检测22q11微缺失综合征的基因芯片及使用方法、试剂盒

技术领域

本发明涉及一种生物技术领域的基因芯片及使用方法、试剂盒，具体涉及一种检测22q11 微缺失综合征的基因芯片及使用方法、试剂盒。

背景技术

22q11微缺失综合征(22q11DS)是最常见的遗传综合征之一，在新生儿中的发生率约为 1/9804～1/5950，其发生是由于22号染色体长臂近着丝粒段q11.21～q11.23杂合性缺失所致。 主要包括以临床表型特征定义的DiGeorge综合征(DGS)、腭-心-面综合征(VCFS)、圆锥动 脉干-异常面容综合征(CAFS)、Cayler心面综合征和部分单纯性先天性心脏病(CHD)。尽 管22q11DS表型广泛且多样，但大多数患有CHD，由于他们经常合并低钙血症、免疫功能低下、 后鼻孔堵塞等异常，手术成功率及预后远不如非综合征型CHD患者，所以产前诊断、二级干预 将成为预防严重出生缺陷的主要手段。

先天性心脏病CHD是22q11最常见的表型，大约75％～85％的22q11DS患者都会发生CHD，并 且所涉及的CHD表型并不特异，换言之，几乎所有CHD类型的患者都有可能存在22q11微缺失。

除CHD外，22q11DS患者还可能存在多个系统的异常，文献报道的有180多种，比较常见的 有典型的面容(睑裂狭小、盔状眼睑、鼻根部凸出、鼻尖肥大、方形外耳郭、口及下巴较小)、 细胞免疫缺陷、低钙血症、腭裂、胃肠道功能紊乱和喂养困难、生殖泌尿器官畸形、骨骼异 常、内分泌紊乱、语言和学习障碍、行为和精神异常等。婴儿常常由于显著的喂养困难而导 致生长发育停滞；较大的儿童则往往会因一系列行为问题如注意力不集中、多动症、孤独症 而在学校中经历困难；成人则会出现反复性的呼吸道感染、自身免疫紊乱、心理异常、精神 分裂症。婴儿期持续的低钙血症是由于甲状旁腺功能低下所致，通常在1岁时恢复正常，但 儿童期和成人期容易复发。

由于CHD是22q11DS常见的表型，涉及类型多种多样，且随着国际妇产科超声协会“胎儿 心脏筛查指南”的颁布，对妊娠中晚期胎儿心脏筛查进行指导，规范了筛查切面，提高了筛 查效率，使得大部分复杂先心病在产前得以诊断。因而，对超声筛查发现的CHD胎儿进行22q11 微缺失产前诊断，及早进行出生缺陷干预及再发生育风险评估，将成为产前诊断的重要课题； 此外，由于10％～15％的22q11微缺失来自遗传，有22q11微缺失生育史和夫妇双方中有22q11 微缺失者再次妊娠时也需进行产前诊断。

目前对22q11DS的检测有以下几种方法：染色体核型分析，一般作为初筛手段；荧光原位 杂交(FISH)，检出率为90％-95％；多重PCR，但是必须有父母的DNA作为对照；以及多重连 接探针扩增(MLPA)、实时荧光定量PCR(RT-PCR)等。然而尚无一种快速、低成本、大通量 和自动化检测22q11微缺失综合征基因突变的方法。

比较基因组杂交(CGH)芯片分析技术是一种突破性技术，能够支持研究人员通过微阵列 准确研究与疾病有关的染色体的变化。比较基因组杂交(CGH)芯片分析的原理是在一张芯片 上用两份标记不同荧光素的样品(检测样品和对照样品)同时进行杂交，从而快速而又直观 地检测实验样品和对照样品之间基因组DNA的拷贝数量的差异。CGH应用于疾病遗传学的研 究，可以提供一个全基因组的扫描图，提示样本DNA在整个染色体组的哪个特定位置存在扩增 或缺失，那些发生扩增的区域，极有可能存在致病基因，而缺失区域即可能包含一些抑制基 因。因此，需要一种新的技术方案来克服现有技术的上述不足和缺点。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种检测22q11微缺失综合征的基因芯片及 使用方法、试剂盒。本发明的基因芯片操作步骤简单，检测特异性高，稳定性好，时间短， 成本低的特点。本发明还提供了前述检测22q11微缺失综合征的基因芯片的使用方法和试剂 盒。

本发明的目的是通过以下技术方案实现：

第一方面，本发明提供一种检测22q11微缺失综合征的基因芯片，包括固相载体和固定 在该固相载体上的寡核苷酸探针，所述寡核苷酸探针为SEQ ID N0.1～50所示的核苷酸序列。

优选地，所述固相载体选自载玻片、硅片、硝酸纤维素膜、尼龙膜或聚本乙烯。

第二方面，本发明还涉及前述检测22q11微缺失综合征的基于芯片的使用方法，包括以 下步骤：

(a)制备样品DNA片段；

(b)荧光标记上述DNA片段；

(c)洗脱上述标记产物；

(d)将标记产物与所述基因芯片杂交；

(e)扫描检测基因芯片的杂交信号，获得结果。

第三方面，本发明还涉及一种用于检测22q11微缺失综合征的试剂盒，所述试剂盒包括 权利要求1所述的基因芯片。

优选地，所述试剂盒还包括标记物，所述标记物为Cy3-dUTP。

优选地，该试剂盒还包括标记物，所述标记物为Cy5-dUTP。

本发明具有如下的有益效果：本发明的基因芯片操作步骤简单，检测特异性高，稳定性 好，该芯片多次试验重复性高；时间短，从样本抽提到获得扫描结果可在一天内完成。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解为：这些实施例仅用于说明本发明而 不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件， 例如Sambrook等分子克隆：实验室手册见New York Cold Spring Harbor Laboratory出版社 1989年版中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例

本实施例的基因芯片由固相载体和固定在该固相载体上的寡核苷酸探针，所述寡核苷酸 探针为SEQ ID NO.1～50所示的核苷酸序列，所述固相载体为玻片。本实施例基因芯片的固 相载也可选用硝酸纤维素膜、硅片、尼龙膜或聚本乙烯。本实施例的寡核苷酸探针由安捷伦 公司生产，同时本实施例的基因芯片也由安捷伦公司按照常规方法生产。

本实施例基因芯片的使用方法，步骤如下：

(1)样品DNA片段的制备

取患者、正常人血液，采用常规方法抽提全基因组DNA(gDNA)。

将水浴锅温度调到37℃和65℃，溶化10×Buffer C(见下表)，短暂涡旋震荡后离心数秒。

对每个反应来说，将gDNA加入到适当的无核酸酶的PCR管中，并加入无核酸酶的水使反应 体积达到10.1μL。

在冰上准备酶切混合母液，按顺序加入以下试剂：

其中，10×Buffer C由Rsa I提供；Acetylated BSA由Alu I提供；Promega Alu I的货号 为Promega p/n R6281；Promega Rsa I的货号为Promega p/n R6371。

将2.9μL酶切反应液加入到gDNA反应管中，使之体积达到13μL。上下颠倒使之混匀。 进行PCR反应，反应程序为：37℃运行2小时，65℃运行20分钟。

反应后将反应管转移到冰上，取2μL酶切好的gDNA，配置0.8％琼脂糖胶，用SYBR Gold 染色，跑电泳检测酶切是否完全。大部分酶切产物长度应在200bp-500bp。

(2)DNA的荧光标记

在每个反应管中加入2.5μL随机引物(Agilent Genomic DNA Labeling Kit，Agilent p/n 5188-5309)，使之体积达到13.5μL，轻轻上下颠倒进行混匀。进行PCR反应，反应程序为： 95℃变性3分钟。将反应管转移至冰上5min。

准备标记混合母液，按顺序加入以下试剂：

#Agilent Genomic DNA Labeling Kit，Agilent p/n 5188-5309。

将11.5μL标记反应液加入到gDNA反应管中，使之体积达到25μL。轻轻上下颠倒使之混 匀。进行PCR反应，反应程序为：37℃运行2小时，65℃运行10分钟。将反应管转移到冰上。 其中Cy3-dUTP标记正常人gDNA，Cy5-dUTP标记患者gDNA。

(3)标记gDNA的洗脱

加入430μL的1×TE(pH 8.0)到每个反应管中。将一个Microcon YM-30过滤柱(Millipore p/n 42410)放入一个1.5mL离心管中，并且将标记好的gDNA加到滤膜上。室温下8000g离心 10min。弃滤液。加入480μL的1×TE(pH 8.0)到每个过滤柱中。室温下8000g离心10min。 弃滤液。

倒置过滤柱，放入一个新的1.5mL离心管中。室温下8000g离心1min收集纯化样本。检查 并记录每管洗出液的体积。如果体积超出10μL，将洗出液重新加到滤膜上，室温下8000g离 心1min。弃滤液。

重复上述两步直到样本体积均小于等于10μL。加入1×TE(pH 8.0)使最终体积达到10 μL。从每个样本中取1.5μL检测产量和比活，使用NanoDrop ND-1000UV-VIS分光光度计(由 Thermo Fisher Scientific Inc提供)测量。

将等量的分别用Cy5和Cy3标记的两种样本在一个新的1.5mL耐高温的离心管中混合，达到 最终体积158μL。

(4)样品的预处理

向装有10×Blocking Agent冻干粉的小瓶中加入1350μL无核酶的水。在使用或保存之前， 室温放置60min，涡旋振荡混匀。

将水浴锅调至95℃和37℃。

在一个无核酶的离心管中按顺序加入以下试剂：

其中，Cot-1DNA的货号为Invitrogen p/n 15279-011；

Agilent 10×Blocking Agent与Agilent 2×Hybridization Buffer的货号为Agilent p/n 5188-5220。

上下颠倒混合样品，随后短暂离心。将样品管转移到95℃水浴锅中水浴保温3min。立即 将样品管转移到37℃水浴锅中水浴保温30min。将样品管拿出水浴锅，17900g离心1分钟，收 集管底样品。

(5)芯片杂交

将一张干净的垫片放在杂交室(Agilent p/n G2534A)底部，使垫片标志朝上，并与杂 交室底部的长方形区域对齐。确保垫片与杂交室底部同高。

缓慢地以画圈的方式将40μL杂交样品混合液加到垫片上的垫圈内区域。将芯片的活性面 朝下放在垫片上，使得印有数字条形码的一面朝上，而印有“Agilent”标志的条形码一面朝 下。确保两者相互对齐。将杂交室盖子盖在“垫片-杂交样品-芯片”三明治结构上，滑动夹 具使之固定。手动加固杂交室上的夹具。垂直旋转组装好的杂交室以润湿芯片，观察气泡是 否可以自由流动。如果发现静止的气泡，可以将杂交室放在桌面上通过轻轻敲打芯片或垫片 使之移动。将组装好的杂交室固定在旋转器上，放入65℃的杂交炉中以20rpm的转速转动， 杂交24小时。

(6)芯片洗脱和扫描

在室温下将染色缸1#装满Wash Buffer 1(Agilent Oilgo aCGH Wash Buffer 1，Agilent p/n 5188-5221)。将一个芯片架放入染色缸2#。并往染色缸2#中放入一个磁力搅拌子。室温 下往染色缸2#中装入足够多的Wash Buffer 1使之足以覆盖芯片架。将染色缸2#放在磁力搅拌 器上。将在37℃烘箱中预热过的染色缸3#放在带有加热元件的磁力搅拌器上，装入3/4体积的 预热过的Wash Buffer 2(Agilent Oligo aCGH Wash Buffer 2，Agilent p/n 5188-5222)， 再放入一个磁力搅拌子。打开加热元件，保持Wash Buffer 2的温度于37℃；用温度计控制温 度。将一个杂交室从杂交炉中拿出来并计时。记录杂交过程中是否形成气泡以及所有气泡是 否旋转自由。拆卸杂交室。从有条形码的一端撬开三明治结构。通过将干净镊子伸入两张拨 片之间，轻轻分开两张玻片。让垫片落入染色缸底部。将芯片移至染色缸2#(Wash Buffer 1) 的芯片架上。同时避免让芯片暴露于空气中。

开启磁力搅拌器搅拌5min。调整转速以达到良好而不过分的搅拌。将芯片架转移至装有 Wash Buffer 2、预热到37℃的染色缸3#，搅拌1min。在5-10s内缓慢将芯片架移出。尽可 能减少芯片上的液滴。弃用过的Wash Buffer 1和Wash Buffer 2。立即扫描芯片以减少环 境中氧化剂对于信号强度的影响。本实施例的基因芯片操作步骤简单，检测特异性高，稳定 性好，该芯片多次试验重复性高；时间短，从样本抽提到获得扫描结果可在一天内完成。