高密度发酵过程中二氧化碳对微生物生长及代谢抑制作用的测量方法

技术领域

本发明涉及发酵工程技术领域，具体涉及一种高密度发酵过程中二氧化碳对微生物 生长及代谢抑制作用的测量方法。

背景技术

二氧化碳是微生物生长过程中的代谢产物之一，它对细菌、酵母菌和霉菌等微生物 生长和代谢过程都有一定的影响。起初人们只是利用二氧化碳控制致病菌和食物腐烂菌 的生长以便保护食品及水的质量，后来却发现在发酵过程中微生物自身代谢出的大量二 氧化碳会对微生物生长和代谢产生一定的抑制作用。因为在细胞生长代谢旺盛期，随着 细胞浓度的增大，细胞代谢出的二氧化碳会大幅度增多，导致培养液中溶解的二氧化碳 浓度升高。同时随着发酵罐体积的增大，发酵罐内静压强的升高，也会增大培养液中二 氧化碳的浓度。因此，正确的测定二氧化碳对微生物生长代谢过程的抑制作用，对于大 型发酵罐的设计以及消除和避免工业发酵工程中二氧化碳产生的不良影响都具有重要 意义。

目前常用的测定二氧化碳对微生物生长和产物代谢的抑制作用的方法有两种：一是 在发酵过程的进气中连续加入一定浓度的二氧化碳，考察不同浓度二氧化碳对微生物生 长代谢的影响(连续通入法)；二是在发酵过程的某一段时间内加入一定浓度的二氧化 碳(脉冲法)，来考察二氧化碳的抑制作用。事实上细胞仅在生长代谢的旺盛期才有大 量二氧化碳生成排出。前一种方法在发酵的初期就加入一定量的二氧化碳，与实际发酵 过程很不相符，容易导致对二氧化碳抑制作用的测量评估过高；第二种方法有效地克服 了第一种方法中的缺点，可以利用调节二氧化碳脉冲的浓度、二氧化碳的加入时机和持 续时间，在不同的发酵时期通入不等量的二氧化碳。但测试过程中二氧化碳脉冲浓度高 低和持续时间长短难以准确确定。同时，这两种方法在测试中所使用的二氧化碳都是人 为的从外界加入的，并非微生物生长代谢过程所产生的，就难免会导致过高地估计二氧 化碳的抑制作用。

因此，针对大规模工业化的微生物高密度发酵，仍需要更有效地测量发酵过程中自 生二氧化碳对微生物生长及产物代谢抑制作用的方法。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种不需要从外界通入二氧化碳，而是利用发酵 过程微生物自身代谢产生的二氧化碳来正确测量评估高密度发酵过程中二氧化碳对微 生物生长及代谢抑制作用的测量方法，该方法能有效地避免因人为地通入外界产生的二 氧化碳而过高估计二氧化碳抑制作用，使整个测量过程更接近实际发酵过程、测量结果 更可靠。

本发明所采用的技术方案为：

一种高密度发酵过程中二氧化碳对微生物生长及代谢抑制作用测量方法，该方法利 用发酵过程中微生物自身代谢产生的二氧化碳来测试二氧化碳对微生物生长及代谢抑 制作用，而不需要将外界二氧化碳通入发酵体系中。

所述测量方法包括以下步骤：

(1)参照发酵：在微生物发酵过程中，给发酵罐连续通入1.0～2.0vvm的含氧气体， 给微生物生长及代谢提供充足的氧气，使发酵液中溶氧浓度大于30％，检测发酵过程中 发酵罐出口二氧化碳浓度、发酵罐内微生物细胞浓度、微生物代谢产物浓度；

(2)测试发酵：微生物发酵的其它条件同参照发酵，只是改变通入发酵罐的含氧 气体量为参照发酵中通入含氧气体量的50％～150％，检测发酵过程中发酵罐出口二氧化 碳浓度、发酵罐内微生物细胞浓度、微生物代谢产物浓度；

(3)比较参照发酵过程和测试发酵过程中发酵罐出口二氧化碳浓度、发酵罐内微 生物细胞浓度、微生物代谢产物浓度的差异，而发酵液中溶解的二氧化碳浓度与发酵罐 出口气相中的二氧化碳浓度成正比，即可得到高密度发酵过程中二氧化碳对微生物生长 及代谢抑制作用的评估。

与现有技术相比，本发明具有以下显著优点和有益效果：本发明提出的高密度发酵 过程中二氧化碳对微生物生长及代谢抑制作用的测量方法，利用发酵过程微生物自身代 谢产生的二氧化碳，不需要从外界加入二氧化碳，而是通过改变发酵过程中通入气体的 流量来改变排出气体中二氧化碳的浓度，从而将细胞置于不同浓度的二氧化碳环境里， 检测二氧化碳对发酵过程微生物生长及其代谢产物的抑制作用，能有效地避免因人为地 通入外界产生的二氧化碳而过高估计二氧化碳抑制作用，使整个测量过程更接近实际发 酵过程、测量结果更可靠。

附图说明

图1所示的是本发明实施例的参照发酵中发酵罐出口二氧化碳浓度、发酵罐内微生 物细胞浓度、微生物代谢产物浓度随发酵过程的变化情况图；

图2所示的是本发明实施例的测试发酵I中发酵罐出口二氧化碳浓度、发酵罐内微 生物细胞浓度、微生物代谢产物浓度随发酵过程的变化情况图。

具体实施方式

以下结合实施例对本发明作进一步具体描述，但不局限于此。

本实施例以5升发酵罐内Ralstonia eutropha高密度发酵合成聚羟基丁酸酯(PHB) 为例，具体说明本发明。

菌种：Ralstonia eutropha NCIMB11599，购于英国菌种保藏中心。

培养基：种子培养液和发酵液的组成如下：

附：微量元素溶液每升含有10g FeSO₄(7H₂O)，2.25g ZnSO₄(7H₂O)，1.2g CuSO4(5H₂O)，0.5g MnSO₄(5H₂O)，2g CaCl₂(2H₂O)，0.25g Na₂B₄O₇(7H₂O)，0.12g(NH₄)₆Mo₇O₂₄，10ml 35％ HCl。

分析测试方法：发酵罐内微生物细胞浓度的测量方法为发酵过程中取出2毫升发酵 液，经过离心、洗涤、再离心后，在105℃下将细胞干燥至恒重，称其重量计算出细胞 浓度(干细胞重量/每升发酵液)；微生物代谢产物聚羟基丁酸酯的浓度通过气相色谱 (Varian3300，美国)以苯甲酸为内标物测量得到；发酵罐出口气体中二氧化碳的浓度 由气体分析仪(LKM2000-03，韩国LOKAS公司)在线测定；发酵液中葡萄糖浓度由 葡萄糖分析控制仪(Model 273，Yellow Springs Instruments，美国)在线分析并控制在 9g/L。

发酵过程控制及结果：

(1)参照发酵：在5L发酵罐中装入1.5L培养基进行流加补料式发酵培养Ralstonia eutropha合成聚羟基丁酸酯，其发酵温度控制为30℃，利用氨水溶液将pH控制为6.7。 发酵过程依据在线检测信号自动流加葡萄糖并使其浓度维持在9.0g/L左右。将氧气钢瓶 出来的氧气(工业级99％)以1.0vvm的流量通入发酵罐，通过调节搅拌转速(100～900 转/分)，以维持发酵罐内发酵液中氧的浓度高于同温同压下空气中的氧气在初始培养液 中溶解度的30％；从发酵罐出口排出的气体经过气体分析仪在线检测气体中二氧化碳的 浓度后排出。图1给出了发酵过程R.eutropha的生长和代谢产物PHB累积以及排出气 体中二氧化碳浓度随发酵过程的变化情况，可以看出发酵进行到20小时时二氧化碳浓 度达到最高值15％，然后慢慢降低，从发酵30小时到发酵结束二氧化碳浓度一直在10％ 左右，经过45小时发酵结束时，发酵罐内微生物细胞浓度(DCW)和聚羟基丁酸酯(PHB) 的浓度分别为2089g/L和139g/L。

(2)测试发酵I：微生物发酵的其它条件同参照发酵，只是改变通入发酵罐的含氧 气体量为参照发酵中通入含氧气体量的50％，即仅将氧气钢瓶出来通入发酵罐的氧气 (工业级99％)流量控制为0.5vvm。图2给出了发酵过程中R.eutropha的生长和产物 PHB累积以及排出气体中二氧化碳浓度随时间的变化情况，可以看出发酵过程中二氧化 碳的最高浓度高达30.2％，而且持续了8小时之久，在发酵结束前的十小时内，二氧化 碳浓度也高达22％，经过45小时发酵结束时，最终DCW和PHB的浓度降低到了169g/L 和97g/L。

(3)测试发酵II：微生物发酵的其它条件同参照发酵，只是改变通入发酵罐的含 氧气体量为参照发酵中通入含氧气体量的80％，即仅将氧气钢瓶出来通入发酵罐的氧气 (工业级99％)流量控制为0.8vvm。经过45小时发酵结束时，最终DCW和PHB的浓 度分别为196g/L和131g/L。

(4)测试发酵III：微生物发酵的其它条件同参照发酵，只是改变通入发酵罐的含 氧气体量为参照发酵中通入含氧气体量的150％，即仅将氧气钢瓶出来通入发酵罐的氧 气(工业级99％)流量控制为1.5vvm。经过45小时发酵结束时，最终DCW和PHB的 浓度分别为210g/L和138g/L。

表1 汇总了上述参照发酵和测试发酵I、II、III的结果。

由表1可以看出，与参照发酵对比，将通气量提高到1.5vvm，发酵罐排出气体中二 氧化碳的最高浓度为10.6％，发酵终了时DCW和PHB浓度分别为210g/L和138g/L， 虽然发酵罐出口排出气体中二氧化碳浓度降低了，但最终微生物细胞浓度和产物PHB 的浓度基本一致，说明发酵罐出口气体中二氧化碳的浓度为15％及以下时不会对 R.eutropha的生长和PHB合成产生大的影响。

而当通气流量为0.8和0.5vvm时，发酵过程中二氧化碳的最高浓度分别为18.6％和 30.2％，特别是通气流量为0.5vvm时，有12小时的时间内二氧化碳浓度均高于25％， 其后的13小时内二氧化碳浓度也一直在22％以上，如此长时间地高浓度的二氧化碳使 最终DCW和PHB浓度分别仅降低了19％和30％。

实施例所用的原料，除另有说明外，均为市售工业品。

本发明的上述实施例是对本发明的说明而不能用于限制本发明，与本发明的权利要 求书相当的含义和范围内的任何改变，都应认为是包括在权利要求书的范围内。