸酯20～45摩尔％、表儿茶素3～10摩尔％、表儿茶素没食子酸酯0.5～5摩尔％。本发明的原花色素含有（表）没食子儿茶素和（表）没食子儿茶素没食子酸酯作为主成分，因此在本说明书中有时也称作“原花翠素”。

本发明的原花色素的构成单元（重复单元）用下式表示，

[化1]

［式中，

（表）没食子儿茶素中，R₁为羟基，R₂为氢原子，色满环上的2位的取代基与3位的-OR₂基为顺式构型或反式构型；

（表）没食子儿茶素没食子酸酯中，R₁为羟基，R₂为用

[化2]

表示的基团（没食子酸基），色满环上的2位的取代基与3位的-OR₂基为顺式构型或反式构型；

表儿茶素中，R₁为氢原子，R₂为氢原子，色满环上的2位的取代基与3位的-OR₂基为顺式构型；

表儿茶素没食子酸酯中，R₁为氢原子，R₂为上述没食子酸基，色满环上的2位的取代基与3位的-OR₂基为顺式构型］。

本发明的原花色素是在作为构成单元的类黄酮骨架的色满环的4位碳、和邻接的构成单元中的其它部位（推定为色满环的8位碳或6位碳）之间形成共价键而聚合的。在腰果梨中，原花色素的4位碳侧末端的重复单元（下端单位）为表没食子儿茶素没食子酸酯。即，本发明的原花色素的结构推定为如以下所示：

[化3]

（式中，8位碳上的虚线和6位碳上的虚线的一者是与邻接的重复单元的4位碳相连接的键，另一者是氢，R₁和R₂、以及-OR₂基的立体构型如上述那样定义，下端单位中R₁为羟基，R₂为没食子酸基，色满环上的2位的取代基与3位的-OR₂基呈顺式构型，重复单元的数ｎ（聚合度）优选为20以上，优选25以上，更优选为25～100的范围，特别优选25～75的范围）。

本发明中，构成单元的比例和平均聚合度是指利用下述的硫醇分解法（参考非专利文献3和实施例5）进行测定，并基于分解产物中含有的构成单元的种类和各构成单元的摩尔浓度而算出的值，所述硫醇分解法通过使原花色素在酸性条件下与苄硫醇反应，进行硫醇分解，利用高效液相色谱法(HPLC)或质量分析法等仪器分析进行分析。判断在分解产物中，没有形成苄硫醚衍生物的构成单元是构成下端单位的构成单元。

本发明的原花色素可以利用含有上述植物纤维分解酶作用工序、上述超滤工序、上述多酚分离工序和上述原花色素分离工序的方法、由腰果梨来制备。

3. 用途

以下，对于源于腰果梨的原花色素所具有的有利活性和利用了该活性的用途进行说明。

3.1. α-淀粉酶抑制作用

源于腰果梨的原花色素具有α-淀粉酶抑制作用。通过抑制α-淀粉酶，可以缓和饭后急剧的血糖升高。因此，源于腰果梨的原花色素可以用作症状通过抑制α-淀粉酶而被预防或改善的状态或疾病（血糖值升高抑制剂、糖尿病、肥胖等）的预防剂或治疗剂的有效成分。

本发明的α-淀粉酶抑制剂、以及症状通过抑制α-淀粉酶而被预防或改善的状态或疾病的预防剂或治疗剂，可以是药物、食品等任意的形式。即，本发明提供具有下述作用的饮食品组合物或药物组合物，所述作用为α-淀粉酶抑制作用、或者症状通过抑制α-淀粉酶而被预防或改善的状态或疾病的预防或治疗作用、降低上述状态或疾病的风险的作用，或者引起形成上述状态或疾病的预防或治疗基础的生理效果的作用。上述淀粉酶抑制剂、预防剂或治疗剂优选提供为饮食品组合物、或口服给药形式的药物组合物。

例如，使植物纤维分解酶作用于腰果梨的果泥或水不溶性成分、接着进行利用超滤膜的浓缩处理而得的处理物，其自身可作为具有α-淀粉酶抑制作用或与其相关作用的饮食品组合物或药物组合物来利用。

配合了源于腰果梨的原花色素以使每餐可摄取2.2 mg以上、优选7.5 mg以上、更优选25mg以上、特别优选50mg以上的饮食品组合物作为具有α-淀粉酶抑制作用或与其相关作用的饮食品组合物是有用的。源于腰果梨的原花色素的量的上限没有特别地限定，通常每餐为10g以下。另外，一餐分量的饮食品组合物是指例如100g的饮食品组合物。

3.2. 脂肪酶抑制作用

源于腰果梨的原花色素具有脂肪酶抑制作用。源于腰果梨的原花色素不仅对于源于胰脏的脂肪酶、而且对于细菌产生的脂肪酶也具有与已知的有效成分等相比更为有效的抑制活性。通过抑制脂肪酶活性，可以抑制脂质摄取后的脂质的体内吸收，而预防或治疗肥胖、高脂血症。另外，通过抑制脂肪酶活性，可以抑制食品等含有脂质的饮食品或化妆品中混入微生物时由微生物产生的脂肪酶所致的脂质的分解，可以抑制腐败发臭等的脂质的劣化。更一步地，可以抑制存在于皮肤表面的细菌所产生的脂肪酶的作用，因此可以预防或治疗由脂肪酶的酶活性引起的粉刺等的皮肤疾病。因此，源于腰果梨的原花色素作为肥胖、高脂血症、粉刺等的、症状通过抑制脂肪酶活性而被预防或改善的状态或者疾病的预防剂或治疗剂，或者脂质劣化抑制剂的有效成分是有用的。

本发明的脂肪酶抑制剂、脂质劣化抑制剂、以及症状通过抑制脂肪酶而被预防或改善的状态或疾病的预防剂或治疗剂，可以是药物、化妆品、食品等任意形式。即，本发明提供具有下述作用的饮食品组合物、化妆品组合物或药物组合物，所述作用是脂肪酶抑制作用、脂质劣化抑制作用、或者症状通过抑制脂肪酶而被预防或改善的状态或疾病的预防或治疗作用、降低上述状态或疾病的风险的作用，或者引起形成上述状态或疾病的预防或治疗基础的生理效果的作用。上述的脂肪酶抑制剂、脂质劣化抑制剂、预防剂或治疗剂优选作为饮食品组合物、适于皮肤的形式的药物组合物或化妆品组合物、或者口服给药形式的药物组合物来提供。

配合了优选0.001重量％～10重量％、更优选0.01重量％～5重量％、进而优选0.025重量％～5重量％、特别优选0.05重量％～5重量％的源于腰果梨的原花色素的饮食品组合物、化妆品组合物或药物组合物，作为具有脂肪酶抑制作用或者与其相关作用的饮食品组合物、化妆品组合物或药物组合物是特别有用的。

3.3. 抗菌作用

源于腰果梨的原花色素对于大肠杆菌（Escherichia coli）、绿脓杆菌（Pseudomonas aeruginosa）、黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）和粉刺菌（Propionibacterium acnes）显示抗菌性，特别对于粉刺菌具有高的增殖抑制活性。因此，源于腰果梨的原花色素可有效地用于症状通过抑制粉刺菌的增殖而被预防或改善的症状或疾病、例如粉刺的治疗或预防的用途。

本发明的针对粉刺菌的抗菌剂、以及症状通过抑制粉刺菌的增殖而被预防或改善的状态或疾病的预防剂或治疗剂，可以是药物、化妆品等任意形式。即，本发明提供具有下述作用的化妆品组合物或药物组合物，所述作用是针对粉刺菌的抗菌作用、或者症状通过抑制粉刺菌的增殖而被预防或改善的状态或疾病的预防或治疗作用、降低上述状态或疾病的风险的作用，或者引起形成上述状态或疾病的预防或治疗基础的生理效果的作用。上述抗菌剂、预防剂或治疗剂优选作为适用于皮肤的形式的化妆品组合物或药物组合物来提供。

上述化妆品组合物或药物组合物中的源于腰果梨的原花色素的量根据剂型或期待效果的程度而有所不同，但通常优选配合0.0001重量％以上、优选0.001～10重量％左右、更优选0.025重量％～10重量％、特别优选0.05重量％～10重量％。

3.4. 组合物的形式

本发明的源于腰果梨的原花色素、或者含有其的腰果梨处理物可以在饮食品组合物、化妆品组合物、药物组合物中配合使用。

饮食品组合物的形式可以列举饮料、固体食品、半固体食品等，也可以为特定保健用食品。饮料具体可以列举果汁饮料、清凉饮料、酒精饮料等。另外，也可以是在摄取时使用水等进行稀释来摄取的形式。固体食品可以列举例如包括糖、锭剂等的片剂（タブレット）或糖衣片的形式、颗粒的形式、粉末饮料、粉末汤（粉末スープ）等的粉末形式、饼干等的块状点心类的形式、胶囊、胶体等形式等各种形式。半固体食品可以列举例如果酱这样的糊状物的形式、口香糖这样的胶状物的形式。这些饮食品组合物中除了本发明的源于腰果梨的原花色素或含有其的腰果梨处理物以外，在不损害本发明期望效果的范围内，还可以配合通常作为食品原料使用的各种成分。其它成分可以列举例如水、醇类、甜味料、酸味料、着色料、保存剂、香料、赋形剂等。这些成分可以单独使用，或者组合使用。本发明的饮食品组合物中的源于腰果梨的原花色素的量优选是通过食用可起到α-淀粉酶抑制活性或脂肪酶抑制活性的有效量。

化妆品组合物能够以通常的形式，例如化妆用霜、乳液、化妆水、美容香精、面膜剂、粉、护肤化妆品、唇膏、口红、妆底、粉底、防晒品、浴用剂、洗澡液、爽身水、清洗剂、软膏、凝胶剂、气溶胶剂等形式来使用。化妆品组合物中除了本发明的源于腰果梨的原花色素或含有其的腰果梨处理物以外，还可以在不损害本发明期望效果的范围内适当添加水、油剂、表面活性剂、润滑剂、醇类、水溶性高分子剂、凝胶化剂、保湿剂、缓冲剂、防腐剂、抗炎症剂、增稠剂、香料、维生素类、抗氧化剂、紫外线吸收剂、颜料、色素等。本发明化妆品组合物中的源于腰果梨的原花色素的量优选为通过作为化妆品的用途，可起到脂肪酶抑制活性、或针对粉刺菌的抗菌活性的有效量。

药物组合物可以使用制剂化为各种给药形式的组合物。制剂形式没有特别地限定，可根据需要适当选择，一般可制为片剂、胶囊剂、颗粒剂、细粒剂、散剂、丸剂、液剂、糖浆剂、悬浮剂、乳剂、酏剂等口服剂，或者注射剂、点滴剂、栓剂、吸入剂、经粘膜吸收剂、经鼻剂、经肠剂、皮肤外用剂（例如透皮吸收剂、贴剂、软膏剂）等非口服剂，根据症状单独、或者组合使用。α-淀粉酶抑制剂优选口服剂的形式，脂肪酶抑制剂优选口服剂或皮肤外用剂的形式。针对粉刺菌的抗菌剂优选皮肤外用剂的形式。

上述制剂可以使用赋形剂、结合剂、崩解剂、表面活性剂、滑润剂、流动性促进剂、矫味剂、着色剂、香料等，根据常法来制备。

特别地，当作为皮肤外用剂进行制剂化时，可以根据需要适当地配合表面活性剂、油脂类、蜡类、烃类、醇类、硅油、水溶性高分子、溶剂、色素、颜料、香料、抗氧化剂、保湿剂、维生素、维生素衍生物、动植物提取物、无机盐类、pH调节剂、杀菌剂、紫外线吸收剂等成分。

制剂的给药量是与患者的年龄、体重、疾病的程度、给药途径相对应的、能够起到α-淀粉酶抑制活性、脂肪酶抑制活性或针对粉刺菌的抗菌活性的有效量。

实施例

基于实施例更为详细地说明本发明。

实施例1: 植物纤维分解酶处理的有效性

(1) 待测物的制备

对于腰果梨的果泥的果汁和将其进行果胶酶处理而得到的果汁的α-淀粉酶抑制活性进行了比较研究。未处理果汁的制备如下述那样进行，即，将解冻的果泥以18000rpm、20分钟、20℃的条件进行离心分离处理，使用0.22μm的过滤器（Millex GP、Millipore公司制）对其上清进行过滤，将滤液作为未处理果汁。

对于果胶酶处理果汁，添加果泥重量的0.5％的果胶酶A“Amano”（Amano Enzyme Inc.制），在50℃振荡混合90分钟，将该酶处理液以18000rpm、15分钟、20℃的条件进行离心分离处理，使用0.22μm的过滤器（Millex GP、Millipore公司制）对其上清进行过滤，将滤液作为果胶酶处理果汁。腰果梨的果泥由于仅用离心分离不能充分地沉淀，因而通过进行果胶酶处理，过滤变得容易。

作为比较对照，还测定了市售的茶饮料（蕃爽丽茶（注册商标）（Yakult制））的α-淀粉酶抑制活性。该茶饮料中配合了含有分子量分布在5,000 ～30,000的复合丹宁样物质的番石榴叶多酚。作为食物进入体内的糖质被消化酶消化?分解，变为葡萄糖而由肠被吸收。番石榴叶多酚抑制了将蔗糖、淀粉等糖质分解为葡萄糖等的糖质分解酶的作用，其结果是具有使糖向血液中的吸收变慢、饭后血糖值的上升变缓的效果。该茶饮料被认为具有该效力效果，于2000年3月28日从日本国厚生劳动省得到了作为特定保健用食品的认可。

(2) α-淀粉酶抑制活性的测定

对于上述三种待测物，各自添加用纯水稀释的试样溶液50μl和源于猪胰脏的α-淀粉酶（SIGMA社制）/0.25M磷酸缓冲液（pH7.0）50μl并进行混合后，在37℃进行10分钟的预孵育。对于试样溶液组，向其中添加0.5％淀粉/磷酸缓冲液100μl，开始反应。在37℃进行30分钟的孵育后，向各试验管中加入0.1M盐酸 1ml，终止酶反应。将这些反应液充分混合后，向96孔板中加入各反应液100μl，并在其中加入0.01M 碘溶液100μl，使未分解的淀粉发色，利用酶标仪（プレートリーダー）测定660nm的吸光度。酶抑制率利用与作为空白的对照溶液的比较而由下式来算出。作为各试样的空白，0.5％淀粉/磷酸缓冲液100μl的添加时机不是在预孵育后，而是在利用盐酸将酶反应终止后添加该0.5％淀粉/磷酸缓冲液100μl进行试验。即，在各试样的空白试验中，将酶溶液和各试样同样地进行混合，在37 ℃进行10分钟的预孵育后，进一步进行30分钟的孵育，然后在各试验管中加入0.1M盐酸 1ml进行混合后，添加0.5％淀粉/磷酸缓冲液100μl。另外，除了使用不抑制酶活性的纯水来代替各试样以外，其它利用与试样溶液的试验同样的步骤来测定吸光度（纯水空白）。

＜计算式＞

α-淀粉酶抑制活性（％）＝（1-（A-B）/（C-D））×100

A：试样溶液的空白的吸光度

B：试样溶液的吸光度

C：纯水的空白的吸光度

D：纯水的吸光度

另外，各试样溶液的酶抑制活性是在多个浓度下进行测定，算出将α-淀粉酶抑制50％的浓度（IC₅₀）。

(3) 试验结果

分别以腰果梨未处理果汁、腰果梨果胶酶处理果汁、茶饮料各自稀释前的浓度作为100％浓度进行比较的结果示于以下。

[表1]

茶饮料（蕃爽丽茶（注册商标））在2.5％浓度（40倍稀释液）下抑制了50％的α-淀粉酶活性。另一方面，腰果梨果胶酶处理果汁的IC₅₀为0.3％浓度（约333倍稀释液），未处理果汁为5.4％（约18.5倍稀释液），抑制活性非常弱。本试验中使用的茶饮料被认为对于人的血糖值上升具有抑制作用的效力，而受到作为特定保健用食品的认可。腰果梨果胶酶处理果汁与该茶饮料相比，α-淀粉酶抑制活性在IC₅₀值方面强8倍以上，因此也可以期待对于人的同样的效果。

另外，本发明产品的源于腰果梨的原花色素可以用分子量1万的超滤膜进行浓缩，因此还可以利用下述浓缩液，其将该腰果梨果胶酶处理果汁用分子量1万的超滤进行浓缩、除去了作为低分子成分的果糖或葡萄糖。

实施例2：有效成分（源于腰果梨的高分子原花色素）的纯化

在腰果梨的果泥4773g中添加0.5％份（23.9g）的果胶酶A“Amano”，在50℃搅拌2.5小时。将该果胶酶处理液以4200rpm、60分钟、20℃的条件进行离心分离处理，利用0.2μm的过滤器（SUPORLIFE（注册商标） DCF, PALL社制）对其上清进行过滤，回收果胶酶处理果汁4230g。为了从该果胶酶处理果汁中主要除去葡萄糖和果糖，使用截留分子量为1万的超滤膜（Hydrosart（注册商标）10KDa、Sartorius公司制）进行超滤浓缩，回收浓缩液729g（固体成分26.4g）。另外，在分子量为1万以下的级分中没有检出α-淀粉酶抑制活性。为了从该浓缩液中纯化多酚成分，利用Diaion Sepabeads HP-20（注册商标）（三菱化学株式会社制：约500ml）进行处理。方法根据常法，使浓缩液通过填充在柱子中的树脂，吸附成分后用纯水充分洗涤树脂，并用50％（W/W）的乙醇水溶液使其溶出，来回收成分。该溶出液通过减压蒸馏浓缩器进行干固。回收了3.7g固体成分。

对于用该HP-20树脂纯化的成分（HP-20树脂纯化品），实施采用了Sephadex LH-20树脂（GE Healthcare制）的再纯化，所述Sephadex LH-20树脂（GE Healthcare制）常用于进行原花色素的分离。将用50％（W/W）甲醇水溶液膨胀的树脂500ml填充到柱子中，并将用50％（W/W）甲醇水溶液溶解的HP-20树脂纯化品通过柱子，用充分量的50％（W/W）甲醇水溶液清洗未吸附成分。作为有效成分，将用100％甲醇溶出的级分进行减压蒸馏干固，而回收了226.2mg NBP-M（暂称）。进一步地，对于甲醇溶出后的树脂，用70％（V/V）丙酮水溶液进行溶出，回收成分，使其进行减压蒸馏干固。回收了823.7mg NBP-A（暂称）。由纯化方法，可推定NBP-M和NBP-A为高分子量的原花色素。

实施例3: 有效成分的分子量和α-淀粉酶抑制活性

(1) 有效成分的分子量截留

为了对用LH-20树脂纯化的腰果梨高分子原花色素（暂称作：NBP-M和NBP-A）的分子大小的分布进行研究，使用作为离心型超滤器的Amicon Ultra-15(注册商标)(Millipore制)进行了分子量截留处理。作为试验，使NBP-M和NBP-A 分别用纯水溶解，将其负载在截留分子量为10万的超滤膜（Ultracel-100K (注册商标)）上，将通过其的溶液加在截留分子量为5万的超滤膜（Ultracel-50K (注册商标)）上，将其通过液加在截留分子量为3万的超滤膜（Ultracel-30K (注册商标)）上，将其通过液加在截留分子量为1万的超滤膜（Ultracel-10K (注册商标)）上，制备截留物，将各个级分进行冻干处理，研究各分子量截留的重量分布率。由其结果可知，源于腰果梨的高分子原花色素的多数存在于截留分子量为5万以上的截留中。

[表2]

源于腰果梨的高分子原花色素的超滤截留

(2) 各级分的α-淀粉酶抑制活性

测定各分子量截留的分布率和α-淀粉酶抑制活性的IC₅₀（利用与实施例1(2)相同的步骤来测定）。结果记载于下表中。

[表3]

源于腰果梨的高分子原花色素的各级分的α-淀粉酶抑制活性

(3) 结果汇总

对于丙酮溶出级分（NBP-A），分子量为5万以上的级分中存在88.6％的NBP-A，可以确认有分子量越大，α-淀粉酶抑制活性越强的倾向。但是，对于分子量为30K～10K的截留物，也显示了3.0μg/ml这样的强活性。

对于甲醇溶出级分（NBP-M），有截留分子量越大，α-淀粉酶抑制活性越强的倾向，但没有大的差异。

实施例4: 有效成分的分子结构的解析1

(1) 背景

原花色素意指存在于各种植物体中的缩合型丹宁、即以黄烷-3-醇或黄烷-3，4-二醇作为构成单元、通过缩合或聚合而键合的化合物组。因此，原花色素是通过在酸性条件下加热而生成矢车菊素的原矢车菊素（下式R1～R3中，2个为氢氧基（OH）、1个为氢（H））、生成花翠素的原花翠素（下式R1～R3中，3个为氢氧基（OH））、生成天竺葵色素的原天竺葵色素（下式R1～R3中，1个为氢氧基（OH）、2个为氢（H））等的分子结构不同的多种多酚的总称。因此，通过在盐酸/丁醇溶液中加热，并分析该矢车菊素的种类，可以推定R1～R3的氢氧基的数目和原花色素的种类。

[化4]

黄烷-3-醇的聚合物中含有的利用C4→C8键聚合的重复单元的结构

(2) 目的

对由腰果梨果泥得到的NBP-A的原花色素的种类进行分析。为了比较，对于属于由表儿茶素和表儿茶素没食子酸酯构成的源于葡萄种子的原矢车菊素即Gravinol（注册商标）（Kikkoman制），也利用同样的步骤进行分析。

(3) 方法

(i) 制备各待测物的0.1％（W/V）50％乙醇水溶液，用0.45μm过滤器进行过滤

(ii) 与5％（V/V）盐酸/丁醇溶液等量混合，在95℃加热1小时。

(iii) 利用HPLC（ODS-3柱）进行分析。在检测波长为532nm条件下进行分析。

(iv) 制备试药的矢车菊素和花翠素（生化学工业制）的浓度为0.1％以下的待测物，利用同样的条件进行HPLC分析，制成标准曲线。

(v) 利用标准曲线算出各待测物的花色素类量。

(4) 实验结果

试药的花翠素和矢车菊素的分析结果示于图1a。图1a中，30.826min的峰为花翠素，33.088分钟的峰为矢车菊素。

NBP-A的分析结果示于图1b。30.871min的峰为花翠素，33.145min的峰为矢车菊素，因此判定NBP-A以原花翠素为主成分，并少量含有原矢车菊素。

Gravinol（注册商标）（葡萄种子）的分析结果示于图1c。33.140min的峰为矢车菊素。该结果与Gravinol（注册商标）为原矢车菊素是一致的。

(5) 由各种待测物生成花翠素和矢车菊素

对于实施例3中制备的NBP-M和NBP-A的分子量截留物，分别利用与上述(3)同样的步骤进行在酸性条件下的加热处理，测定花翠素浓度和矢车菊素浓度。

下表中记载了各待测物在酸性条件下生成的花翠素浓度、矢车菊素浓度和生成比例。

[表4]

各种待测物的试验结果

*原矢车菊素C1为表儿茶素的3聚体，是原矢车菊素的一种。

实施例5: 有效成分的分子结构的解析2

6个以上的黄烷-3-醇类键合而成的高聚合度的原花色素具有复杂的结构，因此不能利用高精度的MS分析或NMR分析来解析结构。因此，作为分析原花色素结构的方法，可以使用在酸性条件下使其与苄基硫醇反应，进行硫醇分解，并对该分解产物进行解析的方法，

[化5]

以下表示分解反应的示意图,

[化6] 

上述示意图中对于使儿茶素的缩合物进行硫醇分解的情况进行说明，即使对于使（表）没食子儿茶素或（表）没食子儿茶素没食子酸酯的缩合物进行硫醇分解的情况，也形成同样的分解物。

本分解反应中，缩合型丹宁的下端单元（下部单元）以原有的状态（儿茶素,表儿茶素：一部分表异构化）游离，除了下端单元以外，其它分别作为苄基硫醚而衍生化。通过对所得苄基硫醚衍生物的结构进行分析，可以解析缩合型丹宁的构成单元。

非专利文献3公开了使蓝莓（ブルーベリー）等的原花色素进行硫醇分解，并利用HPLC进行分析的例子。该文献报道了从可可豆、黍的1种（棕色高梁麸）、野生种的蓝莓的1种（矮丛蓝莓）和蔓越莓的原花色素的硫醇分解物中，作为苄基硫醚衍生物仅检出了表儿茶素苄基硫醚。另外，该文献中记载了计算儿茶素和表儿茶素的聚合物的平均聚合度（mean DP (degree of polymerization)）的方法。进行280nm下的HPLC分析，由各个峰的面积计算平均聚合度。

mDP={儿茶素苄基硫醚和表儿茶素苄基硫醚的总面积}/{儿茶素和表儿茶素的总面积}+1

(1)源于腰果梨的高分子原花色素的硫醇分解物的HPLC分析

对于实施例3中得到的NBP-M和NBP-A截留物进行硫醇分解，对于构成成分的差异进行研究。硫醇分解如下述那样进行：将以0.2％（W/V）的浓度溶解在甲醇中的待测物250μl和3.3％（V/V）盐酸/甲醇溶液250μl混合，向其中加入5％苄基硫醇/甲醇溶液500μl，将管密闭，在40℃加热30分钟后，在室温反应10小时。分析中，HPLC的柱子使用ODS-3（4.6×250mm、GL Sciences制）。以1ml/min的流速利用添加了0.05％TFA的纯水/甲醇的线性梯度进行分析。将NBP-A（100K以上截留物）的硫醇分解后的HPLC分析结果（检测波长为280nm）、硫醇分解后的HPLC分析结果示于图2。由实施例3中制备的NBP-A（100K以上截留物）以外的其它NBP-M和NBP-A截留物，也可以得到与图2大致同样的色谱图。

由本研究的结果可以判定，源于腰果梨的高分子原花色素的硫醇分解物主要由5成分（图2的色谱图中的36分钟的峰、38分钟的峰、24分钟的峰、40分钟的峰、41分钟的峰）构成，以及与36分钟的峰和38分钟的峰对应的成分为主成分。

与试药、原矢车菊素C1（表儿茶素的3聚体）的硫醇分解物、以及由表儿茶素和表儿茶素没食子酸酯构成的源于葡萄种子的原矢车菊素即Gravinol（注册商标）（Kikkoman制）的硫醇分解物的HPLC分析结果进行比较，由此可以判定36分钟的峰和38分钟的峰对应于原矢车菊素C1（表儿茶素的3聚体）、Gravinol（注册商标）的硫醇分解物中不含有的成分。进一步地，推定24分钟的峰对应于表没食子儿茶素没食子酸酯，40分钟的峰对应于表儿茶素的苄基硫醚衍生物，41分钟的峰对应于表儿茶素没食子酸酯的苄基硫醚衍生物。

(2) 源于腰果梨的高分子原花色素的主构成成分的结构分析

为了明确源于腰果梨的高分子原花色素的主要构成成分，利用上述(1)中进行的硫醇分解法，将实施例3中纯化?分离的NBP-A的超滤截留100K以上的待测物分解，并进行36分钟的峰的成分（峰1成分）和38分钟的峰的成分（峰2成分）的纯化，利用ESI-MS和NMR实施结构解析。

(2-1) 分析试样

将作为源于腰果梨的高分子原花色素的NBP-A (100K以上)（在分析结果的说明和图中表述为“NBP”） 179mg进行与上述(1)同样的硫醇分解，用纯水稀释至5倍，并负载在C18 Cartriges(Sep-Pak Vac 35cc、Waters制)上，用足够的纯水清洗未吸附成分。将结合在该C18树脂上的成分用50％甲醇溶出。将其通过减压蒸馏器进行浓缩，利用制备用HPLC柱（ODS-3：20×250mm，GL Sciences制）进行制备。纯化物最终回收到29.5mg的峰1成分、27.2mg的峰2成分。

将得到的峰1成分和峰2成分作为待测物进行以下的分析。

(2-2) 分析项目

(i) ESI-MS

(ii) 1H NMR，¹³C NMR

(2-3) 分析方法

(i) ESI-MS

用以下的ESI-MS 条件进行测定。

[表5]

（ESI-MS 条件）

?装置 ： LCQ DECA XP plus 型质量分析仪、Thermo Fisher Scientific

?试样导入法 ： 直接导入

?离子化方法 ： ESI(+)

?测定模式 ： MS

?测定质量范围： m/z 100～1000

(ii) ¹H NMR，¹³C NMR

利用以下的NMR 条件进行测定。

[表6]

（NMR 条件）

?装置名 ： FT-NMR 装置 JNM-ECA400 日本电子（株）

?共振频率数 ： ¹H；400 MHz, ¹³C；100 MHz

?测定模式 ： ¹H NMR, ¹³C NMR

?溶剂 ： 氘代丙酮

?标准物质 ： 四甲基硅烷(TMS)；0 ppm（内标法）

?试样制备方法 ： 在全部试样中加入溶剂0.6 mL并溶解。

(2-4) 分析结果

(i) NBP 硫醇分解纯化品峰 1 的ESI(+)-MS谱图示于图3，¹H NMR谱图示于图4-1～5-2，¹³C NMR谱图示于图6-1～7-2 ，数据示于表7～9，推定结构示于式1。

[表7]

[表8]

[表9]

[化7]

推定结构式1：NBP硫醇分解纯化品峰1的推定结构式

(ii) NBP 硫醇分解纯化品峰 2 的ESI(+)-MS谱图示于图8，¹H NMR谱图示于图9-1～10-2，¹³C NMR谱图示于图11-1～13-2 ，数据示于表10～12，推定构造示于式2。

[表10]

[表11]

[表12]

[化8]

推定结构式2：NBP硫醇分解纯化品峰2的推定结构式

(2-5) 结果解析

(i) 对于NBP 硫醇分解纯化品峰 1 ，在ESI(+)-MS中于m/z 429 [(M+H)+] 和m/z 451 [(M+Na)+]处观测到准分子离子峰。根据ESI(+)-MS、¹H NMR、¹³C NMR 的数据，可以推测分子组成为C₂₂H₂₀O₇S （表7）。另外，由¹H NMR谱图的解析可知，存在9 个芳香属质子［δ5.914 (1H), 6.033 (1H), 6.574 (2H), 7.234 (1H), 7.323 (2H), 7.465 (2H)］、5个非芳香属质子［δ3.994～4.039 (3H), 4.081 (1H), 5.221 (1H)］（表 8）。还可知9个芳香属质子中，5 个为苄基质子［δ7.234 (1H), 7.323 (2H), 7.465 (2H)］。进一步地，由¹³C NMR谱图的解析可知，存在14 种（推定碳原子数为18个）芳香属碳（δ_C 95.71, 96.73, 99.90, 106.90, 127.72, 129.28, 129.82, 131.24, 132.98, 139.86, 146.20, 157.10, 158.41, 158.89）、4 种非芳香属碳（δ_C 37.14, 43.19, 71.20, 75.42）（表9）。作为对以上数据详细解析的结果，推定NBP 硫醇分解纯化品峰 1 的平面构造为推定构造式1所示。即，峰 1成分推定是（表）没食子儿茶素的苄基硫醚衍生物。以下，有时称作为“（表）没食子儿茶素苄基硫醚衍生物”或“（表）没食子儿茶素衍生物”。

(ii) 对于NBP硫醇分解纯化品峰 2，在ESI(+)-MS中于m/z 581 [(M+H)+] 和m/z 603 [(M+Na)+]处观测到准分子离子峰。根据ESI(+)-MS、¹H NMR、¹³C NMR的数据，可以推测分子组成为C₂₉H₂₅O₁₁S（表10）。将其与NBP硫醇分解纯化品峰 1进行比较，两者的NMR谱图类似。由¹H NMR谱图的解析可知，存在11个芳香属质子［δ 6.036(1H), 6.050 (1H), 6.614 (2H), 7.001 (2H),7.233 (1H), 7.319 (2H), 7.514 (2H)］、5个非芳香属质子［δ4.112 (1H), 4.205 (1H), 4.247 (1H), 5.474 (1H), 5.506 (1H)］（表11）。进一步地，由¹³C -NMR谱图的解析可知，存在18种（推定碳原子数24个）的芳香属碳（δ_C 95.70, 97.06, 98.89, 106.74, 110.02, 121.22, 127.76, 129.23, 129.94, 130.08, 133.29, 139.09, 139.70, 145.94, 146.39, 156.99, 158.22, 159.22）、5种非芳香属碳（δ_C 37.02, 40.76, 72.77, 74.26, 166.17）（表12）。作为对以上数据进行详细解析的结果，推定NBP硫醇分解纯化品峰 2的平面构造为推定构造式2所示。即，推定峰 2成分为（表）没食子儿茶素没食子酸酯的苄基硫醚衍生物。以下，有时称作为“（表）没食子儿茶素没食子酸酯苄基硫醚衍生物”或“（表）没食子儿茶素没食子酸酯衍生物”。

(3) NBP的其它构成成分的结构分析

如上述(1)记载的那样，将NBP的硫醇分解物的HPLC分析结果、与试药、原矢车菊素C1（表儿茶素的3聚体）的硫醇分解物、以及由表儿茶素和表儿茶素没食子酸酯构成的源于葡萄种子的原矢车菊素即Gravinol（注册商标）（Kikkoman制）的硫醇分解物的HPLC分析结果进行比较，由此可以推定NBP的硫醇分解物除了主要的二种成分（峰 1成分和峰 2成分）以外，还由表没食子儿茶素没食子酸酯、表儿茶素的苄基硫醚衍生物、和表儿茶素没食子酸酯的苄基硫醚衍生物这三种成分构成。

因此，将实施例3中制备的NBP-A的10K级分利用上述(1)中进行的硫醇分解法进行分解，并将溶液作为分析试样进行以下的分析。

(3-1) 目的

利用LC-MS测定获得分析试样的质谱，确认分子量。

(3-2) 分析试样

NBP-A的10K级分的硫醇分解溶液

(3-3) 分析项目

质量分析(LC-MS)

(3-4) 分析方法

利用以下的LC-MS条件进行测定。

[表13]

使用装置    ：LC Agilent Technologies制 Agilent LC1100 System

                      MS Applied Biosystems制 QSTAR XL 型

流动相  ：A 液 0.05%三氟乙酸水溶液

              B 液 甲醇

试样溶液    ：NBP-A 10K级分硫醇分解溶液

柱子    ：GL Science Inertsil ODS-3, 4.6mm×250mm S/N 6JI86211

注入量  ：2μL

UV 波长 ：280nm

柱温度  ：25℃附近的一定温度

流动相流量  ：1mL/min

离子化方法  ：Positive ESI

扫描法  ：TOFMS 扫描

测定范围    ：m/z 100～1000

梯度条件：

(3-5) 结果

得到的LC-MS 测定结果统一示于表14。

对于用TIC 检测出的各个峰，利用表14 所示的MS检出峰的精密的m/z 值来进行元素组成演算。

[表14]

LC-MS 测定结果

LC-MS分析中使用与实施例5(1)相同的柱子，但由于分析装置不同，因此与图2的溶出时间稍微不同。根据与其它峰的关系，图2的24分钟的峰对应于LC-MS中26分钟的峰(1)、图2的40分钟的峰对应于LC-MS中42分钟的峰(2)、图2的41分钟的峰对应于LC-MS中43分钟的峰(3)。由于在本LC-MS测定中测定质子化分子离子（[M+H]+）的质荷比(m/z)，因而可以确认LC-MS中的峰(1)与分子量为458的表没食子儿茶素没食子酸酯相符，峰(2)与分子量为412的表儿茶素的苄基硫醚衍生物相符，峰(3)与分子量为564的表儿茶素没食子酸酯的苄基硫醚衍生物相符。峰(2)为表儿茶素的苄基硫醚衍生物，这可以通过与原矢车菊素Ｃ1的硫醇分解后的HPLC分析结果进行比较得以确认。峰(3)为表儿茶素没食子酸酯的苄基硫醚衍生物，这可以通过与Gravinol（注册商标）的硫醇分解后的HPLC分析结果进行比较得以确认。另外，峰(1)是没有衍生化的表没食子儿茶素没食子酸酯，这可以通过与表没食子儿茶素没食子酸酯的市售试药的HPLC分析结果进行比较得以确认。

(4) 构成成分分析汇总

本发明的源于腰果梨的原花色素在酸性条件下与苄基硫醇作用而得到的硫醇分解物含有：推定具有推定结构式1的结构的化合物（通过采用了表5所示条件的ESI-MS分析可检出表7所示的质量峰，通过采用了表6所示条件的¹H NMR和¹³C NMR分析可检出表8和9所示的化学位移值的峰的化合物）、推定具有推定结构式2的结构的化合物（通过采用了表5所示条件的ESI-MS分析可检出表10所示的质量峰，通过采用了表6所示条件的¹H NMR和¹³C NMR分析可检出表11和12所示的化学位移值的峰的化合物）、表儿茶素的苄基硫醚衍生物、表儿茶素没食子酸酯的苄基硫醚衍生物、和表没食子儿茶素没食子酸酯。由此，源于腰果梨的原花翠素推定是以（表）没食子儿茶素、（表）没食子儿茶素没食子酸酯、表儿茶素、表儿茶素没食子酸酯和表没食子儿茶素没食子酸酯为构成成分、下端单元为表没食子儿茶素没食子酸酯的缩合物。

在作为构成单元的类黄酮骨架的色满环的4位碳、与邻接的构成单元中的其它部位（推定为色满环的8位碳或6位碳（参考非专利文献1等））之间形成共价键而聚合，这可以由硫醇分解物中的苄基硫醚的键合位置为4位碳来确认。

下端单元为表没食子儿茶素没食子酸酯，这可以由硫醇分解物中没有被苄基硫醚衍生化的成分仅为表没食子儿茶素没食子酸酯来确认。

实施例6:源于腰果梨的高分子原花色素的聚合度

实施例5中推定了构成源于腰果梨的高分子原花色素的成分和下端单元。本实施例中对聚合度进行推定。

为了推定原花色素的聚合度，利用非专利文献1（J.Agric.Food Chem, 2003, 51, 7513-7521）或其它书籍中记载的方法进行了研究。该方法是通过实施例5中进行的硫醇分解处理物的HPLC分析（检测波长为280nm），利用下端单元的儿茶素类与其它儿茶素类苄基硫醚衍生物的面积比来算出聚合度的方法。

非专利文献1等的论文中，从多种植物中仅能检测到儿茶素或表儿茶素的衍生物，因此对于结构不同的其它儿茶素类，不能直接应用其计算式。因此，利用以下的步骤来算出平均聚合度和构成成分比例。

(1) 分析步骤

(i) 对于源于腰果梨的高分子原花色素的在实施例3中制备的8个超滤截留物，利用实施例5记载的步骤实施硫醇分解处理。

(ii) 在与实施例5相同的条件下利用HPLC（柱子ODS-3、4.6×250mm）对硫醇分解物进行分析，测定280nm下的各峰面积。

(iii) 将和光纯药制的表儿茶素（纯度为98％以上）、表没食子儿茶素（纯度为98％以上）、表没食子儿茶素没食子酸酯（纯度90％以上）、表儿茶素没食子酸酯（纯度98％以上）作为标准品，实施多个浓度下的HPLC分析（与实施例5相同的条件）。

(iv) 由各标准品在280nm下的峰面积，制成各儿茶素类化合物浓度对峰面积的标准曲线。

(v) 通过该儿茶素类化合物的标准曲线算出硫醇分解物中的表没食子儿茶素没食子酸酯、（表）没食子儿茶素苄基硫醚衍生物、（表）没食子儿茶素没食子酸酯苄基硫醚衍生物、表儿茶素苄基硫醚衍生物和表儿茶素没食子酸酯苄基硫醚衍生物的浓度，将算出的浓度基于分子量换算成摩尔浓度。

(vi) 由摩尔浓度的比例利用以下计算式算出平均聚合度（mDP）。计算式：

平均聚合度＝{[（表）没食子儿茶素衍生物摩尔浓度]+[（表）没食子儿茶素没食子酸酯衍生物摩尔浓度]+[表儿茶素衍生物摩尔浓度]+[表儿茶素没食子酸酯衍生物摩尔浓度]}/{表没食子儿茶素没食子酸酯的摩尔浓度}+1

(vii) 含有比例为摩尔浓度的比例。

[表15]

[表16]

该原花色素是下端单元为表没食子儿茶素没食子酸酯、且记载成衍生物的成分聚合化而成的。此外，判定平均聚合度为25～73聚体，主成分的（表）没食子儿茶素为58.5～61.6％，（表）没食子儿茶素没食子酸酯为28.5～30.4％。这种源于天然物的高分子原花色素没有被报道过，因此认为其是腰果梨特有的高分子原花色素。

实施例7: 源于腰果梨的高分子原花色素与其它α-淀粉酶抑制成分的活性比较

对于源于腰果梨的高分子原花色素、其它α-淀粉酶抑制活性成分和Gravinol（注册商标）（源于葡萄种子的原花色素），测定α-淀粉酶抑制活性的IC₅₀（最终待测物浓度），进行活性的比较研究。测定用与实施例1(2)相同的方法进行，全部待测物的测定在同一天实施。

各待测物的制备方法示于以下。

(i) 源于蕃爽丽茶（注册商标）的C18键合多酚成分

将番石榴叶多酚配合茶饮料（蕃爽丽茶（注册商标）(Yakult制））500g负载于C18 Cartriges (Sep-Pak Vac 35cc、Waters制)上，用足够的纯水清洗未吸附成分。用甲醇使键合到C18树脂上的成分溶出，并进行减压蒸馏干固，回收363mg源于蕃爽丽茶（注册商标）的C18键合多酚（蕃爽丽茶PP）。制备该0.2％蕃爽丽茶PP水溶液，将利用0.22μm的过滤器（Millex GP、Millipore公司制）过滤得到的溶液作为待测物。

(ii) Gravinol（注册商标）（源于葡萄种子的原花色素）

制备Gravinol（注册商标）(Gravinol、葡萄种子提取物、Kikkoman制)的0.2％水溶液，将利用0.22μm的过滤器（Millex GP、Millipore公司制）过滤得到的溶液作为待测物。

(iii) 阿卡波糖

阿卡波糖可以用作具有糖苷酶抑制作用的血糖值上升抑制剂（医药品）。另外，由于其具有α-淀粉酶抑制活性，因此作为比较对照品使用。实验中制备阿卡波糖试药(LKT Laboratories,Inc.)的0.4％水溶液，将利用0.22μm的过滤器（Millex GP、Millipore公司制）过滤得到的溶液作为待测物。

(iv) 源于腰果梨的高分子原花色素

制备实施例3中制备的源于腰果梨的NBP-A的超滤100K以上级分的0.1％水溶液，将利用0.22μm的过滤器（Millex GP、Millipore公司制）过滤得到的溶液作为待测物。

测定结果示于下表。

[表17]

各种待测物的α-淀粉酶抑制活性IC₅₀的比较

本研究的结果表明源于腰果梨的高分子原花色素具有强的α-淀粉酶抑制活性。该源于腰果梨的高分子原花色素的活性比蕃爽丽茶PP强33倍。蕃爽丽茶（注册商标）通过每餐摄入70mg以上（番石榴叶多酚换算），可以具有规定的效果，由日本厚生劳动省认定为特定保健用食品，鉴于此，如果每餐摄入2.2mg以上的源于腰果梨的高分子原花色素，则有实现同等的血糖值上升抑制效果的可能性。即，可以期待通过在纯水220g中仅含0.0001％或其以上的源于腰果梨的高分子原花色素，来提供具有α-淀粉酶抑制活性的饮料组合物。另外，还可以期待对于配合得到的加工食品和饮料等的味道等的影响少。

如表17所示，与属于原矢车菊素的Gravinol（注册商标）相比，以原花翠素为主成分的本发明的源于腰果梨的高分子原花色素具有高的α-淀粉酶抑制活性。因此，得出下述结论，即，含有原花翠素成分的高分子原花色素具有比原矢车菊素高的α-淀粉酶抑制活性。

实施例8: 源于腰果梨的高分子原花色素与其它脂肪酶抑制成分的活性比较

已知为了抑制肥胖，抑制脂质的吸收也是有效的，研究开发了大量的脂肪酶活性抑制成分。作为茶饮料的“黑乌龙茶”（商品名，Suntory制）配合了乌龙茶多酚，通过该乌龙茶多酚的作用而抑制脂肪酶，从而具有抑制脂质的吸收的效果，基于该效果，日本厚生劳动省将上述“黑乌龙茶”认定为特定保健用食品。

本实施例中，对于源于腰果梨的高分子原花色素、该茶饮料的成分和其它脂肪酶活性抑制成分，测定了脂肪酶活性抑制的IC₅₀（最终待测物浓度），进行了抑制活性的比较研究。

测定根据非专利文献2（J. Agric. Food Chem. 2007, 55, 4604-4609）进行。荧光测定用96孔板中以25μl/孔的量添加了待测物溶液。对于实检组(本検群)，向其中添加25μl/孔的用PBS(-)制备的脂肪酶溶液（Lipase from porcine pancreas Type II、SIGMA制），对于盲检组，向其中添加25μl/孔的PBS(-)。向这些组中以50μl/孔的量添加用PBS(-)制备的0.1mM的荧光基质溶液（4-methylumbelliferyl oleate、Fluka制）后，使其反应20分钟。以100μl/孔的量添加0.1M枸橼酸钠溶液（pH4.2）作为反应终止液，用荧光测定用酶标仪（Ex365nm Em450nm）进行荧光强度的测定。作为空白试验，除了使用等量的在各待测物溶液的制备中使用的溶剂来代替“待测物溶液”以外，其它用与上述同样的步骤来制备实检组和盲检组的试样，并测定荧光强度。脂肪酶抑制率由下式算出。

＜计算式＞

脂肪酶抑制活性（％）＝（1-（A-B）/（C-D））×100

A：试样溶液的盲检的荧光强度

B：试样溶液的实检的荧光强度

C：空白溶液（稀释溶剂）的盲检的荧光强度

D：空白溶液（稀释溶剂）的实检的荧光强度

另外，各试样溶液的酶抑制活性是在多个浓度下测定，算出抑制50％脂肪酶的浓度（IC₅₀）。

本研究中使用的各待测物的种类和待测物溶液的制备方法示于以下。

(i) 源于黑乌龙茶的C18键合多酚成分

将市售的作为茶饮料的黑乌龙茶（Suntory制）500g负载于C18 Cartriges(Sep-Pak Vac 35cc、Waters制)上，用足够的纯水清洗未吸附成分。用甲醇使键合在该C18树脂上的成分溶出，进行减压蒸馏干固，回收到442.9mg源于黑乌龙茶的C18键合多酚（黑乌龙茶PP）。本来对于口服用如果不用纯水溶解，则不是合适的，但纯化的黑乌龙茶PP几乎不溶解于纯水中，因此用50％（W/W）甲醇水溶液制备1.0％溶液，并将用0.22μm的过滤器（Millex GP、Millipore公司制）进行过滤得到的溶液作为待测物。另外，待测物溶液的稀释用纯水进行。对与待测物的稀释率同样的50％甲醇水溶液也测定了脂肪酶抑制活性，认为其没有脂肪酶抑制活性。

(ii) 表没食子儿茶素没食子酸酯

由于在专利文献5（日本特开2006-1909号公报）“具有脂肪酶抑制活性的新型化合物”中记载了具有脂肪酶抑制活性，因此制备表没食子儿茶素没食子酸酯（和光纯药）的0.2％水溶液，将利用0.22μm的过滤器（Millex GP、Millipore公司制）过滤得到的溶液作为待测物。

(iii) Gravinol（注册商标）（源于葡萄种子的原花色素）

制备Gravinol（注册商标）(Gravinol、葡萄种子提取物、Kikkoman制)的0.2％水溶液，将利用0.22μm的过滤器（Millex GP、Millipore公司制）过滤得到的溶液作为待测物。

(iv) 氯原酸

制备在记载了脂肪酶测定法的非专利文献2中记载的氯原酸（MP Biomedicals, Ins.）的1.0％水溶液，将对其利用0.22μm的过滤器（Millex GP、Millipore公司制）过滤得到的溶液作为待测物。

(v) 源于腰果梨的高分子原花色素

制备实施例3中制备的源于腰果梨的NBP-A的超滤100K以上级分的0.2％水溶液，将利用0.22μm的过滤器（Millex GP、Millipore公司制）过滤得到的溶液作为待测物。

测定结果示于下表。

[表18]

源于腰果梨的高分子原花色素的IC₅₀为0.5μg/ml，同时测定的氯原酸为77.5μg/ml。非专利文献2中，9聚体以上的原矢车菊素的脂肪酶抑制IC₅₀为0.9μg/ml，同时测定的氯原酸（Chlorogenic acid）为59.8μg/ml。由此，与作为儿茶素和表儿茶素聚合物的原矢车菊素相比，含有原花翠素成分的高分子原花色素的活性足够强。

另外，如表18所示，与属于原矢车菊素的Gravinol（注册商标）相比，以原花翠素为主成分的本发明的源于腰果梨的高分子原花色素具有高的脂肪酶抑制活性。由此可知，含有原花翠素成分的高分子原花色素具有比原矢车菊素高的脂肪酶抑制活性。

由以上结果可知源于腰果梨的高分子原花色素具有非常强的脂肪酶抑制活性。黑乌龙茶PP由于在纯水中不能充分溶解，因此在水溶液中也有产生不溶性沉淀的可能性。源于腰果梨的高分子原花色素显示比文献值小的值，可以说具有非常强的脂肪酶抑制活性。黑乌龙茶作为特定保健用食品的摄取量为70mg。由本测定结果可知，表现同等活性的源于腰果梨的高分子原花色素为7.5mg。即，通过在加工食品或饮料100g中仅仅含有0.0075％或其以上的源于腰果梨的高分子原花色素，可以期待提供具有脂肪酶抑制作用的饮食品组合物。

实施例9: 细菌性脂肪酶抑制活性的测定

已知细菌性脂肪酶可由存在于皮肤表层的、痤疮丙酸杆菌(Propionibacterium acnes：通称粉刺菌)、微球菌属的细菌(Micrococcus sp.)、假单胞菌属的细菌（Pseudomonas sp.）等细菌类产生。特别对于粉刺菌，正在对由其脂肪酶生成的遊离脂肪酸所导致的细菌数增加或皮肤炎症反应的诱发进行研究，对此已知脂肪酶抑制剂是有效的。

为了广泛评价本发明产品和公知的多个成分的脂肪酶抑制活性，使用市售的源于假单胞菌属的细菌（Pseudomonas sp.）的脂肪酶。假单胞菌属是革兰氏阴性且好氧性真菌的一属。熟知代表性的菌有绿脓杆菌 (P. aeruginosa)。实验中使用Sigma-Aldrich Japan公司的Lipase from Pseudomonas sp.(Type XIII,≥15units/solid、L9518)。本脂肪酶是非常强效的酶。由预试验可知，抑制活性试验中使用0.1μg/ml的脂肪酶溶液。实验中，对于含有本发明产品的源于腰果梨的高分子原花色素的实施例2和3中得到的各截留物进行测定。另外作为比较对照品，使用以下试药测定脂肪酶抑制活性。

＜细菌性脂肪酶活性抑制试验的被测物质：本发明产品＞

(1) 本发明产品的源于腰果梨果泥的10K超滤膜浓缩物的冻干品

对于腰果梨果泥4773g，按照实施例2记载的步骤进行至采用了分子量1万的超滤膜（Hydrosart（注册商标）10KDa、Sartorius公司制）的超滤浓缩处理，将浓缩液进行冻干处理，得到26.4g的粉末。

(2) 本发明产品的源于腰果梨的HP-20树脂纯化处理物的冻干粉品

将上述(1)得到的10K超滤浓缩物的冻干品约26g作为试样，利用与实施例2中记载的步骤相同的步骤进行HP-20树脂纯化处理，通过冻干处理得到3.7g的粉末。

(3) 本发明产品的源于腰果梨的高分子原花色素（NBP-M水溶液）

在实施例2中进行LH-20树脂柱截留处理，用甲醇进行溶出，将用实施例3的步骤由超滤膜截留的4种截留物的冻干物分别制备成0.1％水溶液，将该水溶液以各级分的重量比例混合而成的溶液作为NBP-M水溶液。

(4) 本发明产品的源于腰果梨的高分子原花色素（NBP-A水溶液）

在实施例2中进行LH-20树脂柱截留处理，用70％丙酮水溶液进行溶出，将用实施例3的步骤由超滤膜截留的4种截留物的冻干物分别制备成0.1％水溶液，将该水溶液以各级分的重量比例混合而成的溶液作为NBP-M水溶液。

＜细菌性脂肪酶活性抑制试验的被测物质：比较对照品＞

(5) 四环素盐酸盐（和光纯药工业制、生化学用、纯度90％以上、205-08591）

其是属于四环素系的抗生物质。其抑制微生物的蛋白质合成，表现为广范围的抗菌谱。作为利用了脂肪酶抑制活性的内服和外用剂，可以广泛使用四环素系的抗生物质。在专利文献7(日本特开2008-19180号公报)等中被记载作为脂肪酶抑制活性的比较物质。

(6) 3,4-二羟基桂皮酸（咖啡因酸、咖啡酸：和光纯药工业制、和光一级、纯度98％以上）

专利文献8（日本特开2005-53891号公报）中记载作为细菌性脂肪酶抑制活性成分。

(7) 没食子酸（没食子酸1水合物、和光纯药工业制、和光一级）

专利文献8（日本特开2005-53891号公报）中记载作为细菌性脂肪酶抑制活性成分。

(8) 氯原酸（Chlorogenic acid,MP Biomedicals Inc.制、和光纯药工业输入?出售）

非专利文献2（J. Agric. Food Chem. 2007, 55, 4604-4609）中记载作为源于胰脏的脂肪酶抑制活性成分。

(9) （-）-没食子酸表没食子儿茶素（表没食子儿茶素没食子酸酯、和光纯药工业制、生化学用、纯度为90％以上）

其被报道作为胰脏由来脂肪酶抑制活性成分。另外，其是本发明产品的高分子原花色素的主要构成成分的一部分的可能性高。

＜脂肪酶抑制活性试验方法＞

测定根据非专利文献2（J. Agric. Food Chem. 2007, 55, 4604-4609）进行。在荧光测定用96孔板中，以25μl/孔的量添加待测物稀释溶液和空白溶液（待测物稀释溶液）。对于实检组，向其中添加25μl/孔的用PBS(-)制备的脂肪酶溶液（Lipase from Pseudomonas sp. TypeXIII、SIGMA制），对于盲检组，添加25μl/孔的PBS(-)。向其中添加50μl/孔的用PBS(-)制备的0.1mM 荧光基质溶液（4-methylumbelliferyl oleate、Fluka制）后反应20分钟。作为反应终止液，添加100μl/孔的0.1M枸橼酸钠溶液（pH4.2），利用荧光测定用酶标仪（Ex365nm　Em450nm）进行荧光强度的测定。脂肪酶抑制率由下式算出。并且，3,4二羟基桂皮酸和没食子酸用10％甲醇水溶液溶解，空白溶剂也用同样浓度的甲醇水溶液进行测定。

＜计算式＞

脂肪酶抑制活性（％）＝（1-（A-B）/（C-D））×100

A：试样溶液的盲检的荧光强度

B：试样溶液的实检的荧光强度

C：空白溶液（稀释溶剂）的盲检的荧光强度

D：空白溶液（稀释溶剂）的实检的荧光强度

对于各试样溶液的酶抑制活性，根据在多个浓度下测定并进行对数绘图的测定点，利用最小二乘法算出抑制脂肪酶50％的浓度（IC₅₀）。

(1)～(9) 的待测物的测定结果示于下表。

[表19]

各待测物的脂肪酶抑制活性的IC₅₀

由该结果可以判定，NBP-M和NBP-A水溶液对于细菌性脂肪酶具有非常强的抑制活性。另外，即使对于(1)10K超滤浓缩物，也具有比四环素盐酸盐或3,4二羟基桂皮酸等更强的抑制活性，因此即使是本发明产品的含有高分子原花色素的粗纯化物，也可以期待充分的作用。

实施例10: 源于腰果梨的高分子原花色素的超滤截留物的细菌性脂肪酶抑制活性

使用实施例3中进行超滤截留并冻干处理的粉末，对于分子量和细菌性脂肪酶抑制活性进行研究。脂肪酶抑制活性试验利用实施例9的方法进行。其结果示于下表。

[表20]

源于腰果梨的高分子原花色素的分子量截留和细菌性脂肪酶抑制活性

由该结果可以判定，源于腰果梨的高分子原花色素的分子量越大，细菌性脂肪酶抑制活性越有变强的倾向。由此可以认为，通过用分子量比1万大的超滤膜进行处理，粗纯化物的细菌性脂肪酶抑制活性变得更强。这意味着可从最终制品所要求的脂肪酶抑制活性的强度和生产效率的角度考虑来选择超滤膜的种类。但是，对于本发明产品，超滤膜处理不是必须的，以充分的量含有源于腰果梨的高分子原花色素，这是作为脂肪酶抑制剂最重要的因素。

在作为医药品的“Staderm 软膏霜剂（岛居药品）”中，配合了5％专利文献7（日本特开2008-19180号公报）中记载的布洛芬吡甲酯作为脂肪酶抑制剂。因此，推定即使对于本发明产品的10K超滤浓缩物的粗纯化物，也能够以5％以下的含量期待效果。进一步地，推测如果是纯化的100K NBP-A，则只要含有0.05％以上，就可以期待充分的效果。其理由是因为如果对脂肪酶抑制活性的IC₅₀进行比较，则100K NBP-A具有四环素盐酸盐的100倍以上的脂肪酶抑制活性，所述四环素盐酸盐具有与布洛芬吡甲酯同等的脂肪酶抑制活性。因此，可以期待以0.001％～10％、优选0.01％～5％的量含有作为本发明产品的源于腰果梨的高分子原花色素的组合物，作为脂肪酶抑制性组合物是有效的。

参考实验: 利用DPPH自由基清除进行的抗氧化活性测定

使用作为稳定自由基的Diphenyl-p-picrylhydradil (DPPH)的乙醇液来评价抗氧化活性。在250mM醋酸缓冲液(pH=5.5) 1600μl中混合乙醇 1200μl、待测物 400μl(调节至任意的浓度)，在30℃进行5分钟的预孵育。向该溶液中添加800μl的500μM DPPH/乙醇溶液并进行混合，在30℃放置30分钟后，测定517nm的吸光度。当将用乙醇溶解的比较对照品作为待测物时，将乙醇800μl、待测物的乙醇溶液400μl、纯水400μl混合，在30℃进行5分钟的预孵育。向该溶液中添加800μl的500μM DPPH/乙醇溶液并混合，在30℃放置30分钟后，测定517nm的吸光度。作为对照，使用纯水进行同样的操作。由测定的吸光度通过下式算出自由基清除率。

清除率(%) = (1 - [试样的吸光度] / [对照的吸光度]) × 100

分等级地改变试样溶液的试样浓度，进行上述清除率的测定，求得DPPH自由基的清除率为50%的试样溶液的浓度，将其作为DPPH自由基50%清除浓度。由此，该数值越低，则自由基清除能力越高。以下在试验中使用的待测物和测定结果示于表中。

测定待测物

＜本发明产品：与实施例9中制备的物质为相同的待测物＞

(1) 本发明产品的源于腰果梨果泥的10K超滤膜浓缩物的冻干品（10K超滤浓缩物）

(2) 本发明产品的源于腰果梨的HP-20树脂纯化处理物的冻干粉品（HP-20树脂纯化品）

(3) 本发明产品的源于腰果梨的高分子原花色素（NBP-M水溶液）

(4) 本发明产品的源于腰果梨的高分子原花色素（NBP-A水溶液）

＜比较对照品：与在实施例9中使用的试药相同＞

(5) 3,4二羟基桂皮酸（咖啡因酸、咖啡酸：和光纯药工业制、和光一级、纯度98％以上）：在乙醇中溶解后用于实验

(6) 没食子酸（没食子酸1水合物、和光纯药工业制、和光一级）：在乙醇中溶解后用于实验

(7) （-）-没食子酸表没食子儿茶素（表没食子儿茶素没食子酸酯、和光纯药工业制、生化学用、纯度90％以上）：在纯水中溶解后用于实验

(8) L(+)-抗坏血酸（关东化学制、特级）：在纯水中溶解后使用

[表21]

DPPH自由基清除活性试验

本测定的结果表明：作为本发明产品的纯化物的 (3) NBP-M水溶液和 (4) NBP-A水溶液具有与作为抗氧化成分的抗坏血酸相同的充分的抗氧化性。另外，确认作为粗纯化物的10K超滤浓缩物和HP-20树脂纯化品也具有抗氧化性。根据这些结果，脂肪酶抑制活性和自由基清除活性没有相关性。本发明产品独立地具有脂肪酶抑制能力和抗氧化能力。

实施例11: 各种果胶酶处理和淀粉酶抑制活性的研究

(1) 实验目的

在上述实施例中，使用了果胶酶A“Amano”（Amano Enzyme Inc.）作为果胶酶。本实施例中，可以确认即使在使用了其它果胶酶制品（同社制的果胶酶G“Amano”和果胶酶PL“Amano”）的情况中，也可以得到具有上述活性的腰果梨果泥处理物。

(2) 腰果梨果泥原料

使用了与实施例1～10中使用的原料不同批号的腰果梨果泥原料。

(3) 实验步骤

(i) 将腰果梨果泥以各20g的量分注到3个50ml离心管中。

(ii) 在腰果梨果泥20g中添加果胶酶A“Amano”、果胶酶G“Amano”和果胶酶PL“Amano”各0.1g，在50℃的恒温槽中进行1小时的加热处理。将其以3000rpm, 20分钟, 20℃的条件进行离心分离处理，使用0.22μm过滤器（Millex GP、Millipore制）1个将处理后的上清过滤，制备得到的过滤器滤液，作为待测物。

(iii) 将待测物用纯水稀释，制备20％、10％、5％、2.5％、1.25％水溶液，测定源于猪胰脏的α-淀粉酶抑制活性。

(4) 实验结果

图19表示了α-淀粉酶抑制活性的测定结果。

可确认所有酶处理液具有淀粉酶抑制活性。

(5) 实验结果的考察

果胶酶A“Amano”中含有果胶酶45％、β-淀粉酶25％、硅藻土30％。果胶酶G“Amano”中含有果胶酶90％和硅藻土10％。另外，果胶酶PL“Amano”中，以果胶酶70％为主成分，具有果胶酶活性和纤维消化能力。使用这些组成不同的三种果胶酶制剂的任一者，均可得到本发明的腰果梨果泥处理物。因此，只要是具有果胶酶活性的食品工业用的果胶酶即可，均可以毫无问题地使用。

实施例12

(1)目的

本试验的目的是确认以腰果梨果泥、和离心分离残渣作为原料时的α淀粉酶抑制活性。

(2)步骤

实验步骤如以下所示。

(i) 将腰果梨果泥40.82g以3000rpm、20分钟、20℃的条件进行离心分离处理。

(ii) 在果泥经离心处理的沉淀物5.6g中加入纯水14.4g，进行悬浮，并添加果胶酶A“Amano”0.1g，在50℃的恒温槽中进行1小时的加热处理。将其以3000rpm、20分钟、20℃的条件进行离心分离处理后得到上清，使用1个0.22μm过滤器（Millex GP、Millipore制）将该上清过滤，制备滤液，作为待测物1。

(iii) 在腰果梨果泥20g中添加果胶酶A“Amano”0.1g，在50℃的恒温槽中进行1小时的加热处理。将其以3000rpm、20分钟、20℃的条件进行离心分离处理后得到上清，使用1个0.22μm过滤器（Millex GP、Millipore制）将该上清过滤，制备滤液，作为待测物2。

(iv) 将待测物1～5用纯水稀释来制备25％、10％、5％水溶液，测定源于猪胰脏的α-淀粉酶抑制活性。

(3)实验结果

下表中表示α-淀粉酶抑制活性的测定结果。

[表22]

腰果梨果泥的离心上清的淀粉酶抑制活性

可以确认果泥的离心沉淀物和果泥的果胶酶处理滤液具有淀粉酶抑制活性。

实施例13: 对于粉刺菌的抗菌活性的测定

(1) 目的

确认本发明的源于腰果梨的高分子原花色素对于粉刺菌（Propionibacterium acnes）的抗菌活性。为了进行抗菌活性的评价，根据日本化学疗法学会标准法1993年修订版测定含有源于腰果梨的高分子原花色素的试验品对于粉刺菌的最小抑菌浓度（MIC）。

(2) 试验品

作为含有源于腰果梨的高分子原花色素的试验品，使用了NBP和NBP-A(100K)。

NBP是指在实施例2中，利用截留分子量为1万的超滤膜将腰果梨果泥的果胶酶处理物浓缩、并将所得浓缩物利用HP-20树脂纯化而得到的HP-20树脂纯化品。

NBP-A(100K)是指将NBP-A在实施例3中利用截留分子量10万的超滤膜进行浓缩而得到的级分，所述NBP-A是在实施例2中将上述NBP进而用LH-20树脂纯化而得到的级分

(3) 试药等

试验菌使用了Propionibacterium acnes JCM 6425^T。

试验菌前培养用培养基使用了改良GAM琼脂培养基（日水制药）。

试验菌制备液和感受性测定用培养基使用Mueller-Hinton broth (BBL)。

(4) 试验方法

根据日本化学疗法学会标准法进行。

(4-1) 试验菌液的制备

将冷冻保存的菌株在36±1℃进行48小时的厌氧培养。刮取生长的菌落，在试验菌制备液中悬浮后，利用脱脂棉过滤。将菌液制备成约10⁷ CFU/mL，形成试验菌液。

(4-2) 试验品稀释系列的制作

将用灭菌纯水稀释至3200μg/mL的试验品0.8mL加入到灭菌离子水0.8mL中，并稀释2倍。以下同样重复稀释2倍，制成合计10个级别（试验品浓度: 1600、800、400、200、100、50、25、12.5、6.25、3.125μg/mL）的试验品稀释系列。

(4-3) 培养基的混合

将预先分注的2倍浓度的感受性测定用培养基和试验品稀释系列的各溶液进行等量混合。作为该混合的结果，试验品溶液稀释了2倍（试验品浓度: 800、400、200、100、50、25、12.5、6.25、3.125、1.5625 μg/mL），另外培养基也稀释了2倍，形成通常的浓度。将与培养基混合的试验品稀释系列以各0.1mL/孔的量、以需要的系列分注到U字型孔的微孔板中。

(4-4) 试验操作

在微孔板的各孔中各滴加5μL试验菌液，在36±1℃进行48小时的厌氧培养。以没有滴加菌的孔作为阴性对照，用肉眼判定菌生长（沉淀）的有无，将没有观察到菌生长的最小浓度作为MIC值。

(5) 试验结果

作为试验品的NBP和NBP-A(100K)的生长试验结果和MIC值示于下表。

并且，试验菌液的菌数为2.3×107 CFU/mL ，各孔中滴加的菌数为1.1×10⁵ CFU/孔。

[表23]

各试验品的生长试验结果和MIC值

n = 1

+ : 生长

- : 没有生长

(6) 考察

NBP的MIC值为50μg/mL，NBP-A(100K) 的MIC值为12.5μg/mL。由此可以确认高分子原花色素的纯化度越高的试样，对于粉刺菌的抗菌活性越高。

本试验中使用的作为粉刺菌的Propionibacterium acnes JCM 6425^T，在专利文献11和12中被用于粉刺菌增殖抑制成分的评价。专利文献11中记载了通过将100μg/mL (0.01%)的异丙基甲基苯酚和100μg/mL (0.01%)的顺式-6-十六烯酸组合来抑制粉刺菌的增殖的方法。专利文献12中记载了通过在1250μg/mL的对羟苯甲酸甲酯中以63μg/mL的浓度组合dl-α-生育酚磷酸钠来抑制粉刺菌生长的方法。

NBP和NBP-A(100K)对于Propionibacterium acnes JCM 6425T的MIC值表明NBP和NBP-A(100K)与专利文献11和12中记载的成分相比，具有更高的抗菌性。

处方例1：化妆水

可以利用表24所示的组成和制法制备化妆水，所述化妆水配合了含有高分子原花色素的本发明的源于腰果梨的10K超滤浓缩物（实施例9(1)中制备的物质）。

[表24]

（制法）

1）将成分（1）～（5）混合，用（7）使其为80，一边在50℃搅拌一边溶解。

2）将成分（8）～（11）混合，一边在50℃搅拌，一边溶解。

3）在1）中少量添加2），在50℃进行混和搅拌。

4）均一混和后，进而一边搅拌一边由50℃降低至30℃。

5）达到30℃后停止搅拌，加入（6），并用（7）调合至100。

6）再次进行混和搅拌，得到均一混和的化妆水。

处方例2：乳液

利用表25所示的组成和制法制备乳液，所述乳液配合了含有高分子原花色素的本发明的源于腰果梨的10K超滤浓缩物（实施例9(1)中制备的物质）。

[表25]

（制法）

1）将成分（1）、（8）混合，用（9）使其为70，在80℃加热。

2）将成分（2）、（3）与（9）混合，一边在常温搅拌一边进行溶解。

3）将成分（4）、（5）与（9）混合，一边在常温搅拌一边进行溶解。

4）将成分（6）、（7）与（9）混合，一边在常温搅拌一边进行溶解。

5）在（9）中每次少量加入1），在80℃进行混和搅拌。

6）进一步地，一边搅拌一边在5）中依次加入2）、3）。

7）均匀混和后，一边搅拌一边降低至50℃。

8）达到50℃后，加入4），用（9）调合至100。

9）再次一边搅拌一边降低至30℃。

10）达到30℃后停止搅拌，得到均一混和的乳液。

处方例3：霜剂

可以利用表26所示的组成和制法来制备霜剂，所述霜剂配合了含有高分子原花色素的本发明的源于腰果梨的10K超滤浓缩物（实施例9(1)中制备的物质）。

[表26]

（制法）

1）将成分（1）～（9）混合，一边在80℃搅拌一边溶解。

2）将成分（10）～（12）混合，一边在80℃搅拌，一边溶解。

3）在2）中每次少量加入1），进行乳化。

4）一边搅拌一边冷却，降低至40℃。

5）在达到40℃后停止搅拌，得到均一混和的霜剂。

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