公开/公告号CN106632664A
专利类型发明专利
公开/公告日2017-05-10
原文格式PDF
申请/专利权人 沈阳药科大学;
申请/专利号CN201710022491.3
申请日2017-01-12
分类号C07K14/775;C07K1/18;C07K1/22;C07K1/20;C07K1/16;C07K1/30;C07K1/34;C07K1/36;C12N15/12;C07K16/18;G01N33/92;
代理机构沈阳杰克知识产权代理有限公司;
代理人靳玲
地址 110016 辽宁省沈阳市沈河区文化路103号
入库时间 2023-06-19 02:06:38
法律状态公告日
法律状态信息
法律状态
2020-07-10
授权
授权
2017-06-06
实质审查的生效 IPC(主分类):C07K14/775 申请日:20170112
实质审查的生效
2017-05-10
公开
公开
技术领域:
本发明涉及生物医药技术领域,涉及载脂蛋白II/I的结构及其获得方法、新生物学功能以及在生物医药领域中的应用。具体地说,本发明涉及载脂蛋白II/I及其活性片段的结构及其制备生产方法与功能,以及其在微生物及其相关分子模式检测诊断、促进昆虫血淋巴黑色素产生、诱导昆虫合成抗菌肽等生物医药领域中的应用,制备载脂蛋白II/I与活性片段抗体及其在生物医药领域的应用。
背景技术:
载脂蛋白是血浆脂蛋白中的蛋白质部分,其基本功能是转运脂类物质、稳定脂蛋白结构等。载脂蛋白在人类等哺乳动物中被称为apolipoprotein(apo),分为A、B、C、D、E五类。这些载脂蛋白亚型的异常,已经被证实与阿尔茨海默病、动脉粥样硬化等疾病相关。而在昆虫中,载脂蛋白被称为apolipophorin(apoLp),它们构成了昆虫脂蛋白的蛋白部分。
昆虫apoLp-I及apoLp-II来源于同一个mRNA前体apoLp-II/I,并在蛋白的翻译后修饰及分泌过程中被弗林蛋白酶(Furin)切割形成。而apoLp-II/I的载脂功能并不依赖于这种切割作用。apoLp-II为N端部分、apoLp-I为C端部分,二者参与形成高密度脂蛋白(high-density lipophorin,HDLp)。昆虫载脂蛋白前体apoLp-II/I与哺乳动物apoB-48同源,两者均是脂蛋白颗粒中的重要组成部分,在脂类运输及代谢上起到不可或缺的作用。
ApoLp-II/I与其他家族成员一样,其N端包含一个较大的LLT结构域,该结构域形成一个“lipid pocket”样的结构,主要参与与脂类的结合,起到贮存或运输的作用。除了N端结构域之外,apoLp-II/I还包含一个DUF1081结构域,以及靠近C端的von Willebrandfactor module D(VWD)结构域。但这些结构域的功能目前尚无定论。
对昆虫apoLp-II/I的研究主要集中在其结构、生物合成与分泌,以及脂类转运作用等方面。但最新的研究发现,apoLp-II/I还参与了昆虫的先天性免疫反应。有报道指出,家蚕apoLp-II/I能够抑制金黄色葡萄球菌的溶血毒性。纯化后的apoLp-II/I能够降低S.aurues中与溶血素(hemolysin)相关的基因,包括hla,hlb,saeRS以及RNAIII的表达。进一步研究发现,apoLp-II/I是通过与S.aurues细胞表面的LTA结合,进而通过后者的双组份系统影响S.aurues的saePQRS操纵子,最终抑制了溶血素的表达及分泌。在冈比亚按蚊中,apoLp-II/I是全身性免疫反应的负向调控因子。RNA干扰apoLp-II/I后,按蚊的免疫应答程度显著性提高了。而这种提高作用是补体样蛋白TEP1(thioester-containing protein 1,硫酯蛋白)依赖性的,干扰apoLp-II/I能够使TEP1的表达量增高,而后者经由JNK通路产生免疫反应。上述例子表明,昆虫apoLp-II/I不仅参与了脂类的转运和代谢,同时也是一种先天性免疫相关蛋白。
目前尚未见对鳞翅目(Lepidoptera)的天(大)蚕蛾科昆虫载脂蛋白II/I的结构、制备、生物学功能及其应用的相关研究。
发明内容:
本发明所解决的技术问题是提供一系列载脂蛋白II/I及其制备方法。
所述的载脂蛋白II/I的氨基酸序列如SEQ ID:2所示;
编码所述载脂蛋白II/I的氨基酸序列的基因序列如SEQ ID:1所示。
本发明还提供了所述天然载脂蛋白II/I、重组载脂蛋白II/I活性片段。
所述的载脂蛋白II/I活性片段包括SEQ ID:1或SEQ ID:2所述的序列。
所述的载脂蛋白II/I活性片段的序列如SEQ ID:3-6所示。
本发明进一步提供了所述天然载脂蛋白II/I,重组载脂蛋白II/I活性片段,以天然载脂蛋白II/I、重组载脂蛋白II/I活性片段作为抗原的抗体在生物领域中的应用,包括1.针对微生物的预防、检测诊断、治疗等生物医药领域应用;2.针对微生物相关分子模式的预防、检测诊断、治疗等生物医药领域应用;3.针对天然载脂蛋白II/I、重组载脂蛋白II/I活性片段的检测与追踪等生物医药领域应用;4.通通过其抑制鳞翅目天(大)蚕蛾科昆虫的酚氧化酶原激活系统的激活情况,从而抑制鳞翅目天(大)蚕蛾科昆虫的免疫防御系统,提高鳞翅目的天(大)蚕蛾科昆虫的抗微生物能力。
本发明是针对鳞翅目的天(大)蚕蛾科昆虫体内的apoLp-II/I,研究天然apoLp-II/I的制备方法、一级结构(基因和蛋白质)、生物学功能以及其应用,利用基因工程技术获得重组apoLp-II/I活性片段以及其生物学功能和应用。此外,利用天然、重组apoLp-II/I活性片段作为抗原,刺激机体产生抗体,同时研究了该抗体的应用。
本发明是通过如下技术方案实现的:
首先利用蛋白提取、分离、纯化技术,从鳞翅目天(大)蚕蛾科昆虫中分离、纯化获得天然apoLp-II/I。其次,利用蛋白质化学技术以及分子生物学技术,解析apoLp-II/I的一级结构(基因和蛋白质)并获得其基因。再次,利用基因工程技术,实现apoLp-II/I基因片段在宿主细胞的表达,结合蛋白提取、分离、纯化技术获得重组apoLp-II/I。同时,利用基因重组技术,获得apoLp-II/I部分片段。天然、重组apoLp-II/I部分片段,能特异性识别Lys-肽聚糖、DAP-肽聚糖以及脂磷壁酸等多种微生物相关分子模式以及革兰阳性菌和部分真菌、革兰阴性菌等微生物。上述结合,能够抑制昆虫体液免疫中的酚氧化酶原激活系统。本发明的天然、重组apoLp-II/I及其部分片段以及其抗体的生物学功能,可广泛应用于针对微生物的预防、检测诊断、治疗等生物医药领域。
本发明的apoLp-II/I,其核苷酸序列如SEQ ID:1,其氨基酸序列如SEQ ID:2所示。
其制备方法如下:
一、天然apoLp-II/I的制备
本发明所获得天然apoLp-II/I是通过如下技术方案实现的,包括:
以昆虫血淋巴作为原料,分别通过亲和层析、疏水层析、离子交换层析、凝胶过滤层析、盐析、超滤或上述方法的不同组合,分离纯化得到不同纯度乃至电泳纯或HPLC纯的apoLp-II/I。
其中,昆虫血淋巴(简称血淋巴),是昆虫血液(或血细胞裂解物)和淋巴液的混合物或/和昆虫压榨或匀浆的体液,用缓冲溶液或酸性溶液或碱性溶液溶解提取,离心除去不溶杂质得到的抽提液。
apoLp-II/I的提取、分离、纯化体系基本条件的特征:(1)溶液的酸碱度在pH2~pH10,优选pH4-pH9;(2)调节溶液酸碱度的化学试剂是常规、通用的酸或碱及其溶液。酸及其溶液优选HCl、HAc、磷酸、柠檬酸、硫酸、硼酸。碱及其溶液优选NaOH、KOH、Tris、柠檬酸钠或钾盐、磷酸钠或钾盐、硼砂;(3)缓冲液是常规、通用缓冲离子对缓冲液,优选柠檬酸根缓冲离子对、HCl-Tris缓冲离子对、柠檬酸根-磷酸根缓冲离子对、磷酸根缓冲离子对、醋酸根缓冲离子对、硼酸根缓冲离子对、硼酸-Tris缓冲离子对、上述各缓冲离子的组合;(4)溶液或缓冲液的离子强度在0.001mol/L~0.8mol/L,优选0.01mol/L~0.3mol/L。上述条件既不破坏提取、分离、纯化所采用介质的理化性质,又不影响apoLp-II/I的生物活性。
昆虫血淋巴的收集:将昆虫用蒸馏水或去离子水反复清洗,采用常规方法,如蜡盘法、离心法、背血管取血法、灌注法、压榨、匀浆法、反射流血法、撕裂法、切割法、剪开法、穿刺法等,在10℃至~5℃条件下收集昆虫血淋巴。
本发明的分离分析方法包含如下中的两种或两种以上的组合:
1.离子交换层析分离纯化apoLp-II/I
取上述方法所获昆虫血淋巴,按apoLp-II/I提取、分离、纯化体系基本条件的特征,用酸性溶液或碱性溶液调pH至要求条件范围下。将处理好的样品上样于预先用缓冲液平衡好的离子交换层析,先用缓冲液充分洗涤去除不吸附的杂蛋白。洗脱方式,可以采用盐浓度阶段方式,分别用0.1mol/L、0.2mol/L、0.5mol/L、1mol/L、2mol/L、3mol/L盐溶液进行阶段洗脱;也可以采用盐浓度梯度方式,梯度为0.00mol/L~3mol/L。利用抗apoLp-II/I抗体检测目的蛋白的存在情况,将含有apoLp-II/I的洗脱液合并储存备用;也可以采用常规、通用透析或超滤方法,除去洗脱合并液的盐,或再进一步用需要的低浓度缓冲液透析或超滤处理,储存上述样品溶液备用。
离子交换层析分离纯化的特征:(1)层析介质选择阳离子交换层析填料,如CM-离子交换层析填料或SP-离子交换层析填料或S-离子交换层析填料等阳离子交换层析填料,此时缓冲液酸碱度选择在pH2-pH7;(2)层析介质选择阴离子交换层析填料,如Q-离子交换层析填料或DEAE-离子交换层析填料或QAE-离子交换层析填料等离子交换层析填料,此时缓冲液酸碱度选择在pH7-pH12;(3)缓冲液及其浓度选择,按上述APOLP-II/I提取、分离、纯化体系基本条件所描述的特征;(4)洗脱的盐溶液可以选择要求浓度的缓冲液或在缓冲液中加中性盐到需要的浓度;(5)中性盐选择(NH4)2SO4或Na2SO4或NaCl或KCl,优选NaCl;(6)分离纯化操作温度按上述APOLP-II/I提取、分离、纯化体系基本条件所描述的特征。上述条件既不影响apoLp-II/I的生物活性,又不影响活性成分的分离纯化。
2.亲和层析分离纯化apoLp-II/I
取上述方法所获昆虫血淋巴,按apoLp-II/I提取、分离、纯化体系基本条件的特征,用酸性溶液或碱性溶液调pH至apoLp-II/I的提取、分离、纯化体系基本条件特征的要求条件范围内。将处理好的样品液上样于预先用缓冲液平衡好的亲和层析,先用缓冲液充分洗涤去除不吸附的杂蛋白。洗脱方式,可以采用盐(或化学试剂)浓度梯度(0.0mol/L~3.0mol/L或0.0mol/L~6.0mol/L或0.0mol/L~8.0mol/L)方式洗脱;也可以采用盐(或化学试剂)阶段浓度洗脱方式,分别采用0.1mol/L、0.2mol/L、0.5mol/L、1mol/L、2mol/L、3mol/L、4mol/L、5mol/L、6mol/L、7mol/L、8mol/L盐溶液进行阶段方式洗脱。利用抗APOLP-II/I抗体检测目的蛋白的存在情况,将含有APOLP-II/I的洗脱液合并储存备用;也可以采用常规、通用透析或超滤方法,除去洗脱合并液的盐(或化学试剂)或再进一步用需要的低浓度缓冲液透析或超滤处理,储存上述样品溶液备用。
亲和层析分离纯化的特征:(1)亲和填料的配基选择apoLp-II/I抗体、肝素、刀豆素、甲醛固定后的细菌或真菌、sepharose CL-4B、N-乙酰氨基葡萄糖胺、肽聚糖、脂磷壁酸、葡聚糖等;(2)分离纯化操作温度、缓冲液、酸碱度选择,是按APOLP-II/I提取、分离、纯化体系基本条件所描述的特征;(3)洗脱的盐(或化学试剂)溶液可以选择要求浓度的缓冲液或在缓冲液中加盐(或化学试剂)到需要的浓度;(4)洗脱用盐(或化学试剂)可以选择(NH4)2SO4或Na2SO4或NaCl或KCl或尿素或盐酸胍;(5)洗脱用盐(或化学试剂)选择(NH4)2SO4或Na2SO4或NaCl或KCl的最高浓度为3.0mol/L,选择尿素的最高浓度为8.0mol/L,选择盐酸胍的最高浓度为6.0mol/L;(6)如果洗脱用盐(或化学试剂)选择了尿素或盐酸胍而使apoLp-II/I发生变性作用,可以通过常规、通用的蛋白质复性方法进行复性而获得apoLp-II/I。
3.疏水层析分离纯化apoLp-II/I
取上述方法所获昆虫血淋巴,按apoLp-II/I提取、分离、纯化体系基本条件的特征,用酸性溶液或碱性溶液调pH至apoLp-II/I的提取、分离、纯化体系基本条件特征的要求条件范围内。加中性盐至2mol/L浓度,上样于预先用2mol/L中性盐-缓冲液溶液平衡的疏水层析柱,先用2mol/L中性盐-缓冲液溶液充分洗涤去除不吸附的杂蛋白。洗脱方式,可以采用中性盐浓度梯度(2.0mol/L~0.0mol/L)方式洗脱;也可以采用盐浓度阶段洗脱方式,分别采用1.5mol/L、1.0mol/L、0.5mol/L、0.25mol/L、0.2mol/L、0.1mol/L、0.0mol/L中性盐溶液进行阶段方式洗脱。利用抗apoLp-II/I抗体检测目的蛋白的存在情况,将含有apoLp-II/I的洗脱液合并储存备用;也可以采用常规、通用透析或超滤方法,除去洗脱合并液的盐或再进一步用需要的低浓度缓冲液透析或超滤处理,储存上述样品溶液备用。
疏水层析分离纯化的特征:(1)疏水层析介质选择苯基-疏水层析填料或正辛烷-疏水层析填料-或己烷-疏水层析填料-或丁烷-疏水层析填料;(2)中性盐选择(NH4)2SO4或Na2SO4或NaCl;(3)分离纯化操作温度、缓冲液、酸碱度选择,是按apoLp-II/I提取、分离、纯化体系基本条件所描述的特征。
4.凝胶层析分离纯化apoLp-II/I
取上述方法所获昆虫血淋巴,按apoLp-II/I提取、分离、纯化体系基本条件的特征,用酸性溶液或碱性溶液调pH至apoLp-II/I的提取、分离、纯化体系基本条件特征的要求条件范围内。样品液上样于预先用缓冲液平衡好的凝胶过滤层析柱并进行分离纯化洗脱,利用抗apoLp-II/I抗体检测目的蛋白的存在情况,将含有APOLP-II/I的洗脱液合并储存备用;也可以采用常规、通用透析或超滤方法,除去洗脱合并液的盐或再进一步用需要的低浓度缓冲液透析或超滤处理,储存上述样品溶液备用。
凝胶层析分离纯化的特征:(1)层析介质可以选择Sephacryl S-100HR或Sephacryl S-200HR或Sephadex G-50或Sephadex G-75或Sephadex G-100或Sephadex G-150或Superose 12prep grade或Superose 6prep grade或Superdex 30prep grade或Superdex 75prep grade或Superose 12HR或Superose 6HR或Superdex Peptide HR或Superdex75HR或Superdex Peptide PE等凝胶层析填料;(2)分离纯化操作温度、缓冲液、酸碱度选择,是按apoLp-II/I提取、分离、纯化体系基本条件所描述的特征,此外洗脱液的浓度,优选在离子浓度大于0.15M及以上。
5.盐析分离纯化apoLp-II/I
取上述方法所获昆虫血淋巴,按apoLp-II/I提取、分离、纯化体系基本条件的特征,用酸性溶液或碱性溶液调pH至apoLp-II/I的提取、分离、纯化体系基本条件特征的要求条件范围内。在样品溶液中加入蛋白质盐析常规、通用的中性盐,至浓度达到apoLp-II/I仍处于溶解状态,而一些杂蛋白处于沉淀。离心取其上清溶液继续加入盐析常规、通用的中性盐至浓度达到apoLp-II/I沉淀状态。离心弃上清,沉淀溶于apoLp-II/I提取、分离、纯化体系基本条件特征的溶液或缓冲液储存备用;沉淀的溶解液,也可以采用常规、通用透析或超滤方法,除去其中的盐或再进一步用需要的低浓度缓冲液透析或超滤处理,储存上述样品溶液备用。
盐析分离纯化的特征:(1)分离纯化的缓冲液、酸碱度选择,是按apoLp-II/I提取、分离、纯化体系基本条件所描述的特征;(2)盐析使用的中性盐,选择(NH4)2SO4或Na2SO4或NaCl,优选(NH4)2SO4或Na2SO4;(3)在使apoLp-II/I处于溶解状态时,选择中性盐在5%—45%,优选10%—40%;(4)在使apoLp-II/I处于沉淀状态时,选择中性盐在40%—90%,优选45%—75%。
6.超滤分离纯化apoLp-II/I以及处理apoLp-II/I溶液
取上述方法所获昆虫血淋巴,按apoLp-II/I提取、分离、纯化体系基本条件的特征,用酸性溶液或碱性溶液调pH至apoLp-II/I的提取、分离、纯化体系基本条件特征的要求条件范围内。利用常规、通用超滤方法,分离纯化apoLp-II/I。一种方案,选择一定规格的超滤膜,使apoLp-II/I透过超滤膜,而一些杂蛋白则被超滤膜截留,从而使apoLp-II/I得以分离纯化;透过超滤膜的apoLp-II/I溶液,再选择一定规格的超滤膜,使apoLp-II/I被截留,而一些杂蛋白则透过超滤膜,从而使apoLp-II/I得以分离纯化。另一种方案,是选择一定规格的超滤膜,使apoLp-II/I先被超滤膜截留,随后再选择一定规格的超滤膜,使apoLp-II/I透过超滤膜,从而使apoLp-II/I得以分离纯化。
超滤处理apoLp-II/I溶液的目的,是除去apoLp-II/I溶液中的盐或小分子杂质或更换缓冲液。此外,对apoLp-II/I溶液进行浓缩。处理方法同上所述,选择一定规格的超滤膜,使apoLp-II/I被超滤膜截留,而盐或小分子杂质或缓冲液的缓冲离子对则透过超滤膜,从而实现去除盐、小分子杂质或更换缓冲液或浓缩的目的。
超滤分离纯化和处理的特征:透过apoLp-II/I的超滤膜选择分子量为20kDa或30kDa或40kDa或50kDa或60kDa规格的超滤膜,优选20kDa~50kDa的超滤膜,大于或小于优选规格的超滤膜,其收率或超滤效率均受影响;(2)超滤分离纯化或处理的操作温度、缓冲液及其酸碱度或浓度选择,是按apoLp-II/I提取、分离、纯化体系基本条件所描述的特征。
通过上述任何一种方法所获得的apoLp-II/I纯度,有时无法满足相应需要。
本发明是从昆虫血淋巴中分离纯化高纯度apoLp-II/I,并可以达到电泳纯乃至HPLC纯度。其特征在于,将上述六种分离纯化方法(离子交换柱层析、亲和柱层析、疏水柱层析、凝胶过滤柱层析、盐析、超滤),进行两种分离纯化方法自由组合及其顺序重排组合,或三种分离纯化方法自由组合及其顺序重排组合,或四种分离纯化方法自由组合及其顺序重排组合,或五种分离纯化方法自由组合及其顺序重排组合,纯化方法自由组合及其顺序重排组合,直至样品纯度得到预期要求。
本发明所指昆虫是鳞翅目昆虫,鳞翅目昆虫优选天(大)蚕蛾科(Saturniidae)昆虫,选自柞蚕、蓖麻蚕、天蚕、印度柞蚕、琥珀蚕、美国柞蚕、樗蚕、大山蚕、美洲天蚕、樟蚕、枫蚕,昆虫为任何地域的天然或人工放养或人工饲养的昆虫。为使本专业技术人员更全面、清晰理解本发明,以柞蚕作为代表来描述下面的内容,而选择柞蚕作为代表来描述并不是以任何方式限制本发明权利要求的范围。
本发明所述的载脂蛋白II/I、载脂蛋白II/I活性片段是利用基因工程表达获得,包括(1)原核生物系统的表达载体,表达宿主细胞为大肠杆菌细胞或枯草杆菌细胞,(2)酵母细胞系统的表达载体,表达宿主细胞为酵母细胞,(3)昆虫细胞系统的表达载体,表达宿主细胞为昆虫细胞,(4)哺乳动物细胞系统的表达载体,表达宿主细胞为哺乳动物细胞。上述表达形式为细胞内表达或分泌形式表达,上述表达体系中的表达产物作为制备载脂蛋白II/I、载脂蛋白II/I类似物或活性片段的来源。
所述“宿主细胞”包括原核细胞和真核细胞,常用的原核宿主细胞的例子包括大肠杆菌、枯草杆菌等。常用的真核宿主细胞包括酵母细胞、昆虫细胞和哺乳动物细胞等。
本发明所指微生物以及其相关分子模式是真菌、革兰阳性菌和革兰阴性菌以及其相关分子模式。为使本专业技术人员更全面、清晰理解本发明,以毕赤酵母、白色念珠菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、藤黄微球菌、枯草芽孢杆菌等作为微生物(真菌、革兰阳性菌和革兰阴性菌)代表来描述下面的内容,以Lys-PGN、DAP-PGN、脂磷壁酸、甘露聚糖、β-1,3-葡聚糖、脂多糖等作为微生物相关分子模式代表来描述下面的内容,而选择上述具体的微生物或具体的微生物相关分子模式作为代表来描述并不是以任何方式限制本发明权利要求的范围。
二apoLp-II/I结构解析以及其基因序列解析
按照常规蛋白质化学与分子生物学的技术、方法、手段,对apoLp-II/I进行结构解析。包括:(1)利用生物质谱测定天然apoLp-II/I的分子量;(2)采用常规蛋白水解酶及其水解条件,针对发明内容所获得apoLp-II/I进行降解,通过HPLC分离降解片段,利用生物质谱或Edman降解方法解析部分氨基酸序列,从而获得apoLp-II/I分子内许多片段的氨基酸序列;(3)利用分子生物学技术、方法,从昆虫脂肪体提取总RNA,利用RACE技术构建昆虫cDNApool。根据目的蛋白降解片段的氨基酸序列,设计引物,PCR扩增片段基因。随后结合RACE技术获得apoLp-II/I基因—cDNA,通过基因序列测定分析获得其碱基序列并由其开放阅读框碱基序列推导获得apoLp-II/I全长一级结构;(4)利用分子生物学技术、方法等,从昆虫脂肪体提取其染色体基因。设计PCR扩增上下游引物,以昆虫染色体基因为模板,PCR扩增apoLp-II/I染色体基因,通过基因序列测定分析获得apoLp-II/I染色体基因中的内含子、外显子序列;(5)通过上述所获得apoLp-II/I的分子量、分子内部分氨基酸序列、cDNA开放阅读框序列、染色体基因中的外显子序列,彼此相互验证上述结构信息,获得apoLp-II/I全长一级结构序列、天然apoLp-II/I一级结构序列(参见SEQ ID:1和ID:2)。
三、重组apoLp-II/I活性片段的制备
本发明还包含具有apoLp-II/I序列的重组apoLp-II/I活性片段。
所述的重组apoLp-II/I活性片段含有apoLp-II序列,包括Met-apoLp-II成熟肽氨基酸序列、Met-组氨酸标签-apoLp-II成熟肽氨基酸序列、Met-apoLp-II成熟肽-His6标签氨基酸序列、Met-His6标签-凝血酶酶切位点-apoLp-II成熟肽氨基酸序列(参见SEQ ID:3-6)。
本发明的重组apoLp-II/I部分片段通过基因工程表达制备获得,通过如下技术方案实现,包括:(1)将apoLp-II/I部分片段编码DNA重组至表达载体;(2)用步骤⑴的重组表达载体转化适当的宿主细胞(原核或真核细胞);(3)在适合的诱导表达条件下,培养步骤⑵的被转化的宿主细胞;(4)收获并纯化所得到的目的蛋白。
本发明同时提供上述重组apoLp-II/I部分片段的表达产物分离纯化方法。可使用盐析沉淀、超滤、亲和层析、离子交换层析、疏水作用层析和凝胶过滤等方法以及上述方法的多种组合,从基因工程细胞的溶胞产物或培养液中分离并纯化所需的表达产物。在表达产物的分离和纯化过程中,可使用十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳法(SDS-PAGE)、酶联免疫吸附法(ELISA)或蛋白免疫印迹法(Western)检测表达产物的存在及相应分子大小。
四、apoLp-II/I及其部分片段的生物学功能及其应用
本发明再一个目的是针对天然、重组apoLp-II/I部分片段的体外结合特异性、对微生物的结合与凝集作用以及对激活酚氧化酶原激活系统的激活情况、对抗菌肽合成的激活作用的对比,确定了天然、重组apoLp-II/I部分片段的生物活性。同时,考察apoLp-II/I在机体免疫应答过程的表达,也研究了天然、重组APOLP-II/I部分片段的应用。
此外,本发明也研究了天然、重组apoLp-II/I及其部分片段作为抗原刺激机体产生抗体、抗体的制备以及其应用。
本发明所述的天然、重组apoLp-II/I及其部分片段获得方法常规、简单、产量高。
附图说明:
图1为分离纯化天然apoLp-II/I电泳图谱
A:实施例1中方法-1分离获得天然apoLp-II/I的电泳图谱;
B:实施例1中方法-2分离获得天然apoLp-II/I的电泳图谱;
C:实施例1中方法-3分离获得天然apoLp-II/I的电泳图谱。
图2为分离纯化重组apoLp-II/I部分片段(原核表达体系)电泳图谱
泳道1:实施例3中方法-(1)所获得重组apoLp-II/I部分片段的电泳图谱;
泳道2:实施例3中方法-(2)所获重组apoLp-II/I部分片段的电泳图谱;
泳道3:实施例3中方法-(3)所获重组apoLp-II/I部分片段的电泳图谱。
图3为分离纯化重组apoLp-II/I部分片段(真核表达体系)电泳图谱
泳道1:实施例4中方法-(1)所获重组apoLp-II/I部分片段的电泳图谱;
泳道2:实施例4中方法-(2)所获重组apoLp-II/I部分片段的电泳图谱。
图4为天然apoLp-II/I及重组apoLp-II/I部分片段的生物学活性
4-A:实施例6中天然apoLp-II/I与微生物的结合特异性;
4-B:实施例6中天然apoLp-II/I与微生物相关分子模式的结合特异性;
4-C:实施例6中重组apoLp-II/I部分片段与微生物的结合特异性;
4-D:实施例6中apoLp-II/I的表达量与先天性免疫的相关性;
4-E:实施例6中体外抑制天然apoLp-II/I及重组apoLp-II/I部分片段活性对酚氧化酶原激活系统的影响;
4-F:实施例6中体内干扰apoLp-II/I表达对酚氧化酶原激活系统的影响。
具体实施方式:
下面的实施例可以使本专业技术人员更全面地理解本发明,而不是以任何方式限制本发明权利要求的范围。
实施例1
天然apoLp-II/I的分离纯化
1.方法1
收取血淋巴,12000×g离心后取上清。进行40%硫酸铵沉淀;离心取沉淀用50mM柠檬酸缓冲溶液pH5.2,100mM NaCl,5%甘油进行复溶;离心后取上清,过Sephacryl S-200柱,收集含有目的蛋白的流出组分;该组分用50mM PB pH8.0透析后,经HiTrapTM SP柱以0-1M NaCl梯度洗脱,收集含目的蛋白的流出组分。
试验结果如图1-A泳道7,其中箭头1所指为载脂蛋白I、箭头2所指为载脂蛋白II,天然apoLp-II/I的纯度达到电泳纯。
2.方法2
柞蚕血淋巴使用70%硫酸铵沉淀,然后于4℃,8000×g离心15min。弃上清沉淀用50mM MES,200mM NaCl,2mM DTT,5%甘油,pH6.2复溶并透析。透析后样品过磷酸纤维素柱,用200mM-600mM NaCl梯度洗脱,收集含目的蛋白的组分。上述组分用50mM MES,100mMNaCl,2mM DTT,5%甘油,pH6.2透析,透析后样品于4℃,8000×g离心15min。除去沉淀。上清组分过Mono S柱,用150mM-600mM NaCl梯度洗脱,收集含目的蛋白组分上述组分过SuperdexTM 200柱(50mM MES,200mM NaCl,2mM DTT,5%甘油,pH6.2),收集含目的蛋白组分。
试验结果如图1-B泳道4,其中箭头1所指为载脂蛋白I、箭头2所指为载脂蛋白II,天然apoLp-II/I的纯度达到电泳纯。
3.方法3
柞蚕血淋巴使用70%硫酸铵沉淀,然后于4℃,8000×g离心15min。弃上清沉淀用磷酸盐缓冲溶液复溶,上羟基磷灰石柱,用磷酸根离子梯度洗脱,收集含目的蛋白组分;上述组分用磷酸盐缓冲溶液透析,上阴离子交换柱HiTrapTM Q,使用NaCl浓度梯度进行洗脱,收集含目的蛋白组分;上述组分添加(NH4)2SO4至浓度为2M,上苯基疏水柱,使用(NH4)2SO4浓度降低梯度进行洗脱,收集含目的蛋白组分;上述组分上凝胶过滤柱Sephacryl>
试验结果如图1-C泳道5,其中箭头1所指为载脂蛋白I、箭头2所指为载脂蛋白II,天然apoLp-II/I的纯度达到电泳纯。
实施例2:
apoLp-II/I结构解析以及其基因序列解析
按照常规蛋白质化学与分子生物学的技术、方法、手段,对apoLp-II/I进行结构解析。具体方法、手段按照发明内容二中所列内容实施。
获得apoLp-II/I完整核苷酸序列及其氨基酸序列(如SEQ ID:1和ID:2所示)。
实施例3:
利用原核生物表达系统获得重组apoLp-II/I活性片段
本实施例列举描述原核生物表达系统表达本发明apoLp-II/I活性片段基因的构建策略和基本方法。
原核生物表达系统的表达载体、表达宿主细胞以及表达策略,均为基因工程表达的常规、通用的表达载体、表达宿主细胞以及表达策略。
本实施是为使本专业技术人员更全面地理解本发明,而不是以任何方式限制本发明特批权利要求的范围。
对于表达产物的分离纯化方法,是采用实施例1的方法、原理、策略等。
1.apoLp-II/I活性片段的表达载体构建
根据天然apoLp-II/I中N末端apoLp-II的氨基酸序列,分别设计相应寡核苷酸引物,同时在上述两个寡核苷酸引物的5′端,分别加上限制性核酸内切酶水解位点序列;以昆虫脂肪体cDNA pool为模板进行PCR扩增,琼脂糖凝胶电泳检测产物并进行核酸片段的凝胶回收;经过限制性核酸内切酶酶切后与同样进行双酶切表达质粒,在DNA连接酶的作用下进行重组连接,热转化大肠杆菌感受态细胞;经过菌落PCR和限制性核酸内切酶酶切验证筛选获得阳性转化子后提交生物技术服务公司进行DNA序列测定。通过上述基因工程的方法,构建apoLp-II基因的表达载体。
本实施例表达载体构建的特征:1。以大肠杆菌为宿主,表达载体可选择pTYB11、pMAL-C2X、pET-28a、pGEX-2T、pBV220、pQE30、pET20b等;2.可以在apoLp-II的N端前融合一段肽段作为亲和层析的标签(Tag);3.可以在apoLp-II的C段后融合一段肽段作为亲和层析的标签(Tag);4.标签可以选择His-Tag(连续六个及以上组氨酸)、GST-Tag、Flag-Tag等;5.可以在亲和层析标签与apoLp-II之间,添加蛋白水解酶水解位点的氨基酸序列,如凝血酶、肠激酶、凝血X因子等,以获得与天然apoLp-II蛋白结构一致的重组apoLp-II蛋白。
2.重组apoLp-II/I活性片段的获得
利用基因工程技术,将含有apoLp-II/I基因中apoLp-II核苷酸序列的表达载体转化大肠杆菌,挑取单菌落后接种至含抗生素的LB,诱导apoLp-II基因的表达,从而获得含有apoLp-II的培养液或菌体。含有apoLp-II的菌体首先经裂解液裂解、超声破碎,释放目的蛋白后利用离心方法收集上清液作为重组APOLP-II/I的原料液备用。
重组目的基因表达的特征:1.表达载体转化进入宿主的方式可以选择热转化法和电转化方法;2.诱导表达的方式包括化学诱导—异丙基β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导和加温诱导;3.apoLp-II基因可表达于细胞内或细胞外;3.存在于细胞内的apoLp-II需通过裂解液裂解、超速破碎等方式,将目的蛋白释放至溶液中。
按照实施例1的方法、原理、策略等,从上述含apoLp-II的原料液中分离纯化重组apoLp-II至需要的纯度,直至达到电泳纯或HPLC纯。
例如:
(1)采用pTYB11构建无标签apoLp-II表达载体,采用电转化方法将表达载体转入宿主细胞,经IPTG诱导,apoLp-II表达于细胞内。采用裂解缓冲液重悬菌体,进行超声破碎,离心获得上清液作为进一步分离纯化apoLp-II的原料液。按照实施例1的方法、原理、策略等,分离纯化apoLp-II至电泳纯(图2-泳道1)。
(2)采用pET-28a构建N端前融合组氨酸标签的apoLp-II基因,热转化大肠杆菌,经IPTG诱导,His-apoLp-II表达于细胞内。采用裂解缓冲液(50m mol/LPBS,0.15mol/L NaCl,50m mol/L咪唑)重悬菌体,进行超声破碎,离心获得上清液作为进一步分离纯化apoLp-II的原料液。按照实施例1的方法、原理、策略等,分离纯化apoLp-II至电泳纯(图2-泳道2)。
(3)采用pET20b构建C端后融合组氨酸标签的apoLp-II基因,采用电转化方法将表达载体转入宿主细胞,经加温诱导表达,apoLp-II-His表达于胞外。按照实施例1的方法、原理、策略等,分离纯化apoLp-II至电泳纯(图2-泳道4)。
上述表达重组的apoLp-II结构如SEQ ID:3-5所示,分离纯化获得的重组表达产物,经过SDS-PAGE验证其纯度如图2所示。
上述含标签的纯化后表达产物经过上述常规、通用的蛋白水解酶(如凝血酶、肠激酶、凝血X因子等)的水解作用,去除表达产物中的融合肽段,再经分离纯化从而获得apoLp-II,该重组apoLp-II的结构与天然apoLp-II的结构相同。
实施例4:
利用昆虫细胞表达系统获得重组apoLp-II/I活性片段
本实施例列举描述昆虫细胞表达系统表达本发明apoLp-II/I活性片段基因的构建策略和基本方法。
昆虫细胞表达系统的表达载体、表达宿主细胞以及表达策略,均为基因工程表达的常规、通用的表达载体、表达宿主细胞以及表达策略。
本实施例是使本专业技术人员更全面地理解本发明,而不是以任何方式限制本发明特批权利要求的范围。
对于表达产物的分离纯化方法,采用实施例1的方法、原理、策略等。
1.利用pMIB/V5-His-Sf21昆虫表达体系获得重组apoLp-II/I活性片段
将apoLp-II/I活性片段基因(apoLp-II基因)连接到pMIB/V5-His质粒中,构建pMIB/V5-His-凝血酶酶切位点-apoLp-II重组表达质粒。转座大肠杆菌DH5,Blue-gal和IPTG诱导后,蓝白筛选获得转座重组bacmid。转染昆虫细胞Sf21,Western blot验证重组apoLp-II在细胞内表达。
收集细胞,用裂解缓冲液(0.05mol/L Tris-HCl,0.5mol/L NaCl,pH 8.0)重悬,超声破碎后离心得到含有目的蛋白的原料液。直接上样于预先平衡好的金属离子螯合层析柱,经过0.02mol/L咪唑(pH 8.0)充分洗涤去除大量杂蛋白后,用0.2mol/L咪唑(pH 8.0)进行洗脱,重组蛋白质获得高效表达,达到电泳纯度。表达产物的结构如SEQ ID:6所示,纯化后的电泳鉴定结果如图3-泳道1。
2.利用pFastBac1-sf9昆虫表达体系获得重组apoLp-II/I活性片段
将apoLp-II/I活性片段基因(apoLp-II基因)连接到pFastBac1质粒中,构建pFastBac1-apoLp-II重组表达质粒。转座大肠杆菌DH10,Blu-gal和IPTG诱导后,蓝白筛选获得转座重组bacmid。转染昆虫细胞sf9,Western blot验证重组apoLp-II在细胞内表达。
收集细胞,用裂解缓冲液(0.05mol/L Tris-HCl,0.5mol/L NaCl,pH 8.0)重悬,超声破碎后离心得到含有目的蛋白的原料液。直接上样于抗apoLp-II抗体—sepharose CL-6B为配基的亲和层析柱,采用0mol/L-3mol/L NaCl的裂解缓冲液进行梯度洗脱,重组蛋白质获得高效表达,达到电泳纯度。表达产物的结构如SEQ ID:3所示,纯化后的电泳鉴定结果如图3-泳道2。
实施例5:
apoLp-II/I及其活性片段抗体的获得
按照常规、通用的抗体产生的技术,利用实施例1、3、4获得的各种apoLp-II/I及其活性片段作为抗原,刺激小鼠或大鼠或家兔或犬或羊或马或牛的免疫系统产生相应抗体。
利用常规、通用的抗体检测方法,检测被免疫小鼠或大鼠或家兔或犬或羊或马或牛的血清中apoLp-II/I抗体产生情况。
当被免疫小鼠或大鼠或家兔或犬或羊或马或牛产生apoLp-II/I抗体体后,采用常规、通用的动物血清采集与存储方法,采集被免疫小鼠或大鼠或家兔或犬或羊或马或牛的血清并存储,该血清可以直接应用。
利用常规、通用的抗体分离纯化技术,如盐析、各种类型层析介质、抗体亲和层析介质等,从存储的含有apoLp-II/I抗体的血清中分离纯化不同纯度的apoLp-II/I抗体,直至获得电泳纯或HPLC纯的apoLp-II/I抗体,以适于不同要求的应用。
实施例6:
天然apoLp-II/I及重组apoLp-II/I部分片段的生物学活性
为使本专业技术人员更全面地理解本发明,而不是以任何方式限制本发明特批权利要求的范围。本实施例中天然apoLp-II/I、重组apoLp-II/I活性片段具有相同的生物活性。以柞蚕作为鳞翅目昆虫的生物活性实验昆虫为代表进行描述。本专业技术人员可以以天然apoLp-II/I、重组apoLp-II/I活性片段的生物活性为核心与基础,进一步拓展天然apoLp-II/I、重组apoLp-II/I活性片段的应用范围。
1.天然apoLp-II/I及重组apoLp-II/I部分片段与微生物及其相关分子模式的结合特异性
(1)天然apoLp-II/I与微生物的结合特异性
采用western blotting方法考察天然apoLp-II/I与革兰阳性菌(金黄色葡萄球菌和藤黄微球菌)、革兰阴性菌(大肠杆菌和绿脓假单胞杆菌)和真菌(白色念珠菌和酿酒酵母)的结合特性。利用天然apoLp-II/I分别与等量的微生物孵育,采用1MNaCl洗脱后,在高温条件下2%SDS再次洗脱组分,利用apoLp-II/I多克隆抗体间接检测天然apoLp-II/I与不同种类微生物的结合情况。结果如图4-A所示,天然apoLp-II/I与大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和藤黄微球菌、酿酒酵母结合,而与绿脓假单胞杆菌、白色念珠菌不结合。
(2)天然apoLp-II/I与微生物相关分子模式的结合特异性
采用间接酶联免疫吸附法(ELISA)检测天然apoLp-II/I对6种可溶性的,分别来自不同种微生物的典型分子模式(PAMP)的识别能力。Lys-PGN和LTA属于革兰阳性菌的特异PAMPs,DAP-PGN和LPS属于革兰阴性菌的特异PAMPs,laminarin(可溶性β-1,3葡聚糖)和Mannan属于真菌的特异PAMP。不同浓度的PAMPs被包被在96孔板上,依次将天然apoLp-II/I,兔源抗apoLp-II/I多克隆抗血清(一抗)以及偶联有辣根过氧化酶的山羊抗兔IgG(二抗)加入96孔板孵育并彻底洗涤未结合组分,最后加入辣根过氧化酶底物,检测在450nm下底物显色的光吸收情况。如图4-B所示,天然apoLp-II/I对Lys-PGN、LTA和DAP-PGN的结合具有浓度依赖性和饱和性,属于特异性结合。天然apoLp-II/I对LPS、可溶性β-1,3葡聚糖和Mannan不具有结合能力。
(3)重组apoLp-II/I部分片段与微生物的结合特异性
按照实施例6中1-(1)中所述western blotting方法考察重组apoLp-II/I部分片段(包含apoLp-II基因)与革兰阳性菌(金黄色葡萄球菌和藤黄微球菌)、革兰阴性菌(大肠杆菌)和真菌(酿酒酵母)的结合特性。以重组apoLp-II-His为例,结果如图4-C所示,重组apoLp-II-His与上述三种微生物均具有结合作用,该实验结果与天然apoLp-II/I的实验结果一致。
上述实验说明,天然apoLp-II/I可能通过特异性识别典型分子模式而与革兰阳性菌、部分革兰阴性菌、部分真菌发生特异性结合。采用实施例3、4中所述重组apoLp-II/I部分片段可获得相同的实验结果。
2.apoLp-II/I的表达量与先天性免疫的相关性
取五龄期柞蚕幼虫,一组未处理,一组为注射20μl金黄色葡萄球菌(OD600=0.8)12小时后,解剖后分别取表皮、脂肪体、马氏管、中肠,于液氮中研磨,然后取约100μl样品,加入1ml Trizol溶液充分混匀。另取血细胞约100μl直接加入1ml Trizol溶液充分混匀。上述组分提取总RNA,经逆转录后进行Real-time PCR检测apoLp-II/I的表达量。如图4-D所示,apoLp-II/I在脂肪体和表皮中表达,其中脂肪体的表达量最大;apoLp-II/I的表达量因金黄色葡萄球菌的作用而显著增加。上述结果说明,apoLp-II/I与昆虫先天性免疫具有相关性。
3.天然apoLp-II/I及重组apoLp-II/I部分片段对酚氧化酶原激活系统的影响
(1)体外抑制天然apoLp-II/I及重组apoLp-II/I部分片段活性对酚氧化酶原激活系统的影响
将血淋巴首先与apoLp-II/I抗体共孵育,以封闭血淋巴中apoLp-II/I的生物学功能,利用6种微生物相关分子模式—Lys-PGN、LTA、DAP-PGN、LPS、laminarin、和Mannan分别激活血淋巴,比较apoLp-II/I抗体封闭前后,血淋巴中酚氧化酶原激活系统受6种微生物相关分子模式的激活情况。结果如图4-E所示,apoLp-II/I抗体封闭后,6种微生物相关分子模式对血淋巴中酚氧化酶原激活系统的激活作用均有不同程度的提高。采用实施例3、4中所述重组apoLp-II/I部分片段可获得相同的实验结果。
(2)体内干扰apoLp-II/I表达对酚氧化酶原激活系统的影响
以dsEGFP为阴性对照,采用显微注射法将apoLp-II/I特异性dsRNA导入柞蚕幼虫体内,经24h诱导后,收集血淋巴后分别加入微生物相关分子模式-可溶性β-1,3葡聚糖、Lys-PGN和DAP-PGN,通过测定PO的活力以判断apoLp-II/I对酚氧化酶原激活系统的影响。如图4-F所示,apoLp-II/I表达量的降低能够体外显著增强三种微生物相关分子模式对血淋巴酚氧化酶原的激活情况。
实施例7:
天然apoLp-II/I、重组apoLp-II/I活性片段及其抗体的应用
为使本专业技术人员更全面地理解本发明,而不是以任何方式限制本发明特批权利要求的范围,本实施例以apoLp-II/I的生物活性为代表进行描述,apoLp-II/I活性片段也具有相同的生物活性。同时也以柞蚕作为鳞翅目昆虫的生物活性实验昆虫为代表进行描述。本专业技术人员可以以apoLp-II/I及重组apoLp-II/I活性片段及其抗体的生物活性为核心与基础,进一步拓展apoLp-II/I及重组apoLp-II/I活性片段及其抗体的应用范围。
1.apoLp-II/I及其活性片段抑制酚氧化酶原激活系统
如实施例6中所描述,apoLp-II/I及其活性片段可以抑制酚氧化酶原的激活,基于此,可应用于利用酚氧化酶及酚氧化酶原激活系统的相关领域。
2.apoLp-II/I及其活性片段用于微生物的检测
如实施例6中所描述,apoLp-II/I及其活性片段能够与部分微生物及相关分子模式结合,基于此,通过检测微生物与apoLp-II/I及其活性片段是否结合,检测样品中是否含有微生物或其相关分子模式。
3.apoLp-II/I及其活性片段抗体的应用
针对实施例5获得的apoLp-II/I及其活性片段作的抗体,利用免疫学以及分子生物学等常规、通用技术、方法等,通过apoLp-II/I及其活性片段的抗体,用于鳞翅目昆虫样品的apoLp-II/I免疫检测。同样,也适用于从鳞翅目昆虫分离纯化制备apoLp-II/I过程中的免疫检测跟踪分析以及样品的定性、定量检测分析。此方面的实验已经在上述的天然、重组apoLp-II/I活性片段分离纯化制备过程中的实施例应用。
在任何待检测微生物的样品中,加入足够剂量的apoLp-II/I及其活性片段抗体。按照本实施例中的apoLp-II/I及其活性片段用于微生物的检测所述方法,进行待检测样品的微生物检测。同上结果,即便是样品中有能够被检测出微生物的量也不能检测出(阴性结果),此实验的设计作为样品微生物检测的阴性对照组加以应用。
如实施例6中所描述,apoLp-II/I及其活性片段可以抑制酚氧化酶原的激活,而利用apoLp-II/I及其活性片段的抗体封闭apoLp-II/I,能够显著提高酚氧化酶的活性。基于此,可通过利用apoLp-II/I及其活性片段抗体调整酚氧化酶的活性,进而可应用于利用酚氧化酶及酚氧化酶原激活系统的相关领域。
上述结果表明:apoLp-II/I及其活性片段的抗体,通过与apoLp-II/I及其活性片段的结合而屏蔽了与微生物及其相关分子模式的结合生物活性,从而使apoLp-II/I及其活性片段失去了原有的生物活性。基于这种结合屏蔽作用原理可以广泛应用。
SEQUENCE LISTING
<110>沈阳药科大学
<120>载脂蛋白-II/I及其功能、制备方法和应用
<160>10
<210>1
<211>10278
<212>DNA
<213>柞蚕(Antheraea pernyi)
<220>
<221> mRNA
<222> (1)...(10278)
<220>
<221> CDS
<222> (93)...(10010)
<220>
<221> 5'UTP
<222> (1)...(92)
<220>
<221> sig_peptide
<222> (93)...(164)
<220>
<221> mat_peptide
<222> (165)...(10007)
<220>
<221> 3'UTP
<222> (10011)...(10278)
<400>1
attacttctc gctgaggtat aggcatcgga ccatagtatc tgcgtacaag actgacttat 60
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atatcatcgt aactcatgga gaattcaagg tcactgataa tgacggcaag ggtaatggaa 4440
tgatcatagt ggagttcaaa aaactacaac gtaaaataaa aggtgacgtc aaattcgtct 4500
ctaaggaccc ggtcttcatt accgacattg agttatacct cgattttgaa aagaataaca 4560
acaacaaatt ccacttcgta acgaataatc ggaagactca gaagctcgtt tcttccaaga 4620
acaaggttga gtacgatggt aaagttaccg aagtgaacta cgtacaagaa ggagttttct 4680
ctataactgg aaaaaccaat ctcaactttg acgtagtact cccaacagaa agatgtatta 4740
gcttgaagat agaccgcgat gtagccttga aagatggtaa atatagtgga catgcagagt 4800
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ataacgatcc atttatagta gatttcaatt acaagagaga cagccaaggt gacaaaaata 5460
acaactttgt ggaagttaaa gcaaaatacg gcaagggcaa gactacttcg ctttcaattg 5520
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tagacaatat ttacaaaatc tgcttcgacg ttgtggccga gggtagtgtg cagaaagaca 5880
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cttatgtcta ctgtgaagag aagaagcaat gcgctcatgc tgaaatacaa tcaaagatcg 6300
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ctgaaacacc attcgtaaag gtattgcaca tcgacgctgg cttcacatca accccggagc 6960
agagaactta ccagtcacta ttcagcgttt gcctactgga aggcaatgtg gttcaaataa 7020
aaacactgct caaggacttc caatatttcg aattcacaac agaggaatcc ggctgcaaat 7080
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tatctggagg caagaagaac atcgctcacg gtgctttgtt ccttaaagac aacacgattc 7200
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taaaagaata cttggatgct gccatcgaag ttgttgcaca tttaggcgca cttgtcagtg 7680
acttcttcga gaaacataag caagaacttc agcaactgac caacgtcatg actgaaatat 7740
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aggtgtatgg ggaactcgtc caactaataa acaacatgcc gatcattgag gctattaaag 7860
aggagtggaa ggatggttta ccaaaggacc aaatactcgg aatgtgcaac caaggttacg 7920
ccgctatata ccaagtgctt ccaaataagg aattcaaaga ttttgctgaa gctttgaaca 7980
attacgtgat caagaaactc cgttcggaac aaatcgatga cgcaaaatcg ctgcaggtca 8040
tttaccaaaa gctgattgca gcgttcagtt cgctgtcaca attcatccca tcacagatta 8100
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gcaaacatct gaccttcccc gggcagtgcc gctacgtgct gattcacaac tatgtcgaca 8400
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acaagagtgg aactatcatt gagctcaagg acaatggaca ggtgacacta aacggagctg 8520
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tcggcaacgg gtacggtcta gtacacagct gtccgaaagt ccaggctccg gagcactccc 8820
accaccagat gcacgccgcc cttccaccag catgtgaaca ggtgttcgga ggaatctccc 8880
cgctgcggcc cgtcagccta ctacttgacg tatcgccatt cagacaagcg tgcatccacg 8940
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aattggtaat gccacttgta acacaactag tcgataatct gaagaagaag cagattacag 9240
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tcgatttcac tcaagcggtt gatggcctcg tgttctcttc aacgaactac ttgaaactag 9840
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cgaaggcgca tctcgtgcaa gaatgcacgt gtacatacgt tgatccgttc cgcgtgcgct 9960
ctgcttgctt caccagagaa aagaaagaag ttgctcgcag gcgaaagtaa gcgcgtaaga10020
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tacctgtgtc ttgctctttc attcattaaa caatgccatc aagtgaattc ttagttattt10140
atgatgccgt ctctctcaga aggtattatt taatcatgtc atttgtatta caattaataa10200
taaaaaatta tatattattc aaaaaaaaaa aaaaaaagat atcggatccg aattccgaat10260
ctctagagga tccccggg10278
<210>2
<211>3305
<212>PRT
<213>柞蚕(Antheraea pernyi)
<400>2
Met Gly Lys Ser Arg Leu Ser Leu Phe Ser Val Ile Leu Ile Ile Ser
1 5 1015
Val Leu Trp Lys Pro Val Tyr Ser Lys Asp Lys Cys Ser Ile Glu Cys
202530
Gln Gly Ser Pro Ser Asn Pro Ala Phe Val Gln Gly Asn Lys Tyr Ser
354045
Tyr Ser Val Glu Gly Thr Val Thr Ile Phe Leu Ser Pro Ala Asp Asp
505560
Gln Val Thr Ser Val Lys Leu Ile Gly Gln Val Ser Val Asp Ala Leu
65707580
Ala Asn Cys Val His Glu Leu Ser Val Gln Asn Leu Val Ile Ser Gly
859095
Pro Asp Gly Lys Lys Tyr Gln Pro Pro Pro Gly Ile Asp Lys Val Val
100 105 110
Arg Phe Gly Phe Gln Asp Gly Arg Val Gly Pro Glu Ile Cys Ala His
115 120 125
Gly Asp Asp Thr Arg Arg Ser Leu Asn Ile Lys Arg Ala Ile Ile Ser
130 135 140
Leu Leu Gln Thr Glu Gln Lys Pro Ser Thr Gln Val Asp Val Phe Gly
145 150 155 160
Val Cys Pro Thr Glu Val Ser Ser Ser Gln Glu Gly Ser Ala Val Leu
165 170 175
Val His Arg Thr Arg Asp Leu Ser Arg Cys Ser His Arg Glu Gln Gly
180 185 190
Lys Asn Asp Ile Ile Thr Ser Ile Thr Asn Pro Asp Ala Gly Ile Lys
195 200 205
Asp Met Gln Val Leu Gln Ser Ile Leu Asn Val Glu Ser Lys Val Asn
210 215 220
Ser Gly Val Pro Glu Lys Val Ser Ala Thr Glu Glu Tyr Leu Tyr Lys
225 230 235 240
Pro Phe Ser Val Gly Glu Asn Gly Ala Arg Ala Lys Val His Thr Lys
245 250 255
Leu Thr Leu Thr Gly Lys Ser Ser Cys Gly Gln Gly Val Ala Tyr Cys
260 265 270
Thr Glu Ser Arg Ser Ile Ile Phe Asp Asn Pro His Gly Val Lys Pro
275 280 285
Val Pro Gly Asn Ala Asn Ser Ala Leu Ala Ala Val Lys Asp Val Ala
290 295 300
Lys Ser Val Ser Ser Ile Val Glu Ser Lys Ser Ala Gly Ala Phe Ala
305 310 315 320
Gln Leu Ile Arg Ile Leu Arg Ile Thr Ser Lys Asp Asp Leu Met Lys
325 330 335
Val Tyr Ser Gln Val Lys Gly Ser Asn Leu Glu Lys Arg Val Phe Leu
340 345 350
Asp Ala Leu Leu Arg Ala Gly Thr Gly Asp Ser Ile Glu Ala Ser Ile
355 360 365
Asn Ile Leu Lys Ser Arg Glu Leu Gly Gln Leu Glu Gln Gln Leu Val
370 375 380
Tyr Leu Ser Leu Gly Asn Ala Arg His Val Asn Asn Ala Ala Leu Lys
385 390 395 400
Ala Ala Ala Ser Leu Leu Asp Gln Pro Asn Leu Pro Lys Glu Val Tyr
405 410 415
Leu Gly Val Gly Ala Leu Ala Gly Ala Tyr Cys Arg Glu His Glu Cys
420 425 430
His Thr Thr Lys Pro Val Gly Ile Val Ala Leu Ser Gln Lys Leu Gly
435 440 445
Ala Lys Leu Gln Asn Cys Arg Pro Arg Ser Lys Thr Glu Glu Asp Thr
450 455 460
Ile Val Ala Ile Leu Lys Gly Ile Arg Ser Ile Arg His Leu Glu Asp
465 470 475 480
Ser Leu Ile Asn Lys Ile Val His Cys Ala Ala Asp Asn Asn Val Lys
485 490 495
Ala Ser Val Lys Ala Ala Ala Leu Glu Ala Phe His Ala Asp Pro Cys
500 505 510
Ser Ala Ala Ile Lys Lys Thr Ala Ile Glu Ile Met Lys Asn Arg Gln
515 520 525
Leu Asp Ser Glu Ile Arg Ile Lys Ala Tyr Leu Ala Val Ile Gln Cys
530 535 540
Pro Cys Gly Gln Ser Ala Asn Glu Ile Lys Asn Leu Leu Asp Thr Glu
545 550 555 560
Pro Val His Gln Val Gly Asn Phe Ile Ser Thr Ser Leu Arg Tyr Ile
565 570 575
Arg Thr Ser Ala Asn Pro Asp Lys Gln Leu Ala Arg Gln His Tyr Gly
580 585 590
Leu Ile Arg Thr Pro Asn Lys Phe Asn Ser Asp Asp Arg Lys Tyr Ser
595 600 605
Phe Tyr Arg Glu Thr Ser Phe Asn Ile Asp Ala Leu Gly Ala Gly Gly
610 615 620
Ser Val Asp Gln Thr Val Ile Tyr Ser Gln Asp Ser Tyr Leu Pro Arg
625 630 635 640
Glu Ala Ser Val Asn Leu Thr Val Glu Leu Phe Gly His Ser Tyr Asn
645 650 655
Val Leu Glu Leu Gly Gly Arg Gln Gly Asn Leu Asp Arg Val Ile Glu
660 665 670
His Phe Leu Gly Pro Lys Gly Tyr Phe Arg Thr Ser Asp Pro Gln Ala
675 680 685
Leu Tyr Asp Asp Leu Val Lys Arg Tyr Glu Glu Ser Lys Asn Lys Val
690 695 700
Gln Arg Gly Phe Gly Arg Gly Arg Arg Ser Ile Lys Asn Glu Ile Asp
705 710 715 720
Asn Phe Asp Lys Asn Leu Lys Ala Glu Ser Asn Ser Tyr His Asn Glu
725 730 735
Leu Asp Leu Asp Ile Tyr Val Lys Phe Phe Gly Thr Asp Ala Val Phe
740 745 750
Leu Ser Phe Gly Asp Asp Lys Gly Phe Asp Phe Asn Lys Ile Leu Asp
755 760 765
Glu Ile Leu Gly Thr Cys Asn Ser Gly Ile Asn Lys Leu Lys His Phe
770 775 780
Gln Gln Glu Leu Arg Thr His Leu Leu Phe Met Asp Ala Glu Leu Ser
785 790 795 800
Tyr Pro Thr Ser Val Gly Leu Pro Leu Arg Leu Asn Leu Val Gly Ser
805 810 815
Leu Thr Ala Arg Leu Asp Val Ala Thr Asn Val Asp Ile Gln Glu Ile
820 825 830
Met Lys Ser Pro Gln Ser Ala Lys Val Asp Val Lys Phe Val Pro Ser
835 840 845
Thr Asp Val Glu Ile Ala Gly Ala Leu Leu Ile Asp Ala Asp Ser Val
850 855 860
Thr Thr Gly Leu Lys Val Ile Thr Asn Leu Arg Ser Ser Thr Gly Leu
865 870 875 880
His Val Ile Ala Lys Val Ile Glu Asn Gly Arg Gly Phe Asp Leu Gln
885 890 895
Leu Gly Leu Pro Val Asp Lys Gln Glu Ile Leu Val Ala Ser Asn Glu
900 905 910
Leu Val Tyr Val Thr Ala Glu Lys Gly Gln Arg Glu Lys Gln Thr Lys
915 920 925
Ile Lys Thr Gly Gln Ser Met His Asp Tyr Ser Pro Cys Phe Asp Gln
930 935 940
Leu Ser Gly Val Leu Gly Leu Thr Leu Cys Gly His Phe Ser Leu Pro
945 950 955 960
Phe Ser Ile Ser Asn Arg Glu Lys Pro Ser Asp Gln Ile Ile Ser Gln
965 970 975
Phe Phe Asn Arg Phe Pro Leu Ser Gly Thr Ala Ser Ala Lys Ile Val
980 985 990
Leu Glu Lys Asn Asp Leu Ser GlyTyr His Ile Lys GlyVal Val Arg
995 1000 1005
Glu AspAla Ala Ala Gly LysLys Ser Phe Glu PheLeu Phe Asp
1010 1015 1020
Ala GluGly Ser Gln Asn ArgHis Thr Lys Leu ThrGly Gln Tyr
1025 1030 1035
Val TyrAsn Ser Asn Glu IleGly Val Lys Leu GluLeu Gln Ser
1040 1045 1050
Pro IleLys Asn Leu Tyr GlyGlu Ile Ser Ala CysAsn Asn Pro
1055 1060 1065
Arg GluLeu Met Ala Lys TyrVal Gly Arg Val AspSer Met Glu
1070 1075 1080
Tyr LysGly Arg Ile Gly PheThr Val Gln Gly AsnGlu Gln Arg
1085 1090 1095
Ser ValTyr Arg Pro Val PheGlu Tyr Ser Ile ProAsp Gly Ser
1100 1105 1110
Gly GlnThr His Ser Ala GluIle Val Gly Glu ValIle Lys Glu
1115 1120 1125
Thr SerGly Arg Lys Ser LysTyr Thr Ala Arg GlyLeu Gln Ile
1130 1135 1140
Pro MetAla Lys Gly Gln GlnPro Val Glu Val AsnGly Tyr Val
1145 1150 1155
Ser LeuGln Asp Gln Pro ArgAsp Val Glu Val AspLeu Ala Val
1160 1165 1170
Lys GlyTyr Ala Ser Leu LysGly Ser Leu Lys GlySer Asp Val
1175 1180 1185
Met IleAsp Phe Glu Asn AsnLeu Asn Pro Asn ValAsn Phe Asn
1190 1195 1200
Met LysGly Lys Phe Asp TyrAsn Asn Met Ile HisAsn Glu Phe
1205 1210 1215
Glu LeuGln Tyr Gly Pro LysLys Asn Asp Pro LeuSer Lys Val
1220 1225 1230
Ser PhePhe Gln His Leu LysTyr His Ile Gln SerSer Glu Asp
1235 1240 1245
Tyr AsnIle Ile Thr Lys AsnSer Phe Glu Ile ArgAla Val Pro
1250 1255 1260
Leu LysVal Val Ala Asn AlaAsp Ile Asp Pro LysLys Val Val
1265 1270 1275
Ile AspIle Gly Gly Gln TyrVal Asp Arg Ser AlaLys Leu Glu
1280 1285 1290
Val GluAla Arg Thr Lys IleLys Arg Pro Gly AspTyr Ser Val
1295 1300 1305
Lys ValLys Ala Asn Leu AsnAsp Ala Cys Ile GluVal Leu Ser
1310 1315 1320
Lys ArgAsp Val Val Ser AlaAsp Lys Ser Asn PheGlu Asn Tyr
1325 1330 1335
Leu AspIle Thr Gly Val GlyArg Tyr Glu Leu SerGly Val Val
1340 1345 1350
Leu HisLys Thr Lys Pro AsnAsp Met Asn Val GlyAla Ile Gly
1355 1360 1365
His PheLys Ile Lys Ala GlySer Asn Asn Glu AspIle Lys Phe
1370 1375 1380
Asp IleGly Leu Ile Glu ThrSer Asn Ile Tyr SerSer His Ala
1385 1390 1395
Gln ValSer Asn Ser Lys GlyGlu Val Leu Asp PheLeu Leu Lys
1400 1405 1410
Val ThrArg Thr Gly Asn ProThr Gly Gln Leu LysPhe Asn Leu
1415 1420 1425
Lys AspIle Ile Val Thr HisGly Glu Phe Lys ValThr Asp Asn
1430 1435 1440
Asp GlyLys Gly Asn Gly MetIle Ile Val Glu PheLys Lys Leu
1445 1450 1455
Gln ArgLys Ile Lys Gly AspVal Lys Phe Val SerLys Asp Pro
1460 1465 1470
Val PheIle Thr Asp Ile GluLeu Tyr Leu Asp PheGlu Lys Asn
1475 1480 1485
Asn AsnAsn Lys Phe His PheVal Thr Asn Asn ArgLys Thr Gln
1490 1495 1500
Lys LeuVal Ser Ser Lys AsnLys Val Glu Tyr AspGly Lys Val
1505 1510 1515
Thr GluVal Asn Tyr Val GlnGlu Gly Val Phe SerIle Thr Gly
1520 1525 1530
Lys ThrAsn Leu Asn Phe AspVal Val Leu Pro ThrGlu Arg Cys
1535 1540 1545
Ile SerLeu Lys Ile Asp ArgAsp Val Ala Leu LysAsp Gly Lys
1550 1555 1560
Tyr SerGly His Ala Glu LeuLeu Leu Ser Asp SerVal Lys Arg
1565 1570 1575
Gly SerAla Ser Ser Val IleSer Tyr Lys Gly LysIle Val Asp
1580 1585 1590
Thr AspIle Glu Lys Glu IleIle Asn Tyr Glu GlyGln Leu Glu
1595 1600 1605
Phe ArgLeu Lys Asp Gly LysGln Leu Leu Asn ThrPhe Tyr Leu
1610 1615 1620
Lys AsnIle Pro Glu Gly AsnLys Phe Lys Phe AspPhe Lys Ser
1625 1630 1635
Asp ValThr Gly Asn Leu LeuPro Lys Pro Ala SerLeu Ser Ala
1640 1645 1650
Thr GlySer Tyr Leu Asp SerGlu Thr Ile Ile AsnGln Asn Tyr
1655 1660 1665
Arg ValLys Gly Asn Tyr GlyAsp Asp Ile Ser PheGlu Tyr Val
1670 1675 1680
Asp GlnTrp Thr Cys Asn TyrSer Arg Arg Thr LysLys Tyr Leu
1685 1690 1695
Ser AspTyr Thr Val Thr ValHis Leu Pro Phe GluLys Ala His
1700 1705 1710
Asp IleLys Trp Ala Ser ThrVal Gln Tyr Leu GlnPro Asp Gly
1715 1720 1725
Lys AspIle Ala Glu Tyr ThrIle Val Glu Ser ValGln Val Asn
1730 1735 1740
Ala AspVal Phe Lys Val AspAla Asn Gly Lys ValGly Ile Lys
1745 1750 1755
Asn GlySer Gly Ala Ile LysVal Leu Ile Pro HisAsn Asp Pro
1760 1765 1770
Phe IleVal Asp Phe Asn TyrLys Arg Asp Ser GlnGly Asp Lys
1775 1780 1785
Asn AsnAsn Phe Val Glu ValLys Ala Lys Tyr GlyLys Gly Lys
1790 1795 1800
Thr ThrSer Leu Ser Ile AspSer Ser Phe Ala ProHis Asp Ser
1805 1810 1815
Thr LeuGln Val Lys Ala TyrSer Pro Asn Ala GluLys Leu Lys
1820 1825 1830
Lys LeuGlu Leu Asn Ile HisSer Lys Asn Pro SerPro Asp Thr
1835 1840 1845
Tyr SerAsn Ser Ile Ile MetAsp Ala Asp Gly ArgIle Tyr Lys
1850 1855 1860
Ser GluSer Thr Ile Val LeuSer Lys Ala His ProVal Leu Asp
1865 1870 1875
Ile GlnTyr Val Asn Pro GluThr Asn Lys Pro SerArg Ile Tyr
1880 1885 1890
Val LysGly Ser Ser Leu SerSer Thr Gln Gly LysIle Glu Val
1895 1900 1905
Lys ValAsp Asn Ile Tyr LysIle Cys Phe Asp ValVal Ala Glu
1910 1915 1920
Gly SerVal Gln Lys Asp AsnVal Ala Phe Lys AlaVal Ala Asn
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Ser LysGlu Leu Gly Trp AsnAsn Tyr Asn Val AspIle Ser Ser
1940 1945 1950
Lys AspSer Gly Asn Gly LysArg Leu Asp Phe HisAla Ile Asn
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Asp AsnLys Asn Val Ile SerGly Ser Thr Ser PheIle Ser Lys
1970 1975 1980
Gln GluGly Gln Lys Thr IleIle Glu Gly Ser GlySer Val Lys
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Val LysGlu Glu Gln Lys TrpAla Asn Phe Lys PheIle Arg Thr
2000 2005 2010
Val LeuThr Glu Ser Ser GluGln Gly Val Glu ThrPhe Phe Asn
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Val AlaIle Gly Glu Arg SerTyr Val Ala Glu SerArg Val Thr
2030 2035 2040
Asn TyrGlu Tyr Lys Asn SerTyr Val Tyr Cys GluGlu Lys Lys
2045 2050 2055
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2060 2065 2070
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2090 2095 2100
Val SerThr Ser Lys Pro ProArg Phe Thr Leu AspLeu His Val
2105 2110 2115
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Arg LeuLeu Ala Leu Glu TyrThr Leu Asp Tyr ProThr Asp Lys
2150 2155 2160
Leu MetPro Phe Pro Val ArgGly Glu Val Cys LeuAsp Leu Asp
2165 2170 2175
Lys AsnLys Pro Gly His LysThr Ser Ala Arg PheLeu Val Asp
2180 2185 2190
Phe ThrAsn Ala Gly Gly SerGln Asp Thr Ala IleAla Glu Ile
2195 2200 2205
Gly PhePhe His Pro Lys IleGlu Lys Glu Ala ValPhe Arg Ile
2210 2215 2220
Asn GlyVal Val Lys Arg ProGly Asp Gly Thr PheLys Phe Glu
2225 2230 2235
Thr SerAla Thr Leu Ser CysHis Ser Ala Phe GlyArg Asp Arg
2240 2245 2250
Val SerLys Leu Leu Leu GluVal Ser Pro Arg LysPhe Glu Phe
2255 2260 2265
Leu ThrGlu Thr Pro Phe ValLys Val Leu His IleAsp Ala Gly
2270 2275 2280
Phe ThrSer Thr Pro Glu GlnArg Thr Tyr Gln SerLeu Phe Ser
2285 2290 2295
Val CysLeu Leu Glu Gly AsnVal Val Gln Ile LysThr Leu Leu
2300 2305 2310
Lys AspPhe Gln Tyr Phe GluPhe Thr Thr Glu GluSer Gly Cys
2315 2320 2325
Lys PheSer Ile Val Ala HisLeu Val Pro Glu LysArg Ala Asp
2330 2335 2340
Ile SerAla Asp Leu Ile LeuSer Gly Gly Lys LysAsn Ile Ala
2345 2350 2355
His GlyAla Leu Phe Leu LysAsp Asn Thr Ile GlnSer Glu Tyr
2360 2365 2370
Gly AlaSer Lys Asp Asn PheAsn His Leu Met AlaThr Val Lys
2375 2380 2385
Lys AspAla Glu Ser Leu AsnAsp Arg Ile Lys AspLeu Gly Glu
2390 2395 2400
Lys SerSer Gln Asp Phe GlnGln Leu Leu Gln ArgAla Thr Pro
2405 2410 2415
Tyr PheLys Arg Ile Asp AspAsp Phe Arg Ala GluTrp Glu Arg
2420 2425 2430
Phe TyrAsn Glu Ile Ala ValAsp Lys Val Phe LysGlu Leu Ser
2435 2440 2445
His ThrLeu Asn Glu Val IleHis Tyr Leu Ala LysIle Phe Asp
2450 2455 2460
Glu IleLeu Gln Gly Thr LysPro Leu Val Asp GlnIle Thr Lys
2465 2470 2475
Thr PheThr Glu Thr Ser GluLys Ile Ser Gly MetTyr Lys Lys
2480 2485 2490
Thr LeuGlu Pro Gln Leu LysGln Leu Tyr Glu ThrLeu Gly Lys
2495 2500 2505
Ile LeuLys Glu Tyr Leu AspAla Ala Ile Glu ValVal Ala His
2510 2515 2520
Leu GlyAla Leu Val Ser AspPhe Phe Glu Lys HisLys Gln Glu
2525 2530 2535
Leu GlnGln Leu Thr Asn ValMet Thr Glu Ile PheLys Asp Leu
2540 2545 2550
Thr ArgIle Ile Val Ala GlnLeu Lys Glu Met ProGly Lys Phe
2555 2560 2565
Asn GlnVal Tyr Gly Glu LeuVal Gln Leu Ile AsnAsn Met Pro
2570 2575 2580
Ile IleGlu Ala Ile Lys GluGlu Trp Lys Asp GlyLeu Pro Lys
2585 2590 2595
Asp GlnIle Leu Gly Met CysAsn Gln Gly Tyr AlaAla Ile Tyr
2600 2605 2610
Gln ValLeu Pro Asn Lys GluPhe Lys Asp Phe AlaGlu Ala Leu
2615 2620 2625
Asn AsnTyr Val Ile Lys LysLeu Arg Ser Glu GlnIle Asp Asp
2630 2635 2640
Ala LysSer Leu Gln Val IleTyr Gln Lys Leu IleAla Ala Phe
2645 2650 2655
Ser SerLeu Ser Gln Phe IlePro Ser Gln Ile ThrSer Tyr Thr
2660 2665 2670
Ala SerGly Pro Thr Ser TrpSer Ser Tyr Phe PheSer Pro Ala
2675 2680 2685
Ser ThrPro Val Trp Ser GlyAsp Ala Ser Trp SerLeu Leu Lys
2690 2695 2700
Gln LeuIle Ser Gly Asp LeuPro Asp Met Phe AspMet Ile Arg
2705 2710 2715
Ala TyrArg Pro Arg Ser LeuAsp Pro Phe Asp GluMet Pro Ala
2720 2725 2730
Lys LeuArg Ala Val Val IleAsn Gly Gln His IlePhe Thr Phe
2735 2740 2745
Asp GlyLys His Leu Thr PhePro Gly Gln Cys ArgTyr Val Leu
2750 2755 2760
Ile HisAsn Tyr Val Asp ArgAsn Phe Thr Val LeuLeu Gln Leu
2765 2770 2775
Gln AsnGly Gln Pro Lys AlaLeu Val Leu Glu AspLys Ser Gly
2780 2785 2790
Thr IleIle Glu Leu Lys AspAsn Gly Gln Val ThrLeu Asn Gly
2795 2800 2805
Ala ValHis Gly Phe Pro ValIle Glu Lys Asp ValPhe Ala Phe
2810 2815 2820
Lys GlnThr Asn Gly Arg IleGly Leu Gly Ser GlnTyr Gly Phe
2825 2830 2835
Lys AlaPhe Cys Thr Ser LysLeu Glu Val Cys TyrPhe Glu Val
2840 2845 2850
Asp GlyPhe Tyr Leu Gly LysLeu Arg Gly Leu LeuGly Asp Gly
2855 2860 2865
Asn AsnGlu Pro Tyr Asp AspPhe Arg Leu Pro AsnGly Lys Ile
2870 2875 2880
Cys ThrSer Glu Ser Glu PheGly Asn Gly Tyr GlyLeu Val His
2885 2890 2895
Ser CysPro Lys Val Gln AlaPro Glu His Ser HisHis Gln Met
2900 2905 2910
His AlaAla Leu Pro Pro AlaCys Glu Gln Val PheGly Gly Ile
2915 2920 2925
Ser ProLeu Arg Pro Val SerLeu Leu Leu Asp ValSer Pro Phe
2930 2935 2940
Arg GlnAla Cys Ile His AlaVal Thr Gly Ala AspAla Ala Lys
2945 2950 2955
Asp LeuHis Gln Ala Cys AspLeu Ala Arg Gly TyrAla Ala Leu
2960 2965 2970
Ala LeuThr Gly Met Leu ProAla Val Leu Pro AspVal Cys Val
2975 2980 2985
Arg CysThr Asp Ala Asp LysPro Arg Ala Ile GlyAsp Met Tyr
2990 2995 3000
Glu ValLys Met Pro Asn LysGln Ala Asp Ile ValVal Ser Phe
3005 3010 3015
Glu ThrThr Gln Asn Asn GluGln Thr Tyr Lys GluLeu Val Met
3020 3025 3030
Pro LeuVal Thr Gln Leu ValAsp Asn Leu Lys LysLys Gln Ile
3035 3040 3045
Thr AspIle Lys Leu Tyr LeuVal Gly His Thr SerLys His Pro
3050 3055 3060
Tyr AlaIle Leu Tyr Asp ThrAsp Leu Lys Leu LysSer Ser Lys
3065 3070 3075
Leu HisPhe Asp Asp Thr AspArg Tyr Asp Arg ThrPro Tyr Val
3080 3085 3090
Lys ThrGly Phe Glu Thr PheAsp Lys Tyr Glu LysAsn Leu Val
3095 3100 3105
Glu PheIle Asp Ala Val LysIle Lys Leu Gly IleThr Asn Ile
3110 3115 3120
Ala PheSer Glu Tyr Ser LeuMet Asp Leu Pro PheArg Ala Gly
3125 3130 3135
Ala ValLys His Val Phe LeuThr Val Ser Glu ProCys Ile Glu
3140 3145 3150
Glu PhePhe Leu Val Lys ValVal Gly Asp Leu MetPhe Lys Val
3155 3160 3165
Leu LeuGlu Asn Met Gly MetSer Met Ser Leu ValThr Ala Thr
3170 3175 3180
Pro GluMet Lys Cys Gly GlyAsn Leu Ala His ValVal Gly Phe
3185 3190 3195
Asp GluSer Ser Val Leu MetLeu Gly Asn Met LysArg Thr Lys
3200 3205 3210
Glu SerGlu Ala Leu Arg AlaThr Leu Glu Leu ProSer Ser Ser
3215 3220 3225
Cys IleAsp Phe Thr Gln AlaVal Asp Gly Leu ValPhe Ser Ser
3230 3235 3240
Thr AsnTyr Leu Lys Leu GluGly Gly Gln Arg LysGln Phe Leu
3245 3250 3255
Gln ThrAla Ala Asn Ala IleThr Gln Lys Met ThrLys Ala His
3260 3265 3270
Leu ValGln Glu Cys Thr CysThr Tyr Val Asp ProPhe Arg Val
3275 3280 3285
Arg SerAla Cys Phe Thr ArgGlu Lys Lys Glu ValAla Arg Arg
3290 3295 3300
Arg Lys
3305
<210>3
<211> 689
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> INIT_MET
<223> 成熟肽序列以起始密码子甲硫氨酸开始
<400> 3
Met Asp Lys Cys Ser Ile Glu Cys Gln Gly Ser Pro Ser Asn Pro Ala
1 5 1015
Phe Val Gln Gly Asn Lys Tyr Ser Tyr Ser Val Glu Gly Thr Val Thr
202530
Ile Phe Leu Ser Pro Ala Asp Asp Gln Val Thr Ser Val Lys Leu Ile
354045
Gly Gln Val Ser Val Asp Ala Leu Ala Asn Cys Val His Glu Leu Ser
505560
Val Gln Asn Leu Val Ile Ser Gly Pro Asp Gly Lys Lys Tyr Gln Pro
65707580
Pro Pro Gly Ile Asp Lys Val Val Arg Phe Gly Phe Gln Asp Gly Arg
859095
Val Gly Pro Glu Ile Cys Ala His Gly Asp Asp Thr Arg Arg Ser Leu
100 105 110
Asn Ile Lys Arg Ala Ile Ile Ser Leu Leu Gln Thr Glu Gln Lys Pro
115 120 125
Ser Thr Gln Val Asp Val Phe Gly Val Cys Pro Thr Glu Val Ser Ser
130 135 140
Ser Gln Glu Gly Ser Ala Val Leu Val His Arg Thr Arg Asp Leu Ser
145 150 155 160
Arg Cys Ser His Arg Glu Gln Gly Lys Asn Asp Ile Ile Thr Ser Ile
165 170 175
Thr Asn Pro Asp Ala Gly Ile Lys Asp Met Gln Val Leu Gln Ser Ile
180 185 190
Leu Asn Val Glu Ser Lys Val Asn Ser Gly Val Pro Glu Lys Val Ser
195 200 205
Ala Thr Glu Glu Tyr Leu Tyr Lys Pro Phe Ser Val Gly Glu Asn Gly
210 215 220
Ala Arg Ala Lys Val His Thr Lys Leu Thr Leu Thr Gly Lys Ser Ser
225 230 235 240
Cys Gly Gln Gly Val Ala Tyr Cys Thr Glu Ser Arg Ser Ile Ile Phe
245 250 255
Asp Asn Pro His Gly Val Lys Pro Val Pro Gly Asn Ala Asn Ser Ala
260 265 270
Leu Ala Ala Val Lys Asp Val Ala Lys Ser Val Ser Ser Ile Val Glu
275 280 285
Ser Lys Ser Ala Gly Ala Phe Ala Gln Leu Ile Arg Ile Leu Arg Ile
290 295 300
Thr Ser Lys Asp Asp Leu Met Lys Val Tyr Ser Gln Val Lys Gly Ser
305 310 315 320
Asn Leu Glu Lys Arg Val Phe Leu Asp Ala Leu Leu Arg Ala Gly Thr
325 330 335
Gly Asp Ser Ile Glu Ala Ser Ile Asn Ile Leu Lys Ser Arg Glu Leu
340 345 350
Gly Gln Leu Glu Gln Gln Leu Val Tyr Leu Ser Leu Gly Asn Ala Arg
355 360 365
His Val Asn Asn Ala Ala Leu Lys Ala Ala Ala Ser Leu Leu Asp Gln
370 375 380
Pro Asn Leu Pro Lys Glu Val Tyr Leu Gly Val Gly Ala Leu Ala Gly
385 390 395 400
Ala Tyr Cys Arg Glu His Glu Cys His Thr Thr Lys Pro Val Gly Ile
405 410 415
Val Ala Leu Ser Gln Lys Leu Gly Ala Lys Leu Gln Asn Cys Arg Pro
420 425 430
Arg Ser Lys Thr Glu Glu Asp Thr Ile Val Ala Ile Leu Lys Gly Ile
435 440 445
Arg Ser Ile Arg His Leu Glu Asp Ser Leu Ile Asn Lys Ile Val His
450 455 460
Cys Ala Ala Asp Asn Asn Val Lys Ala Ser Val Lys Ala Ala Ala Leu
465 470 475 480
Glu Ala Phe His Ala Asp Pro Cys Ser Ala Ala Ile Lys Lys Thr Ala
485 490 495
Ile Glu Ile Met Lys Asn Arg Gln Leu Asp Ser Glu Ile Arg Ile Lys
500 505 510
Ala Tyr Leu Ala Val Ile Gln Cys Pro Cys Gly Gln Ser Ala Asn Glu
515 520 525
Ile Lys Asn Leu Leu Asp Thr Glu Pro Val His Gln Val Gly Asn Phe
530 535 540
Ile Ser Thr Ser Leu Arg Tyr Ile Arg Thr Ser Ala Asn Pro Asp Lys
545 550 555 560
Gln Leu Ala Arg Gln His Tyr Gly Leu Ile Arg Thr Pro Asn Lys Phe
565 570 575
Asn Ser Asp Asp Arg Lys Tyr Ser Phe Tyr Arg Glu Thr Ser Phe Asn
580 585 590
Ile Asp Ala Leu Gly Ala Gly Gly Ser Val Asp Gln Thr Val Ile Tyr
595 600 605
Ser Gln Asp Ser Tyr Leu Pro Arg Glu Ala Ser Val Asn Leu Thr Val
610 615 620
Glu Leu Phe Gly His Ser Tyr Asn Val Leu Glu Leu Gly Gly Arg Gln
625 630 635 640
Gly Asn Leu Asp Arg Val Ile Glu His Phe Leu Gly Pro Lys Gly Tyr
645 650 655
Phe Arg Thr Ser Asp Pro Gln Ala Leu Tyr Asp Asp Leu Val Lys Arg
660 665 670
Tyr Glu Glu Ser Lys Asn Lys Val Gln Arg Gly Phe Gly Arg Gly Arg
675 680 685
Arg
<210> 4
<211> 695
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> INIT_MET
<223> 成熟肽序列以起始密码子甲硫氨酸开始
<220>
<221> MUTAGEN
<222> (2)...(7)
<223> 人工增添组氨酸标签
<400> 4
Met His His His His His His Asp Lys Cys Ser Ile Glu Cys Gln Gly
1 5 1015
Ser Pro Ser Asn Pro Ala Phe Val Gln Gly Asn Lys Tyr Ser Tyr Ser
202530
Val Glu Gly Thr Val Thr Ile Phe Leu Ser Pro Ala Asp Asp Gln Val
354045
Thr Ser Val Lys Leu Ile Gly Gln Val Ser Val Asp Ala Leu Ala Asn
505560
Cys Val His Glu Leu Ser Val Gln Asn Leu Val Ile Ser Gly Pro Asp
65707580
Gly Lys Lys Tyr Gln Pro Pro Pro Gly Ile Asp Lys Val Val Arg Phe
859095
Gly Phe Gln Asp Gly Arg Val Gly Pro Glu Ile Cys Ala His Gly Asp
100 105 110
Asp Thr Arg Arg Ser Leu Asn Ile Lys Arg Ala Ile Ile Ser Leu Leu
115 120 125
Gln Thr Glu Gln Lys Pro Ser Thr Gln Val Asp Val Phe Gly Val Cys
130 135 140
Pro Thr Glu Val Ser Ser Ser Gln Glu Gly Ser Ala Val Leu Val His
145 150 155 160
Arg Thr Arg Asp Leu Ser Arg Cys Ser His Arg Glu Gln Gly Lys Asn
165 170 175
Asp Ile Ile Thr Ser Ile Thr Asn Pro Asp Ala Gly Ile Lys Asp Met
180 185 190
Gln Val Leu Gln Ser Ile Leu Asn Val Glu Ser Lys Val Asn Ser Gly
195 200 205
Val Pro Glu Lys Val Ser Ala Thr Glu Glu Tyr Leu Tyr Lys Pro Phe
210 215 220
Ser Val Gly Glu Asn Gly Ala Arg Ala Lys Val His Thr Lys Leu Thr
225 230 235 240
Leu Thr Gly Lys Ser Ser Cys Gly Gln Gly Val Ala Tyr Cys Thr Glu
245 250 255
Ser Arg Ser Ile Ile Phe Asp Asn Pro His Gly Val Lys Pro Val Pro
260 265 270
Gly Asn Ala Asn Ser Ala Leu Ala Ala Val Lys Asp Val Ala Lys Ser
275 280 285
Val Ser Ser Ile Val Glu Ser Lys Ser Ala Gly Ala Phe Ala Gln Leu
290 295 300
Ile Arg Ile Leu Arg Ile Thr Ser Lys Asp Asp Leu Met Lys Val Tyr
305 310 315 320
Ser Gln Val Lys Gly Ser Asn Leu Glu Lys Arg Val Phe Leu Asp Ala
325 330 335
Leu Leu Arg Ala Gly Thr Gly Asp Ser Ile Glu Ala Ser Ile Asn Ile
340 345 350
Leu Lys Ser Arg Glu Leu Gly Gln Leu Glu Gln Gln Leu Val Tyr Leu
355 360 365
Ser Leu Gly Asn Ala Arg His Val Asn Asn Ala Ala Leu Lys Ala Ala
370 375 380
Ala Ser Leu Leu Asp Gln Pro Asn Leu Pro Lys Glu Val Tyr Leu Gly
385 390 395 400
Val Gly Ala Leu Ala Gly Ala Tyr Cys Arg Glu His Glu Cys His Thr
405 410 415
Thr Lys Pro Val Gly Ile Val Ala Leu Ser Gln Lys Leu Gly Ala Lys
420 425 430
Leu Gln Asn Cys Arg Pro Arg Ser Lys Thr Glu Glu Asp Thr Ile Val
435 440 445
Ala Ile Leu Lys Gly Ile Arg Ser Ile Arg His Leu Glu Asp Ser Leu
450 455 460
Ile Asn Lys Ile Val His Cys Ala Ala Asp Asn Asn Val Lys Ala Ser
465 470 475 480
Val Lys Ala Ala Ala Leu Glu Ala Phe His Ala Asp Pro Cys Ser Ala
485 490 495
Ala Ile Lys Lys Thr Ala Ile Glu Ile Met Lys Asn Arg Gln Leu Asp
500 505 510
Ser Glu Ile Arg Ile Lys Ala Tyr Leu Ala Val Ile Gln Cys Pro Cys
515 520 525
Gly Gln Ser Ala Asn Glu Ile Lys Asn Leu Leu Asp Thr Glu Pro Val
530 535 540
His Gln Val Gly Asn Phe Ile Ser Thr Ser Leu Arg Tyr Ile Arg Thr
545 550 555 560
Ser Ala Asn Pro Asp Lys Gln Leu Ala Arg Gln His Tyr Gly Leu Ile
565 570 575
Arg Thr Pro Asn Lys Phe Asn Ser Asp Asp Arg Lys Tyr Ser Phe Tyr
580 585 590
Arg Glu Thr Ser Phe Asn Ile Asp Ala Leu Gly Ala Gly Gly Ser Val
595 600 605
Asp Gln Thr Val Ile Tyr Ser Gln Asp Ser Tyr Leu Pro Arg Glu Ala
610 615 620
Ser Val Asn Leu Thr Val Glu Leu Phe Gly His Ser Tyr Asn Val Leu
625 630 635 640
Glu Leu Gly Gly Arg Gln Gly Asn Leu Asp Arg Val Ile Glu His Phe
645 650 655
Leu Gly Pro Lys Gly Tyr Phe Arg Thr Ser Asp Pro Gln Ala Leu Tyr
660 665 670
Asp Asp Leu Val Lys Arg Tyr Glu Glu Ser Lys Asn Lys Val Gln Arg
675 680 685
Gly Phe Gly Arg Gly Arg Arg
690 695
<210> 5
<211> 695
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> INIT_MET
<223> 成熟肽序列以起始密码子甲硫氨酸开始
<220>
<221> MUTAGEN
<222> (690)...(695)
<223> 人工增添组氨酸标签
<400> 5
Met Asp Lys Cys Ser Ile Glu Cys Gln Gly Ser Pro Ser Asn Pro Ala
1 5 1015
Phe Val Gln Gly Asn Lys Tyr Ser Tyr Ser Val Glu Gly Thr Val Thr
202530
Ile Phe Leu Ser Pro Ala Asp Asp Gln Val Thr Ser Val Lys Leu Ile
354045
Gly Gln Val Ser Val Asp Ala Leu Ala Asn Cys Val His Glu Leu Ser
505560
Val Gln Asn Leu Val Ile Ser Gly Pro Asp Gly Lys Lys Tyr Gln Pro
65707580
Pro Pro Gly Ile Asp Lys Val Val Arg Phe Gly Phe Gln Asp Gly Arg
859095
Val Gly Pro Glu Ile Cys Ala His Gly Asp Asp Thr Arg Arg Ser Leu
100 105 110
Asn Ile Lys Arg Ala Ile Ile Ser Leu Leu Gln Thr Glu Gln Lys Pro
115 120 125
Ser Thr Gln Val Asp Val Phe Gly Val Cys Pro Thr Glu Val Ser Ser
130 135 140
Ser Gln Glu Gly Ser Ala Val Leu Val His Arg Thr Arg Asp Leu Ser
145 150 155 160
Arg Cys Ser His Arg Glu Gln Gly Lys Asn Asp Ile Ile Thr Ser Ile
165 170 175
Thr Asn Pro Asp Ala Gly Ile Lys Asp Met Gln Val Leu Gln Ser Ile
180 185 190
Leu Asn Val Glu Ser Lys Val Asn Ser Gly Val Pro Glu Lys Val Ser
195 200 205
Ala Thr Glu Glu Tyr Leu Tyr Lys Pro Phe Ser Val Gly Glu Asn Gly
210 215 220
Ala Arg Ala Lys Val His Thr Lys Leu Thr Leu Thr Gly Lys Ser Ser
225 230 235 240
Cys Gly Gln Gly Val Ala Tyr Cys Thr Glu Ser Arg Ser Ile Ile Phe
245 250 255
Asp Asn Pro His Gly Val Lys Pro Val Pro Gly Asn Ala Asn Ser Ala
260 265 270
Leu Ala Ala Val Lys Asp Val Ala Lys Ser Val Ser Ser Ile Val Glu
275 280 285
Ser Lys Ser Ala Gly Ala Phe Ala Gln Leu Ile Arg Ile Leu Arg Ile
290 295 300
Thr Ser Lys Asp Asp Leu Met Lys Val Tyr Ser Gln Val Lys Gly Ser
305 310 315 320
Asn Leu Glu Lys Arg Val Phe Leu Asp Ala Leu Leu Arg Ala Gly Thr
325 330 335
Gly Asp Ser Ile Glu Ala Ser Ile Asn Ile Leu Lys Ser Arg Glu Leu
340 345 350
Gly Gln Leu Glu Gln Gln Leu Val Tyr Leu Ser Leu Gly Asn Ala Arg
355 360 365
His Val Asn Asn Ala Ala Leu Lys Ala Ala Ala Ser Leu Leu Asp Gln
370 375 380
Pro Asn Leu Pro Lys Glu Val Tyr Leu Gly Val Gly Ala Leu Ala Gly
385 390 395 400
Ala Tyr Cys Arg Glu His Glu Cys His Thr Thr Lys Pro Val Gly Ile
405 410 415
Val Ala Leu Ser Gln Lys Leu Gly Ala Lys Leu Gln Asn Cys Arg Pro
420 425 430
Arg Ser Lys Thr Glu Glu Asp Thr Ile Val Ala Ile Leu Lys Gly Ile
435 440 445
Arg Ser Ile Arg His Leu Glu Asp Ser Leu Ile Asn Lys Ile Val His
450 455 460
Cys Ala Ala Asp Asn Asn Val Lys Ala Ser Val Lys Ala Ala Ala Leu
465 470 475 480
Glu Ala Phe His Ala Asp Pro Cys Ser Ala Ala Ile Lys Lys Thr Ala
485 490 495
Ile Glu Ile Met Lys Asn Arg Gln Leu Asp Ser Glu Ile Arg Ile Lys
500 505 510
Ala Tyr Leu Ala Val Ile Gln Cys Pro Cys Gly Gln Ser Ala Asn Glu
515 520 525
Ile Lys Asn Leu Leu Asp Thr Glu Pro Val His Gln Val Gly Asn Phe
530 535 540
Ile Ser Thr Ser Leu Arg Tyr Ile Arg Thr Ser Ala Asn Pro Asp Lys
545 550 555 560
Gln Leu Ala Arg Gln His Tyr Gly Leu Ile Arg Thr Pro Asn Lys Phe
565 570 575
Asn Ser Asp Asp Arg Lys Tyr Ser Phe Tyr Arg Glu Thr Ser Phe Asn
580 585 590
Ile Asp Ala Leu Gly Ala Gly Gly Ser Val Asp Gln Thr Val Ile Tyr
595 600 605
Ser Gln Asp Ser Tyr Leu Pro Arg Glu Ala Ser Val Asn Leu Thr Val
610 615 620
Glu Leu Phe Gly His Ser Tyr Asn Val Leu Glu Leu Gly Gly Arg Gln
625 630 635 640
Gly Asn Leu Asp Arg Val Ile Glu His Phe Leu Gly Pro Lys Gly Tyr
645 650 655
Phe Arg Thr Ser Asp Pro Gln Ala Leu Tyr Asp Asp Leu Val Lys Arg
660 665 670
Tyr Glu Glu Ser Lys Asn Lys Val Gln Arg Gly Phe Gly Arg Gly Arg
675 680 685
Arg His His His His His His
690 695
<210> 6
<211> 702
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> INIT_MET
<223> 成熟肽序列以起始密码子甲硫氨酸开始
<220>
<221> MUTAGEN
<222> (2)...(7)
<223> 人工增添组氨酸标签
<220>
<221> MUTAGEN
<222> (8)...(13)
<223> 人工增添凝血酶酶切位点
<400> 6
Met His His His His His His Leu Val Pro Arg Gly Ser Lys Asp Lys
1 5 1015
Cys Ser Ile Glu Cys Gln Gly Ser Pro Ser Asn Pro Ala Phe Val Gln
202530
Gly Asn Lys Tyr Ser Tyr Ser Val Glu Gly Thr Val Thr Ile Phe Leu
354045
Ser Pro Ala Asp Asp Gln Val Thr Ser Val Lys Leu Ile Gly Gln Val
505560
Ser Val Asp Ala Leu Ala Asn Cys Val His Glu Leu Ser Val Gln Asn
65707580
Leu Val Ile Ser Gly Pro Asp Gly Lys Lys Tyr Gln Pro Pro Pro Gly
859095
Ile Asp Lys Val Val Arg Phe Gly Phe Gln Asp Gly Arg Val Gly Pro
100 105 110
Glu Ile Cys Ala His Gly Asp Asp Thr Arg Arg Ser Leu Asn Ile Lys
115 120 125
Arg Ala Ile Ile Ser Leu Leu Gln Thr Glu Gln Lys Pro Ser Thr Gln
130 135 140
Val Asp Val Phe Gly Val Cys Pro Thr Glu Val Ser Ser Ser Gln Glu
145 150 155 160
Gly Ser Ala Val Leu Val His Arg Thr Arg Asp Leu Ser Arg Cys Ser
165 170 175
His Arg Glu Gln Gly Lys Asn Asp Ile Ile Thr Ser Ile Thr Asn Pro
180 185 190
Asp Ala Gly Ile Lys Asp Met Gln Val Leu Gln Ser Ile Leu Asn Val
195 200 205
Glu Ser Lys Val Asn Ser Gly Val Pro Glu Lys Val Ser Ala Thr Glu
210 215 220
Glu Tyr Leu Tyr Lys Pro Phe Ser Val Gly Glu Asn Gly Ala Arg Ala
225 230 235 240
Lys Val His Thr Lys Leu Thr Leu Thr Gly Lys Ser Ser Cys Gly Gln
245 250 255
Gly Val Ala Tyr Cys Thr Glu Ser Arg Ser Ile Ile Phe Asp Asn Pro
260 265 270
His Gly Val Lys Pro Val Pro Gly Asn Ala Asn Ser Ala Leu Ala Ala
275 280 285
Val Lys Asp Val Ala Lys Ser Val Ser Ser Ile Val Glu Ser Lys Ser
290 295 300
Ala Gly Ala Phe Ala Gln Leu Ile Arg Ile Leu Arg Ile Thr Ser Lys
305 310 315 320
Asp Asp Leu Met Lys Val Tyr Ser Gln Val Lys Gly Ser Asn Leu Glu
325 330 335
Lys Arg Val Phe Leu Asp Ala Leu Leu Arg Ala Gly Thr Gly Asp Ser
340 345 350
Ile Glu Ala Ser Ile Asn Ile Leu Lys Ser Arg Glu Leu Gly Gln Leu
355 360 365
Glu Gln Gln Leu Val Tyr Leu Ser Leu Gly Asn Ala Arg His Val Asn
370 375 380
Asn Ala Ala Leu Lys Ala Ala Ala Ser Leu Leu Asp Gln Pro Asn Leu
385 390 395 400
Pro Lys Glu Val Tyr Leu Gly Val Gly Ala Leu Ala Gly Ala Tyr Cys
405 410 415
Arg Glu His Glu Cys His Thr Thr Lys Pro Val Gly Ile Val Ala Leu
420 425 430
Ser Gln Lys Leu Gly Ala Lys Leu Gln Asn Cys Arg Pro Arg Ser Lys
435 440 445
Thr Glu Glu Asp Thr Ile Val Ala Ile Leu Lys Gly Ile Arg Ser Ile
450 455 460
Arg His Leu Glu Asp Ser Leu Ile Asn Lys Ile Val His Cys Ala Ala
465 470 475 480
Asp Asn Asn Val Lys Ala Ser Val Lys Ala Ala Ala Leu Glu Ala Phe
485 490 495
His Ala Asp Pro Cys Ser Ala Ala Ile Lys Lys Thr Ala Ile Glu Ile
500 505 510
Met Lys Asn Arg Gln Leu Asp Ser Glu Ile Arg Ile Lys Ala Tyr Leu
515 520 525
Ala Val Ile Gln Cys Pro Cys Gly Gln Ser Ala Asn Glu Ile Lys Asn
530 535 540
Leu Leu Asp Thr Glu Pro Val His Gln Val Gly Asn Phe Ile Ser Thr
545 550 555 560
Ser Leu Arg Tyr Ile Arg Thr Ser Ala Asn Pro Asp Lys Gln Leu Ala
565 570 575
Arg Gln His Tyr Gly Leu Ile Arg Thr Pro Asn Lys Phe Asn Ser Asp
580 585 590
Asp Arg Lys Tyr Ser Phe Tyr Arg Glu Thr Ser Phe Asn Ile Asp Ala
595 600 605
Leu Gly Ala Gly Gly Ser Val Asp Gln Thr Val Ile Tyr Ser Gln Asp
610 615 620
Ser Tyr Leu Pro Arg Glu Ala Ser Val Asn Leu Thr Val Glu Leu Phe
625 630 635 640
Gly His Ser Tyr Asn Val Leu Glu Leu Gly Gly Arg Gln Gly Asn Leu
645 650 655
Asp Arg Val Ile Glu His Phe Leu Gly Pro Lys Gly Tyr Phe Arg Thr
660 665 670
Ser Asp Pro Gln Ala Leu Tyr Asp Asp Leu Val Lys Arg Tyr Glu Glu
675 680 685
Ser Lys Asn Lys Val Gln Arg Gly Phe Gly Arg Gly Arg Arg
690 695 700
2016-10-01
机译: 类似于受体的受体4-失功能及其生物学应用
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