具有黏附拮抗活性的拟态弧菌OmpU黏附素蛋白结合肽、多肽组合物及其应用

技术领域

本发明涉及多肽、多肽组合物及其应用，尤其涉及具有黏附拮抗活性的 拟态弧菌OmpU黏附素蛋白结合肽、多肽组合物及其应用。

背景技术

拟态弧菌(Vibriomimicus)是水产养殖生产中常见的一种肠道病原菌， 主要经肠黏膜感染引起鱼类腹水病，严重威胁水产养殖业的健康发展。目前 控制鱼类腹水病的主要手段是抗菌治疗，但是随着抗菌药物的长期使用，细 菌产生耐药性，不仅导致治疗效果不明显，而且影响水产品质量，还存在公 共卫生隐患。因此，亟需研发不产生耐药性的新型抗拟态弧菌感染的药物。

发明内容

本发明的目的是克服现有技术的不足，提供了具有黏附拮抗活性的拟态 弧菌OmpU黏附素蛋白结合肽以及多肽组合物，并利用该结合肽和多肽组合 物能与OmpU黏附素蛋白发生特异性结合，从而有效地抑制拟态弧菌通过该 黏附素黏附定植于肠黏膜表面，进而达到消减拟态弧菌毒力的作用。

为达到上述目的，本发明采用的技术方案之一如下：

一种具有黏附拮抗活性的拟态弧菌OmpU黏附素蛋白结合肽，本拟态弧 菌OmpU黏附素蛋白结合肽由下述氨基酸序列SEQIDNO:1组成：

Asn-Cys-Thr-Asp-Lys-Leu-Cys-Leu-Leu-Pro-Pro-Val。

本发明还保护上述制备的具有黏附拮抗活性的拟态弧菌OmpU黏附素蛋 白结合肽在制备拟态弧菌黏附拮抗剂中的应用。

进一步的，由具有黏附拮抗活性的拟态弧菌OmpU黏附素蛋白结合肽制 备的拟态弧菌黏附拮抗剂应用于拮抗拟态弧菌黏附，该鲤鱼上皮瘤细胞即 EPC细胞，是一种黏附模式细胞。

进一步的，由具有黏附拮抗活性的拟态弧菌OmpU黏附素蛋白结合肽制 备的拟态弧菌黏附拮抗剂应用于防治草鱼腹水病。

本发明采用的技术方案之二如下：

一种具有黏附拮抗活性的拟态弧菌OmpU黏附素蛋白结合肽的组合物， 本组合物由如下三种多肽组成：

1)SEQIDNO:1

Asn-Cys-Thr-Asp-Lys-Leu-Cys-Leu-Leu-Pro-Pro-Val；

2)SEQIDNO:2

Thr-Trp-Thr-Cys-Ser-Asp-Val-Ile-Cys-Thr-Ala-Arg；

3)SEQIDNO:3

Ser-Cys-Thr-Ser-Pro-His-Cys-Phe-Met-Trp-Leu-Pro；

SEQIDNO:1所示多肽、SEQIDNO:2所示多肽、SEQIDNO:3所示多肽 三者的质量配比为1:1:1。

本发明还保护上述制备的具有黏附拮抗活性的拟态弧菌OmpU黏附素蛋 白结合肽的组合物在制备拟态弧菌黏附拮抗剂中的应用。

进一步的，由具有黏附拮抗活性的拟态弧菌OmpU黏附素蛋白结合肽组 合物制备的拟态弧菌黏附拮抗剂应用于拮抗拟态弧菌黏附鲤鱼上皮瘤细胞。

进一步的，由具有黏附拮抗活性的拟态弧菌OmpU黏附素蛋白结合肽组 合物制备的拟态弧菌黏附拮抗剂应用于防治草鱼腹水病。

本发明与现有技术相比，具有如下优点和有益效果：

1)、作为一种肠道病原菌，拟态弧菌通过黏附素黏附定植于肠黏膜表面 是引发感染的关键起始环节。外膜蛋白U(OutermembraneproteinU，OmpU) 是拟态弧菌的重要黏附素蛋白，也是抗拟态弧菌毒力的潜在药物作用靶点。 本发明提供了具有黏附拮抗活性的OmpU黏附素蛋白结合肽及其多肽组合物， 此具有黏附拮抗活性的OmpU黏附素蛋白结合肽及其多肽组合物不但可与 OmpU黏附素蛋白发生特异性结合，而且能够有效地抑制拟态弧菌通过该黏附 素黏附定植于肠黏膜表面，进而达到消减拟态弧菌毒力的作用。

进而，由具有黏附拮抗活性的OmpU黏附素蛋白结合肽及其多肽组合物 制成的黏附拮抗剂，能够有效地防治拟态弧菌引起的鱼类腹水病。

2)、近年来，生物肽库技术的建立与完善为研究生物活性肽提供了有效 手段。噬菌体随机肽库是将大量外源多肽基因与噬菌体衣壳蛋白pIII融合 表达并展示在噬菌体表面形成的巨大随机肽库，被展示的多肽保持着相对独 立的空间结构和生物活性。利用目标靶分子与展示多肽间的特异性亲和力， 即可将感兴趣的蛋白或多肽从噬菌体随机肽库中筛选出来，并且在得到目标 多肽氨基酸序列的同时获得其编码基因。与其他肽库技术相比，噬菌体随机 肽库技术具有快捷、高通量、多肽表型与基因型一致等特点，已被广泛应用 于抗原表位分析、功能性短肽和肽类药物筛选、蛋白质互作位点分析等研究 领域。

本发明中提供了三种能与拟态弧菌OmpU黏附素蛋白特异性结合的多肽 (均为十二肽)，三种多肽的氨基酸序列分别如序列表中的SEQIDNO:1、 SEQIDNO:2和SEQIDNO:3所示。采用的技术方案是选择噬菌体随机十二肽库， 以拟态弧菌OmpU黏附素蛋白为靶标，通过亲和淘选方法从中筛选出3个与 OmpU黏附素蛋白结合的阳性噬菌体克隆，经间接ELISA法和竞争抑制ELISA 法确定该3个阳性噬菌体克隆表面展示的三种OmpU黏附素蛋白结合肽均可 与OmpU黏附素蛋白发生特异性结合。

本发明提供的三种OmpU黏附素蛋白结合肽均具有黏附拮抗活性，能够 阻断或抑制OmpU黏附素蛋白黏附EPC细胞，也能抑制拟态弧菌黏附EPC细 胞，三种多肽(SEQIDNO:1、SEQIDNO:2和SEQIDNO:3)对拟态弧菌的平均黏 附抑制率分别为92.8±1.97％、83.2±4.03％和74.5±3.25％。采用的技术方 案是选择EPC细胞作为细胞黏附模型，以兔抗rOmpU纯化抗体(本实验室制 备)为一抗，FITC标记羊抗兔IgG(商品化购买)为二抗，利用细胞免疫荧 光技术证实SEQIDNO:1结合肽能够阻断OmpU黏附素蛋白与EPC细胞结合， SEQIDNO:2和SEQIDNO:3结合肽能够明显抑制OmpU黏附素蛋白与EPC细胞结 合。同时通过肽黏附抑制试验证实三条结合肽能够显著抑制拟态弧菌对EPC 细胞的黏附。

本发明提供的三种OmpU黏附素蛋白结合肽与OmpU黏附素蛋白的亲和力 强，通过非竞争ELISA法(Beatty法)测得三种多肽(SEQIDNO:1、SEQIDNO:2 和SEQIDNO:3)的亲和常数分别为(1.24±0.56)×10⁹L/moL(P1)、(6.17 ±0.19)×10⁸L/moL(P2)和(6.15±0.71)×10⁸L/moL(P3)。

3)、本发明中的三种多肽(SEQIDNO:1、SEQIDNO:2和SEQIDNO:3)均可 通过常规技术如化学合成、基因克隆表达等方法制备。用医药领域常用的纳 微球材料(明胶、羟基磷灰石、聚乳酸、壳聚糖、海藻酸等)包裹其中一种 多肽或三种多肽即多肽组合物而制成的口服黏附拮抗剂，均可用于由拟态弧 菌感染引起的鱼类腹水病的防治，因此本发明为鱼类腹水病的防治提供了新 途径，具有良好的应用前景。

附图说明

图1为间接ELISA初步鉴定与OmpU黏附素蛋白特异性结合的阳性噬菌 体克隆。图1中有10个克隆，分别命名为P1、P2、P3、P4、P5、P6、P7、 P8、P9和P10。

图2a、2b分别为竞争抑制ELISA进一步鉴定与OmpU黏附素蛋白特异性 结合的阳性噬菌体克隆。

图3为结合肽对OmpU黏附素蛋白黏附EPC细胞的拮抗作用。

图4为结合肽对拟态弧菌黏附EPC细胞的拮抗作用。

图5a、5b、5c分别为黏附拮抗肽P1、P2、P3与OmpU黏附素蛋白的结 合反应曲线。

具体实施方式

为了便于理解,以下将通过具体的实施例和附图对本发明进行详细地描 述。需特别指出的是，这些描述仅仅是示例性的描述，并不构成对本发明范 围的限制。

下述说明中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；实验方法中 的所述试剂和生物材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得。

下述说明中的百分含量，如无特别说明，均为质量百分含量。

下述说明中的比例，如无特别说明，均为体积比例。

1.拟态弧菌OmpU黏附素蛋白结合肽的亲和淘选与鉴定

1.1亲和淘选

用包被液(pH8.6，0.1mol/L的NaHCO₃溶液)分别将纯化后的带有His 标签分子的重组OmpU蛋白(即rOmpU蛋白)和His标签蛋白(均为本实验 室通过基因工程技术表达和纯化后获得)稀释为100μg/mL，包被酶标板， 每种蛋白重复4孔，100μL/孔，置4℃过夜；次日弃包被液，每孔加200μL 的5％BSA(牛血清白蛋白)，37℃封闭1h；倒掉封闭液，用TBST溶液 (TBS+0.5％Tween-20)洗涤6次。用TBST稀释噬菌体随机十二肽库(购自 美国NEB公司)至1.0×10¹³PFU/mL，取稀释后的肽库液100μL加到包被有 His标签蛋白的酶标板孔内，重复4孔，室温振荡60min，吸出孔内未与His 标签蛋白结合的噬菌体液体作为预筛选液。用His标签蛋白预筛选的目的是 排除rOmpU蛋白中标签分子的干扰，提高筛选的特异性。

将100μL预筛选液加到包被有rOmpU蛋白的酶标板孔内，重复4孔， 室温振荡60min，弃孔内液体，TBST洗涤6次。每孔加入100μL洗脱缓冲 液(pH2.2，0.2mol/L的甘氨酸-HCl)，室温振荡10min，吸出洗脱液至离心 管中，加入1mol/L的Tris-HCl(pH9.1)中和洗脱液。收集洗脱液，取2μL 测定噬菌体滴度测定，其余的噬菌体侵染ER2738宿主菌，扩增并用PEG(聚 乙二醇)提取噬菌体，用于下一轮亲和淘选，共进行四轮亲和淘选。在四轮 亲和淘选中，逐轮降低靶标分子的浓度及其与肽库作用时间，增加洗涤液中 Tween-20浓度和洗涤次数，以便得到亲和力高、特异性强的噬菌体克隆。结 果经四轮筛选后，噬菌体的回收率逐步上升，特异性噬菌体克隆得到较高程 度的富集，最后一轮噬菌体富集倍数高达1538倍。

1.2与OmpU黏附素蛋白特异性结合的阳性噬菌体克隆鉴定

为了获得能与OmpU黏附素蛋白特异性结合的阳性噬菌体克隆，随机挑 取20个噬菌体单克隆进行间接ELISA法初步鉴定。即用浓度为100μg/mL 的rOmpU蛋白包被酶标板，100μL/孔，4℃过夜。次日弃包被液，每孔加入 200μL的5％BSA，37℃封闭1h；倒掉封闭液，用TBST溶液洗涤6次。加入 待检噬菌体克隆，10⁸PFU/孔，每个克隆做3个重复，37℃作用2h，实验中 设置空白对照(用PBS代替待检噬菌体克隆)和阴性对照(加原肽库中的M13 噬菌体)。TBST洗涤6次，加入1:5000HRP标记鼠抗-M13抗体，200μL/孔， 37℃作用1h。此后按洗涤、显色、终止、测定OD_492nm的常规方法操作。结果 如图1所示，检测的20个噬菌体克隆中有10个克隆(分别命名为P1、P2、 P3、P4、P5、P6、P7、P8、P9和P10克隆)的平均OD_492nm值大于阴性对照平 均OD_492nm值的2.1倍，初步确定为阳性噬菌体克隆。

采用竞争抑制ELISA法对上述10个初筛阳性噬菌体克隆进一步鉴定。 分别用浓度为25μg/mL的rOmpU蛋白及His标签蛋白(以排除His标签蛋 白的影响)包被酶标板，100μL/孔，每个待鉴定克隆包被一排酶标孔，4℃ 过夜。次日弃包被液，封闭、洗涤同上。分别将不同浓度(即浓度分别为 6.25μg/mL、12.5μg/mL、25μg/mL、50μg/mL、100μg/mL、200μg/mL) 的竞争物(包括rOmpU蛋白及His标签蛋白)分别与上述10个初筛阳性噬 菌体克隆等体积混合，37℃作用10min，取混合液分别加到相应的已包被 rOmpU蛋白或His标签蛋白的酶标孔中，100μL/孔，37℃作用1h，TBST洗 涤6次，余下步骤同上。试验中同时做未加竞争物的初筛阳性噬菌体克隆对 照(即用PBS代替竞争物与噬菌体克隆等体积混合)。

根据公式计算抑制率，计算公式为：抑制率(％)＝(未抑制OD_492nm值－ 抑制后OD_492nm值)/未抑制OD_492nm值×100％。结果如图2所示，随着游离rOmpU 竞争蛋白浓度的增加，其对P1、P2和P3三个噬菌体克隆的竞争抑制率逐渐 增加，当游离rOmpU竞争蛋白的浓度为200μg/mL时，对3个噬菌体克隆的 竞争抑制率分别为70.0％、68.8％和65.8％，均大于50％，而相同浓度的游离 His标签蛋白竞争物对上述3个噬菌体克隆的抑制率均低于20％，从而排除 了标签蛋白的干扰。结果表明游离rOmpU蛋白能抑制P1、P2和P3三个噬菌 体克隆与固相包被的rOmpU蛋白结合。说明这三个噬菌体克隆为阳性噬菌体 克隆。

1.3阳性噬菌体克隆表面展示的OmpU黏附素蛋白结合肽的序列测定

使用噬菌体DNA单链提取试剂盒(购自美国Omega公司)提取阳性噬菌 体克隆的单链DNA，具体操作按照说明书进行。提取的单链DNA样品委托上 海生物工程技术有限公司测序。对测序结果进行比对分析，获得阳性噬菌体 克隆表面展示的与OmpU黏附素蛋白特异性结合的多肽(均为十二肽)，其氨 基酸序列(SEQIDNO:1、SEQIDNO:2和SEQIDNO:3)如表1所示。

表1OmpU黏附素蛋白结合肽的氨基酸序列

结论：利用噬菌体随机十二肽库筛选到3条能与OmpU黏附素蛋白特异 性结合的多肽。

2.具有黏附拮抗活性的OmpU黏附素蛋白结合肽的确定

由于噬菌体表面展示多肽与OmpU黏附素蛋白的结合位点不一定恰是该 蛋白的黏附功能域，故通过噬菌体随机十二肽库技术筛选出来的3条OmpU 黏附素蛋白结合肽不一定具有黏附拮抗活性。对此，本发明又进一步确定具 有黏附拮抗活性的OmpU黏附素蛋白结合肽。

2.1OmpU黏附素蛋白结合肽的合成

委托上海淘普技术有限公司采用固相合成法合成上述3条OmpU黏附素 蛋白结合肽和1条OmpU蛋白信号肽(作为无关对照肽，其系列为 ALAVSAAAVATG)，要求合成肽的纯度大于98％。

2.2结合肽对OmpU黏附素蛋白黏附细胞的拮抗作用检测

以鲤鱼上皮瘤细胞(EPC)为细胞黏附模型，采用细胞免疫荧光技术检 测结合肽是否具有拮抗OmpU蛋白黏附细胞的作用。用预先放有细胞爬片的24 孔细胞板培养EPC细胞，待细胞贴壁并形成单层后弃去培养液，PBS漂洗3次， 依次加入4％多聚甲醛固定15min、1％TritionX-100作用15min(目的是增加细 胞壁通透性)和2％BSA封闭1h，各步骤之间均用PBS漂洗3次。尔后，将浓度 均为1mg/mL的3条OmpU黏附素蛋白结合肽和1条无关对照肽分别与相同浓度 的rOmpU蛋白等体积(各150μL)混合，37℃孵育1h后加入细胞孔，300μL/孔， 每一样品重复3孔，细胞板于28℃孵育1h，PBS漂洗3次，加入1:200稀释的兔 抗rOmpU纯化抗体(本实验室制备)，28℃孵育1h，漂洗后，再加入1:100稀 释的FITC标记羊抗兔IgG，28℃避光孵育1h，洗涤后，每孔加入50μL细胞核 染色液(DAPI)，避光染色10min，漂洗、干燥后，倒置荧光显微镜观察rOmpU 蛋白与EPC细胞结合状况，试验中同时做rOmpU蛋白黏附对照组和细胞对照 组。结果如图3所示，细胞对照组的EPC细胞表面未见到绿色荧光，仅细胞核 被染成蓝色；rOmpU蛋白黏附对照组EPC细胞以及经无关对照肽与rOmpU蛋白 混合液共孵育的EPC细胞表面均出现明显的绿色荧光，细胞核被染成蓝色； 经结合肽P1和rOmpU蛋白混合液共孵育的EPC细胞表面无绿色荧光，仅细胞核 被染成蓝色；经结合肽P2或P3与rOmpU蛋白混合液共孵育的EPC细胞表面有很 少量的绿色荧光，细胞核被染成蓝色。表明表1中的结合肽P1能够完全阻断 rOmpU蛋白与EPC细胞的特异性结合，结合肽P2和P3能够明显抑制rOmpU蛋白 与EPC细胞的特异性结合。

2.3结合肽对拟态弧菌黏附细胞的拮抗作用检测

以EPC为细胞黏附模型，采用肽黏附抑制试验检测结合肽是否具有抑制 拟态弧菌黏附细胞的作用。将浓度均为1mg/mL的3条结合肽及1条无关对照肽 分别与浓度为2×10⁷CFU/mL的拟态弧菌04-14分离株菌悬液等体积混合，37℃ 轻摇孵育60min，将混合液加到EPC单层细胞中，500μL/孔，重复3孔，28℃ 孵育60min，漂洗后，甲醇/冰乙酸固定细胞，结晶紫染色，油镜下随机选择 30个细胞，计数细菌黏附数量，计算平均每个细胞表面或四周的黏附菌数， 试验中同时做细胞对照和细菌黏附对照。结果如图4所示，细胞对照组的EPC 细胞形态完好，无细菌黏附；未经预处理的拟态弧菌04-14分离株以及经无 关对照肽预处理的04-14分离株均能以聚集性方式良好地黏附细胞周围，每 个细胞的平均黏附数分别为20.4±1.50和20.0±0.83；而经结合肽P1、P2和 P3预处理后的拟态弧菌04-14分离株对EPC细胞的黏附力均显著下降，每个细 胞的平均黏附数分别为1.7±0.42、3.4±0.83和5.1±0.67，平均黏附抑制 率分别为92.8±1.97％、83.2±4.03％和74.5±3.25％。

结论：通过细胞免疫荧光技术结合肽黏附抑制试验确定表1中的P1、P2 和P3三条OmpU黏附素蛋白结合肽具有黏附拮抗活性，我们将此三条肽简称 为黏附拮抗肽。

3.黏附拮抗肽的亲和常数测定

黏附拮抗肽与黏附素蛋白间的亲和力越强，其黏附拮抗活性越大，而亲 和力的强弱是由亲和常数K值的大小来决定的。因此，本发明采用非竞争 ELISA法(又称Beatty法)测定表1中的P1、P2和P3三条黏附拮抗肽的亲 和常数。

3.1黏附拮抗肽与rOmpU黏附素蛋白的结合反应曲线绘制

将3条黏附拮抗肽稀释为20μg/mL、10μg/mL、5μg/mL和2.5μg/mL4 个浓度，并横向包被酶标板，100μL/孔，4℃过夜。次日弃包被液，每孔加 入200μL5％BSA，37℃封闭2h；倒掉封闭液，用TBST液洗涤6次。将rOmpU 纯化蛋白稀释为51.2μg/mL、12.8μg/mL、3.2μg/mL、0.8μg/mL和 0.2μg/mL5个浓度，并纵行加至酶标孔，100μL/孔，37℃作用2h，TBST 液洗涤6次。此后，依次加入兔抗rOmpU蛋白抗体、HRP标记的羊抗兔IgG 抗体、底物液、终止液，各步骤之间均用TBST液洗涤6次，最后测定OD₄₉₂nm 值。以OD₄₉₂nm值为纵座标，rOmpU纯化蛋白浓度为横座标，绘制出黏附拮抗 肽在不同浓度下与OmpU黏附素蛋白的结合反应曲线(图5)。

3.2黏附拮抗肽的亲和常数计算

通过数学软件MATLAB7.0对3条黏附拮抗肽在不同浓度下与OmpU黏附素 蛋白的结合反应曲线进行模拟分析，推导出相应的曲线方程。由曲线方程求 出50％OD₄₉₂nm值处对应的rOmpU蛋白浓度，代入亲和常数公式K＝(n－1)/2 (nAb'－Ab)，计算K值。公式中Ab'和Ab分别表示当黏附拮抗肽浓度为P'和 P时，产生半数吸光值的rOmpU蛋白浓度，n＝P/P'(黏附拮抗肽浓度之比)。 试验中设置了4个黏附拮抗肽浓度(2.5、5、10和20μg/mL)，将不同浓度黏 附拮抗肽进行两两比较，当n＝2时，可得3个K值，n＝4时可得2个K值，n＝8 时可得1个K值，求出这6个K值的平均值即为黏附拮抗肽的亲和常数。本发明 测得3条黏附拮抗肽(P1、P2和P3)的亲和常数分别为(1.24±0.56) ×10⁹L/moL、(6.17±0.19)×10⁸L/moL和(6.15±0.71)×10⁸L/moL。多因 素方差分析显示，表1中黏附拮抗肽P1的亲和常数显著高于P2和P3(p＜ 0.05)，但后两者间无明显差异(p＞0.05)。

结论：3条黏附拮抗肽与OmpU黏附素蛋白的亲和力强，且黏附拮抗肽P1 的亲和力显著高于P2和P3，后两者间无明显差异。

4.黏附拮抗肽对拟态弧菌感染草鱼的治疗试验

拟态弧菌04-14分离株是从患腹水病草鱼体内分离到的一株毒力较强的 肠道病原菌。浸泡感染方式可以最大程度模拟养殖鱼类在自然条件下的发病 环境和发病过程，使实验结果较为准确。故本发明在建立拟态弧菌浸泡感染 草鱼模型的基础上测试黏附拮抗肽对发病草鱼的治疗效果。

4.1拟态弧菌浸泡感染草鱼模型的建立

健康实验草鱼(50g/尾)随机分成4组，每组15尾，分别养殖于4个 水簇箱(50cm×30cm×44cm)。养殖用水为循环水，水温25±1℃，空气湿度 为50-60％，实验期间水簇箱保持充氧，每天早晚各投喂饲料1次，投喂量为 草鱼体重的3％，适应性饲养10天，确认草鱼健康后用于试验。1-3组实验 草鱼分别浸泡于浓度为10⁸CFU/mL、5×10⁷CFU/mL和2.5×10⁷CFU/mL的拟 态弧菌04-14分离株菌液中，浸泡时间为5h，第4组草鱼则于培养基稀释液 中浸泡5h作为对照，然后4组草鱼分别转入4个水簇箱中正常饲养14天， 记录草鱼发病、死亡情况，对病死鱼进行解剖，分离细菌，确定死因。结果 发现，浸泡感染后12h内，实验鱼分散于水体中正常游动，无明显变化；24h 后实验鱼陆续出现不同程度的临床症状，主要表现为食欲减退，反应迟钝， 长时间静止于水面或水底，而对照组鱼未见任何异常。细菌浓度为10⁸CFU/mL 的感染组草鱼72h全部死亡，细菌浓度为5×10⁷CFU/mL的感染组草鱼96h 全部死亡，浓度为2.5×10⁷CFU/mL的感染组草鱼5天后死亡6尾，14天后 仍有9尾存活。死亡草鱼出现腹水病典型病变，表现为鳞片部分脱落，鳍基 部出血，腹部明显肿胀，腹腔积液严重，肝脏肿大并伴有少量糜烂，颜色变 黄。从所有死亡草鱼的肝脏中均能分离出大量细菌，其形态染色特性和菌落 特征均与拟态弧菌04-14分离株一致。说明浸泡感染方式下，拟态弧菌对草 鱼的最小致死剂量为5×10⁷CFU/mL。

4.2草鱼腹腔注射黏附拮抗肽的急性毒性实验

将人工合成的纯度大于98％的3条黏附拮抗肽(即表1中的P1、P2、P3) 和1条无关对照肽干粉分别用无菌生理盐水进行溶解，使其浓度均为 20mg/mL。选取体重为50g的健康草鱼随机分成5组，10尾/组，1-4组实验 鱼分别腹腔注射黏附拮抗肽P1、P2、P3和无关对照肽溶液，注射剂量为 100mg/kg体重(5倍治疗量)，即每尾鱼注射浓度为20mg/mL的黏附拮抗肽 或无关对照肽0.25mL。第5组实验鱼腹腔注射多肽组合物，即取相同浓度 (20mg/mL)的P1、P2和P3黏附拮抗肽按1:1:1等体积混合，每尾鱼注射 0.25mL，总剂量也为100mg/kg体重。注射后5组实验草鱼分别转入5个水 簇箱中正常饲养，观察草鱼发病和死亡情况。结果发现，注射后第一天各组 草鱼采食及活动明显减少，但第二天全部恢复正常，观察至14天仍无草鱼 死亡。说明黏附拮抗肽、多肽组合物和对照肽对草鱼均无毒性。

4.3黏附拮抗肽对发病草鱼的治疗试验

将人工合成的纯度大于98％的3条黏附拮抗肽(即表1中的P1、P2、P3) 和1条无关对照肽干粉分别用无菌生理盐水进行溶解，使其浓度均为4mg/mL。 另外，取相同浓度(4mg/mL)的P1、P2和P3黏附拮抗肽按1:1:1等体积混合 制成多肽组合物。选取体重为50g的健康草鱼随机分成7组，10尾/组。7组 试验草鱼分别浸泡于浓度为5×10⁷CFU/mL的拟态弧菌菌液中5h，然后分别转 入7个水簇箱中正常饲养。待感染后24h草鱼刚出现症状时，1-5实验组草鱼 分别腹腔注射黏附拮抗肽P1、P2、P3以及多肽组合物和无关对照肽进行治疗， 治疗剂量均为20mg/kg体重/次，1次/天，连用5天；第6组实验草鱼腹腔注射 庆大霉素(药敏实验结果显示拟态弧菌对该抗生素敏感)，剂量为20万单位 /kg体重/次，1次/天，连用5天；第7组实验草鱼腹腔注射无菌生理盐水作为 感染对照。停药后继续饲养7天，观察草鱼发病、死亡和存活情况，对病死 鱼进行解剖，分离细菌，确定死因。结果如表2所示，感染对照组和无关对 照肽治疗组草鱼全部死亡，剖检变化呈典型腹水病病变，并从死鱼肝脏中分 离到拟态弧菌04-14分离株。与感染后未治疗组相比，黏附拮抗肽治疗组、 多肽组合物治疗组和庆大霉素治疗组发病草鱼的死亡时间推后，感染后48h 或72h开始死亡，病死率下降，15天后的存活率分别为60％(P1和庆大霉素治 疗组)、30％(P2和P3治疗组)和70％(多肽组合物治疗组)。

表2黏附拮抗肽对草鱼腹水病的治疗效果

结论：3条黏附拮抗肽对草鱼腹水病均有治疗作用，多肽组合物的治疗 效果好于单一黏附拮抗肽和庆大霉素，黏附拮抗肽P1的治疗效果与庆大霉 素相当，且好于P2和P3。