抗鹅CD8α链胞外区单克隆抗体及其在检测禽类外周血中CD8+T淋巴细胞中的应用

技术领域

本发明涉及一种单克隆抗体及其应用，特别涉及一种抗鹅CD8α链胞外区80-160aa单克隆抗体及其在检测鹅外周血中CD8⁺T淋巴细胞中的应用，本发明属于生物技术领域。

背景技术

白细胞分化抗原是白细胞在分化的不同阶段、成熟为不同谱系及活化的过程中出现或消失的细胞表面分子，其具有种类繁多，分布广泛等特点，在免疫应答的产生中发挥重要作用，与机体重要的生理及病理过程相关。T细胞发育的不同时期，细胞表达不同的分化抗原。T细胞根据其功能不同可分为不同的的亚群，包括细胞毒性T细胞(cytotoxic T cell,TC)，辅助性T细胞(helper T cell,TH)及抑制性T细胞(suppressor T cell,TS)等，这是根据T细胞表面分化抗原和功能的不同决定的。

CD8分子是细胞表面Ⅰ型跨膜糖蛋白，也是T淋巴细胞的表面标志，作为TCR的辅受体，参与对MHC Ⅰ分子递呈抗原的识别。CD8通常由αα同型二聚体或αβ异型二聚体构成(分别由紧密相连的CD8α和CD8β1基因编码)。CD8α链对CD8分子行使生物学功能至关重要，而β链的存在则起到了辅助作用。其分子量大约为26.36KDa，成熟蛋由约为24.1KDa。CD8的α链由信号肽区、胞外区、跨膜区和胞内区组成(鸭CD8基因的克隆与表达)。本发明发明人已克隆的鹅的CD8α链的信号肽为1-23aa，胞外区为24-183aa，跨膜区为184-206aa，胞内区为207-236aa。

1997年，Luhtala等克隆得到鸡CD8α基因序列，其开放阅读框为708bp，编码236个氨基酸。与人和小鼠的CD8α基因序列的相似性分别是31％和29％。2005年，Kothlow等，克隆得到的鸭CD8α基因序列的开放阅读框为711bp，编码237个氨基酸，含有23个氨基酸的信号肽，成熟蛋白的分子量大小约为24.1KDa。鸭CD8α蛋白序列与鸡CD8α的相似比为59.6％，与人CD8α的相似比为25.1％。2013年Q.Zhao等克隆得到四川白鹅CD8α基因序列，全长1459bp，包含一个全长711bp的完整开放阅读框，共编码236个氨基酸，通过半定量RT-PCR的方法分析了CD8αmRNA在幼鹅和成鹅体内的转录水平。2013年魏双施、张雪莲等克隆了东北白鹅的CD8α基因并制备了抗鹅CD8α胞外区的多克隆抗体，应用抗鹅CD8α多克隆抗体检测出CD8分子位于外周血淋巴细胞膜上。

单克隆抗体的研制为基础和临床免疫学的研究创造了有利条件。针对CD分子单克隆抗体可对动物的淋巴细胞进行分选，以研究特定表位、多肽或抗原分子的免疫应答类型及相应细胞的功能。研究CD3⁺、CD4⁺、CD8⁺T淋巴细胞的含量在临床诊断上有着重要的意义，可以了解机体细胞免疫状态，免疫机制等。

国内外已经制备出多种抗鸡、鸭CD8α的单克隆抗体。Vainio等通过不同的单克隆抗体，发现鸡CD8⁺T细胞存在不同的亚群，进而预测鸡CD8⁺T细胞可能与人类的CD8⁺T细胞一样，以αα同源二聚体或者αβ异源二聚体的形式存在。2005年Kothlow通过制备的抗鸭CD8α单克隆抗体，利用流式细胞术分析了CD8⁺T细胞在胸腺细胞中占70％、脾脏细胞中占40％、外周血细胞中占30％。2010年季琰应用抗鸡CD8α单克隆抗体分析不同免疫组的鸡的免疫水平。2015年S.Chen等利用商品化鼠抗鸭CD8α链单克隆抗体分析鹅随着日龄的增长CD8⁺T细胞在不同组织中分布的变化情况。目前禽类CD8分子的研究远远滞后于哺乳动物，且鹅CD8α链单克隆抗体制备的研究尚属空白，这严重限制了鹅CD8分子功能的进一步探索及鹅免疫机理的研究。

本发明首次利用原核表达系统表达鹅CD8α链胞外区80-160aa基因片段，以重组蛋白为免疫原制备鹅CD8α链胞外区80-160aa的单克隆抗体，初步建立了可检测鹅CD8⁺T淋巴细胞的流式细胞术和激光共聚焦方法，为揭示鹅T淋巴细胞发生、发育的规律、T细胞的信号转导、T细胞亚群的分类、T细胞的组织分布、动态变化等研究及其在机体免疫防御中的作用，提供理论依据及物质基础。

发明内容

本发明所要解决的技术问题之一是提供一种能够稳定分泌抗鹅CD8α链胞外区80-160aa单克隆抗体的杂交瘤细胞株以及由该杂交瘤细胞株分泌所产生的单克隆抗体。

本发明所要解决的技术问题之二是提供所述单克隆抗体在制备检测禽类外周血中CD8⁺T淋巴细胞试剂中的应用。

本发明所要解决的技术问题是通过以下技术途径来实现的：

本发明以本实验室构建好的携带鹅CD8α链胞外区的pET-30a-CD8αex载体为模板，利用Primer premier5.0分子生物学软件辅助设计了1对特异性扩增引物(CD8(238-480)-S和CD8(238-480)-A)扩增得到鹅CD8α胞外区基因(该基因简称CD8αex238-480bp)。构建重组原核表达载体pET-30a-CD8αex238-480bp和pET-32a-CD8αex238-480bp，采用大肠杆菌Rosetta^TM(DE3)pLysS表达鹅CD8α链胞外区80-160aa得到重组蛋白rGopET-30a-CD8αex80-160aa和rGopET-32a-CD8αex80-160aa。以重组蛋白rGopET-30a-CD8αex80-160aa为免疫原，免疫三次BALB/c小鼠，再加强免疫一次，取BALB/c小鼠脾淋巴细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合，经筛选获得1株稳定分泌抗鹅CDα链胞外区80-160aa单克隆抗体的杂交瘤细胞株，命名为9E4，分类命名为抗鹅CD8α链胞外区单克隆抗体杂交瘤细胞株，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址是北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏号是：CGMCCNO.11194，保藏时间是：2015年9月14日。

进一步，本发明还提出了由保藏号为CGMCCNO.11194的杂交瘤细胞株分泌产生的抗鹅CD8α链胞外区80-160aa单克隆抗体。经抗体亚类试剂盒鉴定，杂交瘤细胞株9E4所产生的单克隆抗体为IgG1型。间接ELISA结果显示，所述单克隆抗体能与纯化的重组鹅CD8α链胞外区蛋白rGopET-32a-CD8αex80-160aa反应，同时也能够与分离的鹅外周血淋巴细胞发生反应。激光共聚焦及流氏细胞术结果显示该抗鹅CD8α链胞外区80-160aa单克隆抗体也可以与鸡、鸭外周血淋巴细胞发生反应。

因此，更进一步的，本发明还提出了所述的抗鹅CD8α链胞外区80-160aa单克隆抗体在制备检测禽类外周血中CD8⁺T淋巴细胞试剂中的应用。其中，优选的，所述禽类包括鹅、鸭以及鸡。

附图说明

图1为鹅CD8αex238-480bp基因的扩增；

图2为CD8αex80-160aa各物种间氨基酸序列比较；

图3为CD8αex80-160aa各物种间氨基酸序列相似性分析；

M.Trans 2K Plus ⅡDNA Marker；1.PCR扩增产物；

图4为重组质粒pET-30a-CD8αex238-480bp、pET-32a-CD8αex 238-480bp的酶切鉴定；

M.Trans 2K Plus ⅡDNA Marker；1.pET-30a-CD8αex238-480bp Kpn I单酶切；2.pET-30a-CD8αex238-480bp Kpn I、Sac I双酶切；3.pET-32a-CD8αex238-480bp KpnI单酶切；4.pET-32a-CD8αex238-480bp Kpn I、Sac I双酶切；

图5为重组质粒pET-30a-CD8αex238-480bp PCR鉴定；

M.Trans 2K Plus ⅡDNA Marker；1.阴性对照；2.PCR扩增片段；

图6为重组质粒pET-32a-CD8αex 238-480bp PCR鉴定；

M.Trans 2K Plus ⅡDNA Marker；1.PCR扩增片段；2.阴性对照；

图7为重组蛋白rGoCD8αex80-160aa的SDS-PAGE鉴定；

M.蛋白质分子质量标准；1-4.rGopET-30a-CD8αex80-160aa菌体诱导前、诱导后、超声上清、超声沉淀；5-9.诱导后pET-32a空载体、rGopET-32a-CD8αex80-160aa菌体诱导前、诱导后、超声上清、超声沉淀；

图8为纯化的rGopET-30a-CD8αex80-160aa重组蛋白SDS-PAGE；

M.蛋白质分子质量标准；1.纯化的rGopET-30a-CD8αex80-160aa重组蛋白；

图9为纯化的rGopET-32a-CD8αex80-160aa重组蛋白SDS-PAGE；

M.蛋白质分子质量标准；1.纯化的pET-32a-CD8αex80-160aa重组蛋白；

图10为重组蛋白rGopET-30a-CD8αex80-160aa的抗原性鉴定；

M.蛋白质分子质量标准；1.诱导后pET-30a空载体；2.pET-30a-CD8αex 80-160aa重组蛋白；

图11为重组蛋白rGopET-32a-CD8αex80-160aa的抗原性鉴定；

M.蛋白质分子质量标准；1.诱导后pET-32a空载体；2.重组蛋白rGopET-32a-CD8αex80-160aa；

图12为细胞株染色体计数；A.9E4杂交瘤细胞株；B.SP2/0细胞株；

图13为9E4杂交瘤细胞株分泌抗体稳定性分析；

图14为9E4杂交瘤细胞株单抗腹水效价的测定；

图15为9E4单克隆抗体反应性的I-ELISA鉴定；

图16为9E4单克隆抗体对鹅CD8α胞外区80-160aa蛋白的Westernblot鉴定；

M.蛋白质分子质量标准；1.诱导后pET-32a空载体；2.重组蛋白rGopET-32a-CD8αex80-160aa；

图17为9E4单克隆抗体的间接免疫荧光鉴定(200×)结果；

A.质粒pcDNA3.1-CD8αex转染的鸡胚成纤维细胞与纯化的9E4单克隆抗体的间接免疫荧光分析；B.空载体pcDNA3.1(+)质粒对照；

图18为9E4单克隆抗体相对亲和常数的测定；

图19激光共聚焦鉴定9E4单克隆抗体的交叉反应性；

A.PBL DAPI染色；B.PBL FITC染色；C.A和B合并图像；

图20流式细胞术分析9E4单克隆抗体的交叉反应性；

A.5A9与淋巴细胞反应的流式分析；B.淋巴细胞流式分析的阴性对照。

具体实施方式

下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。

本发明实施例中所涉及的材料与试剂：

1试验材料

1.1试验动物

BALB/C小鼠，SPF级6周龄，购自长春亿斯实验动物技术有限责任中心；成年白鹅购自哈尔滨松北区华宇养殖厂；成年鸭购自中国农业科学院哈尔滨兽医研究所；成年鸡购自某养殖厂。

1.2细胞、菌株及质粒

SP2/0骨髓瘤细胞由本实验室保存；感受态细胞TG1和Rosetta^TM(DE3)pLysS均由本实验室制备保存；pET-30a(+)质粒、pET-32a(+)质粒购自Invitrogen(北京)生物技术有限公司；重组质粒pET-30a-CD8αex(携带鹅CD8α链胞外区的原核表达载体)由本实验室构建并保存。

1.3主要试剂

1.3.1工具酶等

Pfu高保真DNA聚合酶(2.5U/μL)购自TIANGEN(北京)公司；rTaq DNA聚合酶(5U/μL)、限制性内切酶、dNTP、DNA标准Marker、蛋白标准Marker购自TaKaRa(大连)公司；T4DNA连接酶(350U/μL)购自NEB公司；小量质粒提取和胶回收试剂盒购于BioTeck(哈尔滨)生物工程有限公司。

1.3.2蛋白表达及纯化试剂等

IPTG购自北京索莱宝科技有限公司；DAB显色试剂盒、BCA蛋白测定试剂盒购自碧云天生物技术有限公司；Ni-NTA亲和层析纯化试剂盒、Protein G亲和层析纯化试剂盒购自GenScript(南京)生物技术有限公司公司；弗氏佐剂(FA)、PEG和DAPI购自SIGMA公司；

1.3.3抗体制剂

兔抗鹅CD8α链多克隆抗体由本实验室制备保存；辣根过氧化物酶(HRP)标记的羊抗鼠IgG、羊抗兔IgG抗体均购自北京博奥森公司；异硫氰荧光素(FITC)标记的羊抗鼠IgG购自北京中杉金桥生物技术有限公司；小鼠单抗Ig类鉴定试剂盒(C060102)由洛阳佰奥通实验材料中心研制。

1.3.4细胞类制剂

秋水仙素、人淋巴细胞分离液购自北京索莱宝科技有限公司；HAT、HT选择性培养基及RPMI1640培养基购自GIBCO公司；LTX转染试剂购自美国Invitrogen公司。青霉素、链霉素购自哈尔滨三精制药厂；胎牛血清购自浙江天杭生物科技有限公司。

实施例1鹅CD8α链胞外区238-480bp基因的克隆及重组蛋白的表达

方法：

1鹅CD8α胞外区238-480bp基因的克隆与原核表达载体的构建

1.1引物设计

根据本实验室已克隆的鹅CD8基因(登录号:JQ272859)，以本发明发明人前期构建的pET-30a-CD8αex为模板，利用Primer premier5.0软件设计特异性引物(CD8(238-480)-S和CD8(238-480)-A)，其中上下游引物分别引入kpn Ⅰ、sac Ⅰ限制性内切酶位点，用于扩增鹅CD8胞外区238-480bp基因，引物送于哈尔滨博仕生物技术有限公司合成。

表1扩增鹅CD8α胞外区238-480bp基因的引物

1.2鹅CD8α胞外区238-480bp基因的扩增

以阳性质粒pET-30a-CD8αex为模板，建立50μL PCR反应体系:

PCR反应条件:

利用0.8％琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增结果，根据BioTeke多功能DNA纯化回收试剂盒说明书纯化PCR产物。

1.3鹅CD8α胞外区238-480bp基因的序列同源性分析

通过GenBank上公布的不同物种的CD8α序列，利用DNA MAN及DNA Star软件对鹅CD8α胞外区238-480bp基因与鸭(AAW63064.1)、鸡(AAS21628.1)、鼠(NP_113726.1)、猴(NP_001759.3)、牛(NP_776440.1)、鱼(ACZ65036.1)、人(AAH25715.1)的CD8α序列进行同源性分析。

1.4目的片段、表达载体的酶切与连接

将1.2的PCR扩增产物、pET-30a(+)质粒、pET-32a(+)质粒酶切，30μL体系:

37℃作用90min，对酶切产物按1.2的方法回收。回收后将目的片段与表达载体连接，10ul体系:

16℃金属浴连接12-16h，连接产物命名为pET-30a-CD8αex238-480bp、pET-32a-CD8αex238-480bp。连接产物转化至TG1感受态细胞。转化方法参照《分子克隆实验指南》转化步骤如下：从-70℃冰箱中取出TG1感受态细胞，放置于冰盒上，待其融化后，在超净工作台中将上述连接产物加入到感受态细胞中，并轻轻旋转混匀，冰浴30min；再将其放入42℃恒温水浴中，热激90s后，快速转移至冰盒上冰浴3～5min；加入200μL高温灭菌的LB培养基，37℃恒温摇床培养60min，取出全部的转化产物，在含有抗生素的平板上均匀的涂布菌液，将平板正置于37℃恒温培养箱中，待10min后，倒置平板，培养12～16h。

1.5重组质粒的提取

挑取生长圆滑的单个菌落于含相应抗生素的LB液体培养基中扩大培养，应用百泰克高纯质粒小量制备试剂盒提取重组质粒，步骤如下：取1.5-4.5mL过夜培养的菌液，12000r/min离心30s，弃上清；加入250μL P1溶液，用枪重悬菌体沉淀并彻底混匀；加250μL P2溶液，温和地混匀，直至菌体完全裂解；加400μL P3溶液，温和地混匀后放置3min。室温13000r/min离心10min，取上清；将离心后上层液体加入到吸附柱中，12000r/min离心1min，弃滤液；加入去蛋白液500μL，12000r/min离心60s，弃滤液；加入漂洗液500μL，12000r/min离心60s，弃滤液；重复一次步骤7，12000r/min离心60s，弃滤液；将吸附柱放入灭菌的EP管中，加60-100μL Elution Buffer室温放置1min，12000r/min离心1min，收集流出液。

1.6重组质粒的鉴定

(1)重组质粒的酶切鉴定

对于提取的重组质粒pET-30a-CD8αex238-480bp、pET-32a-CD8αex238-480bp进行Kpn Ⅰ单酶切和Kpn Ⅰ、Sac Ⅰ双酶切，10μL体系:

单酶切时37℃作用45min,双酶切时37℃作用90min，经0.8％琼脂糖凝胶电泳检测酶切结果。

(2)重组质粒的PCR鉴定

PCR鉴定，10μL体系:

PCR反应条件:

扩增基因经0.8％琼脂糖凝胶电泳检测。

2鹅CD8α胞外区80-160aa的原核表达及抗原性鉴定

2.1鹅CD8α胞外区80-160aa的诱导表达

将阳性重组质粒pET-30a-CD8αex238-480bp、pET-32a-CD8αex238-480bp转化至Rosetta^TM(DE3)pLysS感受态细胞中，方式同1.4。次日37℃培养至菌液OD600的值达到0.4～0.6，按0.1％加入IPTG至终浓度为1mmol/L，37℃继续培养4h。收获诱导后菌液，4℃、5000r/min离心15min，弃上清，0.01mol/L>

2.2重组蛋白的纯化

将获得的包涵体蛋白分别与3mL Buffer B(100mM NaH₂PO₄；10mM>

将纯化后的目的蛋白装入透析袋中，放于含5％甘油的PBS透析液中于4℃透析，每隔4～6h换液一次，除去尿素。透析后浓缩蛋白样品并利用Bradford蛋白测定试剂盒测定纯化后蛋白浓度，其余加入20％甘油后，分装保存于-20℃。

2.3重组蛋白的抗原性鉴定

利用Western blot鉴定重组蛋白的抗原性，将纯化的重组蛋白rGopET-30a-CD8αex80-160aa及rGopET-32a-CD8αex80-160aa经SDS-PAGE电泳后并转印到NC膜上，50mA，40min，丽春红染色发现目的条带，PBST洗涤后，5％的脱脂乳，4℃封闭过夜；次日PBST洗涤3次，5min/次，以本发明发明人制备的抗鹅CD8α多克隆抗体作为一抗，37℃作用2h，PBST洗涤3次，5min/次；HRP标记的山羊抗鼠IgG为二抗，PBST以1:2000稀释，37℃作用1h，PBST洗涤3次，5min/次；DAB避光显色5-15min，观察目的条带，蒸馏水终止。

结果：

1鹅CD8α胞外区238-480bp基因的克隆与原核表达载体的构建

1.1鹅CD8α胞外区238-480bp基因的扩增

根据设计的特异性引物CD8(238-480)-S和CD8(238-480)-A，以阳性质粒pET-30a-CD8αex为模板，PCR扩增得到目的基因243bp，大小与预期结果相符，如图1。

1.2鹅CD8α胞外区238-480bp基因的序列同源性分析

利用DNA MAN及DNA Star软件对鹅CD8α胞外区238-480bp基因的序列同源性分析结果如图2、图3。

1.3鹅CD8α胞外区238-480bp基因原核表达载体构建

将PCR扩增产物与pET-30a(+)、pET-32a(+)空质粒同时进行Kpn Ⅰ及Sac Ⅰ双酶切，之后连接并转化至TG1感受态细胞中，提取质粒后，经Kpn Ⅰ单酶切分别得到5.6Kb、6.1Kb片段，Kpn Ⅰ、Sac Ⅰ双酶切分别获得5.4Kb、243bp及5.8Kb、243bp的目的片段，与预期相符，如图4。进一步进行PCR鉴定，可以获得目的基因，送去测序，测序结果正确，如图5、图6，命名阳性质粒为pET-30a-CD8αex238-480bp、pET-32a-CD8αex 238-480bp。

2鹅CD8α胞外区80-160aa的原核表达及抗原性鉴定

2.1鹅CD8α胞外区80-160aa的诱导表达

将阳性重组质粒pET-30a-CD8αex238-480bp、pET-32a-CD8αex238-480bp转化至Rosetta^TM(DE3)pLysS感受态细胞中，经IPTG诱导表达后，获得重组蛋白，重组蛋白rGopET-30a-CD8αex80-160aa大小约为16KDa，rGopET-32a-CD8αex80-160aa大小约为29KDa，重组蛋白pET-30a-CD4ex大小约为54KDa，均与预期大小相符，表达方式均为包涵体表达，如图7。

2.2重组蛋白的纯化

重组蛋白rGopET-30a-CD8αex80-160aa和rGopET-32a-CD8αex80-160aa在变性条件下均可被纯化出来，且蛋白均在含100mM咪唑的8M尿素的溶液中被洗脱下来，如图8、图9。

2.3重组蛋白的抗原性鉴定

重组蛋白rGopET-30a-CD8αex80-160aa和rGopET-32a-CD8αex80-160aa分别与已制备好的兔抗鹅CD8α胞外区多克隆抗体反应，均可以发现特异性条带，说明重组蛋白具有良好的抗原性，如图10、11。

实施例2抗鹅CD8α胞外区80-160aa单克隆抗体的制备

方法：

1动物免疫

将纯化的后的重组蛋白rGopET-30a-CD8αex80-160aa作为免疫原，首免时与等体积的弗氏完全佐剂乳化，其余免疫时与弗氏不完全佐剂乳化，经背部皮下多点注射6周龄BALB/C小鼠(50ug/只)，免疫间隔时间为2周，加强免疫3d后无菌取小鼠脾脏用于细胞融合，收集阴性、阳性血清用于建立筛选阳性杂交瘤细胞株I-ELISA。

2单克隆抗体的制备

2.1单克隆抗体I-ELISA检测方法的建立

取健康的BALB/c小鼠，作为阴性对照鼠，与免疫小鼠在相同条件下饲养，融合前分别将免疫小鼠和对照小鼠眼球采血，分离血清，-20℃保存备用。

将纯化的重组蛋白rGopET-32a-CD8αex80-160aa作为检测原，利用碳酸盐缓冲液(pH 9.6)将rGopET-32a-CD8αex80-160aa检测原做1:25、1:50、1:100、1:200、1:400和1:800倍比稀释，每孔100μL，加入微量反应板，4℃包被过夜。弃去板中液体，PBST洗涤3次，加封闭液(5％脱脂乳)300μL/孔，37℃封闭2h。弃去板中液体，用PBST洗涤3次，将阳性、阴性血清用PBST分别做1:100、1:200、1:400、1:800倍比稀释，100μL/孔，同时设空白对照，37℃作用1h。弃去板中液体，PBST洗涤3次，用PBST将HRP标记的羊抗鼠酶标二抗以1:5000稀释，每孔100μl，37℃作用1h。弃去板中液体，用PBST洗涤3次，加入新配制的TMB显色液100μL/孔，37℃显色5～10min，1M H₂SO₄>450nm值。阳性血清孔的OD₄₅₀nm值≥1.0，阴性血清孔的OD₄₅₀nm值≤0.2，P/N>2.0时的抗原、血清最大稀释度为最佳工作浓度。

同时建立细胞I-ELISA方法作为辅助检测方法:

1)无菌采集鹅静脉血，加入适量抗凝剂后，制备抗凝血，以1:1的比例与PBS混合；

2)将上述混合液慢加入到等体积的淋巴细胞分离液界面上，2000rpm，离心15min。吸取界面淋巴细胞，用PBS洗涤3次，2000rpm，离心5min；

3)按Ludwig suter等改良方法，进行细胞ELISA，加入冰冷的0.1％戊二醛悬起细胞，在4℃处理30min，PBS洗涤两次，将细胞悬浮于1％BSA/0.1mol/L甘氨酸PBS中，室温作用60min，PBS洗涤两次，用PBS将细胞重悬，调整细胞浓度为1×10⁷个/mL，-20℃保存。

4)通过棋盘滴定的方法确定抗原和抗体的工作浓度，并确定ELISA的反应程序。

2.2饲养层细胞的制备

在融合前一天，将未进行免疫的BALB/c小鼠眼球采血，分离血清作为阴性血清，颈椎脱臼处死，75％酒精消毒5min后移入超净工作台内，固定于经紫外消毒的解剖板上，用灭菌剪刀剪开皮肤，同时用镊子钝性剥离使腹膜充分暴露。用l0ml一次性注射器吸取含20％胎牛血清的HAT选择培养液注入小鼠腹腔，全部注入后，再用注射器抽出腹腔内的培养液，加入到准备好的HAT培养液中，调整细胞浓度在2×10⁵个/mL，将细胞悬液混匀后加入到96孔细胞培养板中，100μL/孔，置于37℃5％CO₂培养箱中培养。

2.3骨髓瘤细胞的准备

融合前2天对于生长状态良好的骨髓瘤细胞扩大培养，融合当天，将处于生长旺盛期的细胞收集至50ml离心管中，1000r/min离心15min，弃去上清，用不完全1640培养液洗涤一次后，将细胞悬浮，计数，用于融合。

2.4脾淋巴细胞的制备

加强免疫后3天的BALB/c小鼠，眼球采血，颈椎脱臼处死，浸入75％酒精中消毒5min，放入超净工作台中的解剖台上。用灭菌剪刀剪开小鼠皮肤，同时用镊子将小鼠的皮肤拉向两侧，暴露腹膜，换一套剪镊剪开腹膜，即可看到脾脏。取出脾脏，放入装有不完全1640培养液的无菌培养皿中，小心剥离附着在脾脏表面的结缔组织和脂肪等。再将脾脏置于另一无菌培养皿中，加入1640不完全培养液，用镊子在灭菌后的200目的铜网上对脾脏进行研磨。研磨充分后，收集培养液并转移至50mL离心管中，1000r/min离心15min，重悬细胞，计数。

2.5细胞融合

将制备好的脾细胞和骨髓瘤细胞悬液，按脾细胞:SP2/0≈8:1～10:1之间的比例混合，加于50mL离心管中，1000r/min离心15min，弃上清，轻弹离心管底，使细胞沉淀充分混匀成糊状，将离心管垂直置于盛有37℃预热的蒸馏水的烧杯中。吸取1mL 37℃预热的融合剂PEG3350，边滴入细胞中边轻轻摇动离心管，轻轻混匀，1min内加完。静置90s，在1min内缓慢滴入37℃预热的不完全1640培养液1mL，边滴边轻轻转动离心管，再重复一次，随后在30s内加入1mL不完全1640培养液，2min内加完7ml预热的不完全1640，1000r/min离心10min离心，弃上清。HAT选择培养液将沉淀细胞悬起，混合均匀。将细胞悬液接种于已加有饲养细胞的96孔细胞培养板中，每孔100μL，将培养板移至37℃5％CO₂培养箱中培养。

2.6阳性杂交瘤细胞株的筛选

每5～7天，采用半换液方式对融合后的细胞进行培养液的更换。待杂交瘤细胞长满孔底1/3～1/2时，取出细胞培养上清100uL，用建立的I-ELISA筛选方法对上清进行检测，同时用SP2/0上清作阴性对照，并设阴阳性鼠血清对照，以P/N≥2.0为判定标准，对阳性孔进行克隆。

2.7杂交瘤细胞的克隆、冻存与复苏

将I-ELISA检测为阳性孔的杂交瘤细胞集落悬起混匀，采用有限稀释法，吸取一定量细胞至无菌小青瓶中进行稀释，稀释至10mL含100个细胞，将稀释好的细胞悬液以每孔100μL加入到含有饲养细胞的96孔细胞培养板中培养。经过2～4次克隆，直至所有克隆化细胞孔阳性率为100％时，即可确定已获得分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株。

阳性杂交瘤细胞株冻存时，将培养瓶中生长旺盛的杂交瘤细胞利用吸管进行反复吹打、分散均匀后，置于10mL离心管中，1000r/min离心5min，弃掉培养液，收集细胞，用1.5mL细胞冻存液将细胞重悬，加入到细胞冻存管中，做好标记后直接放入细胞程序冻存盒中，先放于-70℃冰箱中，而后投入液氮容器中。

杂交瘤细胞复苏时，从液氮容器中取出冻存管，迅速放入37℃水浴中，摇动使其在1min内迅速融化，而后500r/min离心5min，弃掉冻存液，用完全1640培养液将细胞沉淀悬起，加入到事先盛有适量培养液的细胞培养瓶中，37℃5％CO₂恒温培养箱内培养，4h～12h内观察培养瓶中有部分细胞贴壁后，对其进行换液即可。

2.8腹水的制备及纯化

高压灭菌的液体石蜡，腹腔注射8～12周龄BALB/c小鼠，0.5mL/只，注射后7-10天注射扩大培养的杂交瘤细胞。利用不完全1640培养液将生长旺盛的杂交瘤细胞吹下来，1000r/min离心5min，弃去上清。用不完全1640培养液洗涤细胞一次，重悬细胞并计数，调整细胞浓度为1～2×10⁶个/mL，腹腔注射，0.5mL/只，注射后7～10天密切观察小鼠的生长状态及腹水产生情况，当发现小鼠腹腔有流动性腹水时，及时收集腹水，并以10000r/min离心10min，弃去油脂和细胞沉淀，吸取澄清液体，分装-70℃保存。

腹水纯化，将Protein G填料注入柱子中，轻柔的混合2次，用Binding Buffer A(Na₂HPO₄>

3分泌抗鹅CD8α胞外区80-160aa单克隆抗体杂交瘤细胞株的鉴定

3.1杂交瘤细胞株染色体计数分析

在生长旺盛的杂交瘤细胞中加入秋水仙素，使其终浓度为0.5μg/mL，继续培养4～6h。吹下培养瓶中的细胞，将细胞悬液以1000r/min离心10min，弃上清液，加入37℃预热的5mL 0.075mol/L KCl低渗液，混悬细胞，37℃处理15-20min；加入新配制的固定液(甲醇与冰醋酸3:1混合)1mL，边滴边混匀细胞悬液，1000r/min离心10min，弃上清液；再加入固定液5ml将细胞沉淀重新悬浮并混匀，静置30min后，1000r/min离心10min，弃上清液；重复操作一次后小心吸出上清，保留少许固定液与细胞混匀后吸取1～2滴悬液加至载玻片上；干燥后吉姆萨染色10min；选择染色体分散良好、无重叠、失散的细胞进行镜检观察并计数。

3.2杂交瘤细胞株的稳定性分析

对杂交瘤细胞进行体外多次传代，收集每次传代的细胞上清，用建立的I-ELISA检测方法检测上清OD₄₅₀nm值，分析杂交瘤细胞株分泌单克隆抗体的稳定性。

4抗鹅CD8α胞外区80-160aa单克隆抗体的特性鉴定

4.1单克隆抗体亚类鉴定

利用单抗Ig类/亚类鉴定用试剂盒进行鉴定，操作步骤参看试剂盒说明书进行。

4.2单克隆抗体效价的测定

根据建立好的I-ELISA检测方法，取抗rGopET-30a-CD8αex80-160aa单克隆抗体以1:1、1:2、1:4等2倍倍比稀释，测定OD₄₅₀nm值，以P/N≥2.0腹水的最大稀释倍数作为其效价值。

4.3单克隆抗体特异性的I-ELISA鉴定

根据之前建立好的I-ELISA检测方法，将纯化后的重组蛋白rGopET-32a-CD8αex80-160aa以及鹅T淋巴细胞同时作为抗原包被酶标反应板，抗rGopET-30a-CD8αex80-160aa单克隆抗体作为一抗，并设有阳性、阴性对照，I-ELISA步骤同方法2.1。

4.4单抗特异性的Western blot鉴定

将纯化的重组蛋白rGopET-32a-CD8αex80-160aa蛋白经SDS-PAGE电泳后并转印到NC膜上，以抗rGopET-30a-CD8αex80-160aa单克隆抗体作为一抗，以HRP标记的山羊抗鼠IgG为二抗，PBST以1:2000稀释，其余步骤同方法2.3。

4.5单抗特异性的IFA鉴定

将本发明发明人构建的真核质粒pcDNA3.1-CD8αex238-480bp转染鸡胚成纤维细胞(CEF)。常规方法制备CEF，铺制48孔板，培养过夜，待细胞生长至60％-70％时备用。利用脂质体介导的方法进行质粒的转染，转染的方法详见转染试剂LTX说明书。转染后4h，弃去培养液，加入含10％胎牛血清的DMEM培养液继续培养48h。之后用PBS洗涤细胞3次，加入适量4％的多聚甲醛固定30min，PBS洗3次；加入抗rGopET-30a-CD8αex80-160aa单克隆抗体为一抗，以pCDNA3.1(+)空质粒转染孔做阴性对照，37℃作用2h，PBS洗3次；加入1:50倍稀释的FITC标记的山羊抗鼠IgG抗体为二抗，37℃避光作用1h，PBS洗3次，荧光显微镜下观察荧光情况。

4.6单抗的相对亲和常数测定

利用硫氰酸盐洗脱法测定单抗的相对亲和常数，根据之前建立好的I-ELISA检测方法，按纯化的rGopET-32a-CD8αex80-160aa蛋白最佳稀释度包被过夜，100μL/孔，次日PBST洗涤3次；抗rGopET-30a-CD8αex80-160aa单克隆抗体的饱和浓度为一抗，100μL/孔，37℃作用1h，PBST洗涤3次；加入0、0.5、1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5mmol不同浓度的NaSCN，100μL/孔，室温作用15min，PBST洗涤3次；加入1:5000倍稀释的HRP标记的山羊抗鼠IgG抗体为二抗，100μL/孔，37℃作用1h，PBST洗涤3次；TMB液100μL/孔，显色5-10min，1M H₂SO₄>450nm值；结果判定，经硫氰酸盐洗脱后每种抗体与抗原结合的OD₄₅₀nm下降至未经洗脱的OD₄₅₀nm的50％时所对应的NaSCN浓度，即为该抗体的相对亲和力常数，用mol/L表示。

结果：

1抗鹅CD8α胞外区80-160aa单克隆抗体的制备

1.1单克隆抗体I-ELISA检测方法的建立

采用方阵法确定蛋白的最佳包被浓度及阳性血清的最佳稀释倍数，根据棋盘I-ELISA阳性血清孔的OD₄₅₀nm值接近1.0，阴性血清OD₄₅₀nm值小于0.2，P/N＞2.0，确定抗原抗体最佳稀释度，重组蛋白rGopET-32a-CD8αex80-160aa最佳稀释度为1:100，200ng/孔包被，阴阳性血清最佳稀释度为1:100，如表2，I-ELISA试验各影响因素条件的确定，如表3。

全细胞ELISA反应程序为：每孔100μL检测抗原(1×10⁶个/孔)，置于37℃恒温培养箱中孵育16～24h，PBST洗涤两次，5％脱脂乳-PBST>2SO₄>450nm)值。

表2抗原抗体最佳反应条件的确定

表3间接ELISA各个影响因素最佳反应条件的确定

1.2杂交瘤细胞株的建立

免疫的BALB/c小鼠脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合后，经HAT培养液选择性培养，在第3天开始出现融合细胞。选择经几次特异性检测并且OD₄₅₀nm值持续上升的9E4株杂交瘤细胞株。经3～4次亚克隆，获得能稳定分泌抗鹅CD8α胞外区80-160aa蛋白的单克隆抗体的杂交瘤细胞株，命名为9E4，将该杂交瘤细胞株保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号是：CGMCC>

2分泌抗鹅CD8α胞外区80-160aa单克隆抗体杂交瘤细胞株(CGMCCNO.11194)的鉴定

2.1杂交瘤细胞株染色体计数分析

骨髓瘤细胞染色体数目为55～65条，正常小鼠脾细胞的染色体数目为40条，本试验得到9E4株杂交瘤细胞株的染色体数目为100条左右，在正常范围90～110条之间，SP2/0为55条左右在正常范围55～65之间。该值大于脾细胞染色体数目的2倍，表明杂交瘤细胞确为脾细胞与骨髓瘤细胞融合而成，如图12。

2.2杂交瘤细胞株分泌抗体稳定性分析

将筛选的阳性杂交瘤细胞株扩大培养并传16代，收集每代的细胞上清，通过建立的I-ELISA方法检测细胞上清的OD₄₅₀nm值，结果发现9E4分泌抗体的稳定性均较好，如图13。

3抗鹅CD8α胞外区80-160aa单克隆抗体的特性鉴定

3.1单克隆抗体亚类鉴定

根据单抗Ig类/亚类鉴定用试剂盒进行鉴定，9E4单克隆抗体亚类为IgG1。

3.2单克隆抗体效价的测定

根据建立好的I-ELISA方法，将抗rGopET-30a-CD8αex80-160aa单抗9E4按2倍倍比稀释测效价，鼠阴阳性血清1:100稀释作对照，9E4效价为1:8192，如图14。

3.3单克隆抗体特异性的I-ELISA鉴定

将重组蛋白rGopET-32a-CD8αex80-160aa及鹅T淋巴细胞根据建好的I-ELISA方法包被，结果发现9E4均能与重组蛋白及鹅外周血T淋巴细胞发生良好的反应，如图15。

3.4单克隆抗体特异性的Western blot鉴定

Western blot结果显示9E4能与重组蛋白rGopET-32a-CD8αex80-160aa发生特异性反应，条带大小为29KDa，如图16。

3.5单抗特异性的IFA鉴定

9E4单克隆抗体与转染真核表达质粒pcDNA3.1-CD8αex238-480bp的鸡胚成纤维细胞反应，产生较强的绿色荧光信号，而pcDNA3.1(+)空质粒转染的鸡胚成纤维细胞与单抗并未产生荧光信号，表明9E4单克隆抗体可特异性识别鹅CD8α分子，如图17。

3.6单抗的相对亲和常数测定

利用硫氰酸盐洗脱法测得9E4单克隆抗体的相对亲和常数为3mol/L，具有中等强度的亲和力，如图18。

实施例3抗鹅CD8α胞外区80-160aa单克隆抗体在检测禽类CD8⁺T淋巴细胞中的应用

方法：

1激光共聚焦检测抗鹅CD8α胞外区80-160aa单克隆抗体交叉反应性

常规方法制备鹅、鸭、鸡外周血淋巴细胞，收集细胞后，PBS洗涤3次后，进行细胞计数，每个瓶皿中加入细胞1×10⁶个，分散均匀，利用4％的多聚甲醛固定过夜；次日PBS洗涤3次，利用0.5％Triton-X-100对细胞通透20min，PBS洗涤3次；加入纯化的经PBA(含1％BSA的PBS缓冲液)1:30倍稀释的9E4单克隆抗体腹水，37℃作用1h，PBS洗涤3次；加入1:200倍稀释的FITC标记的山羊抗鼠IgG抗体为二抗，37℃避光作用45min，PBS洗涤3次；利用0.5mg/mL的DAPI进行细胞核染色，37℃作用30min后，PBS洗涤3次，激光共聚焦显微镜下观察荧光信号的产生情况。

2流式细胞术分析抗鹅CD8α胞外区80-160aa单克隆抗体交叉反应性

常规方法制备鸡、鸭、鹅外周血淋巴细胞，PBS洗涤3次，进行细胞计数，每个EP管中加入细胞5×10⁵个，1000r/min离心5min；加入纯化的经PBA(含1％BSA的PBS缓冲液)1:200倍稀释的9E4单克隆抗体腹水，重悬细胞，4℃作用1h，PBS洗3次；加入1:200稀释的FITC标记的山羊抗鼠IgG抗体为二抗，4℃避光作用45min，PBS洗3次；用200μL>

结果：

1激光共聚焦检测抗鹅CD8α胞外区80-160aa单克隆抗体交叉反应性

常规方法收集鹅、鸭、鸡外周血淋巴细胞，将稀释好的纯化的9E4单克隆抗体腹水适量加入细胞中，结果发现9E4单克隆抗体不仅与鹅T淋巴细胞反应，而且与鸭、鸡T淋巴细胞也均有交叉反应性，其中与鹅淋巴细胞的反应性最强，鸭、鸡的淋巴细胞的反应性较强，如图19，说明制备的9E4单克隆抗体可以用于检测鹅、鸭以及鸡的T淋巴细胞。

2流式细胞术检测抗鹅CD8α胞外区80-160aa单克隆抗体交叉反应性

经过流式细胞术分析健康状态良好且未经免疫的成年鹅的CD8⁺T淋巴细胞所占淋巴细胞的19.2％，成年鸭的CD8⁺T淋巴细胞所占淋巴细胞的25.6％，成年鸡的CD8⁺T淋巴细胞所占淋巴细胞的10％，分别与各自对照组相比9E4单克隆抗体检测的T淋巴细胞出现了明显的阳性峰，说明9E4单抗均可以用于检测鹅、鸭、鸡外周血中的CD8⁺T淋巴细胞，如图20。