一种用于快速判断小分子结合人体肝脏果糖1,6‑二磷酸酶底物位点或变构位点的方法

技术领域

本发明属于小分子结合酶位点技术领域，具体涉及了一种用于快速判断小分子结合人体肝脏果糖1,6-二磷酸酶底物位点或变构位点的方法。

背景技术

二型糖尿病正在成为世界范围性的疾病，预计到2030年，全球将有3.66亿人得糖尿病。糖尿病患者长期存在的高血糖，会损害人体内的各种器官组织，例如眼睛、肾、神经、心脏、还有血管。糖尿病的发病机理主要为胰岛素分泌不足，胰岛素抵抗和肝葡萄糖生成增加。此外，内源性的葡萄糖生成增加是造成糖尿病患者空腹血糖升高的主要原因。内源性的葡萄糖主要来源于肝脏。肝脏内葡萄糖代谢主要为两个途径，一个是糖异生过程，另一个是肝糖原分解。因此通过调节糖异生途径，减少肝脏葡萄糖的生成，成为开发新作用机制抗糖尿病药物的新策略。

糖异生作用是将乳酸，丙三醇等三碳前体，在多种酶的催化下转化为葡萄糖的过程。在糖异生过程中，果糖1,6-二磷酸酶(FBPase)催化果糖1,6-二磷酸生成果糖-6-磷酸和一分子磷酸。该催化反应是糖异生过程中的一个控速步骤，抑制果糖1,6-二磷酸酶(FBPase)的活性，可以减少肝脏葡萄糖的生成，降低血糖水平，达到治疗糖尿病的目的。

果糖1,6-二磷酸酶(FBPase)是一个同源四聚体，由四个结构相同的单位组成。每个单体结构中含有两个结合位点：底物位点和AMP变构位点。目前已经报道了许多化合物对果糖1,6-二磷酸酶(FBPase)有抑制作用。而清楚明确的知晓小分子和果糖1,6-二磷酸酶(FBPase)的结合位点对于小分子的设计改造至关重要。而目前判断小分子和果糖1,6-二磷酸酶(FBPase)结合位点主要有：1.X-Ray晶体体衍射法；2.表面等离子共振；3.同位素标记法。但是这些方法实际操作起来却常常存在较大难度。因此，寻找一种快速简便判断小分子的在果糖1,6-二磷酸酶(FBPase)结合位点的方法是急需解决的问题。

发明内容

本发明针对现有技术中存在的不足，目的在于提供一种用于快速判断小分子结合人体肝脏果糖1,6-二磷酸酶底物位点或变构位点的方法。

为实现上述发明目的，本发明所采用的技术方案为：

一种用于快速判断小分子结合人体肝脏果糖1,6-二磷酸酶底物位点或变构位点的方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)采用氨基酸定点突变技术将果糖1,6-二磷酸酶的蛋白序列262位(底物位点)的苯丙氨酸(Phe)突变为色氨酸(Trp)，记为蛋白F262W；同理，采用氨基酸定点突变技术将果糖1,6-二磷酸酶的蛋白序列89位(变构位点)的苯丙氨酸(Phe)突变为色氨酸(Trp)，记为蛋白F89W；(2)将小分子与蛋白F262W结合，在不同温度下，利用荧光分光光度计检测小分子和蛋白F262W结合时的荧光猝灭过程，经数据处理后得到不同温度下小分子和蛋白F262W结合时的荧光猝灭常数，记为K_SV；同理，将小分子与蛋白F89W结合，在不同温度下，利用荧光分光光度计检测小分子和蛋白F89W结合时的荧光猝灭过程，经数据处理后得到不同温度下小分子与蛋白F89W结合时的荧光猝灭常数，记为K’_SV；

(3)利用荧光猝灭常数K_SV和K’_SV进行结果判定：

a.若蛋白F262W荧光猝灭且Ksv随着温度的升高而降低，则表明小分子结合在果糖1,6-二磷酸酶的底物位点上；反之，若蛋白F262W未荧光猝灭或Ksv随着温度的升高而升高，则表明小分子未结合在果糖1,6-二磷酸酶的底物位点上；

b.若蛋白F89W荧光猝灭且K’_SV随着温度的升高而降低，则表明小分子结合在果糖1,6-二磷酸酶的变构位点上；反之，若蛋白F89W未荧光猝灭或K’_SV随着温度的升高而升高，则表明小分子未结合在果糖1,6-二磷酸酶的变构位点上。

上述方案中，所述荧光分光光度计检测荧光猝灭过程的测试体系为：0.8mM Mg²⁺，50mM>

上述方案中，所述荧光分光光度计的设置为：激发波长为280nm，发射波长设为285～400nm，狭缝长度为5，平滑因子为7，电压为710V。

上述方案中，利用Stern-Vlomer方程对荧光数据进行处理得到荧光猝灭常数，所述Stern-Vlomer方程为其中F₀为不加小分子时波峰最高点的荧光强度，F为加入小分子后波峰最高点的荧光强度，Q为小分子浓度。

上述方案中，通过检测301K～310K温度下的荧光猝灭常数用于判定荧光猝灭常数随温度的变化情况。

人体肝脏果糖1,6-二磷酸酶的蛋白序列如下所示(见SEQ ID NO.1)：

ADQAPFDTDVNTLTRFVMEEGRKARGTGELTQLLNSLCTAVKAISSAVRKAGIAHLYGIAGSTNVTGDQVKKLDVLSNDLVMNMLKSSFATCVLVSEEDKHAIIVEPEKRGKYVVCFDPLDGSSNIDCLVSVGTIFGIYRKKSTDEPSEKDALQPGRNLVAAGYALYGSATMLVLAMDCGVNCFMLDPAIGEFILVDKDVKIKKKGKIYSLNEGYAKDFDPAVTEYIQRKKFPPDNSAPYGARYVGSMVADVHRTLVYGGIFLYPANKKSPNGKLRLLYECNPMAYVMEKAGGMATTGKEAVLDVIPTDIHQRAPVILGSPDDVLEFLKVYEKHSAQ

本发明的有益效果：本发明分别在底物位点和变构位点附近引入带有荧光基团的色氨酸，利用小分子与蛋白底物位点或变构位点结合，引起蛋白周围环境发生变化，使得荧光发生猝灭，通过判断荧光猝灭的情况实现快速简便的判断小分子结合果糖1,6-二磷酸酶的底物位点或变构位点，本发明方法具有特异性好，灵敏度高的优点。

附图说明

图1为底物果糖1,6二磷酸(FBP)与果糖1,6-二磷酸酶的底物位点的结合方式。

图2为单磷酸腺苷(AMP)与果糖1,6-二磷酸酶的变构位点的结合方式。

图3为底物果糖1,6二磷酸(FBP)(0～222μM)在301K时对F262W荧光光谱影响。

图4为单磷酸腺苷(AMP)(0～282μM)在301K时对F89W荧光光谱影响。

图5为化合物HS36(0～131μM)在301K时对F262W荧光光谱影响。

图6为化合物HS36(0～56μM)在301K时对F89W荧光光谱影响。

具体实施方式

为了更好地理解本发明，下面结合实施例进一步阐明本发明的内容，但本发明的内容不仅仅局限于下面的实施例。

实施例1蛋白F262W和F89W的制备、表达及纯化

采用氨基酸定点突变技术将果糖1,6-二磷酸酶的蛋白序列262位(底物位点)的苯丙氨酸(Phe)突变为色氨酸(Trp)，记为蛋白F262W；采用氨基酸定点突变技术将果糖1,6-二磷酸酶的蛋白序列89位(变构位点)的苯丙氨酸(Phe)突变为色氨酸(Trp)，记为蛋白F89W；

经过验证正确的F262W和F89W的重组质粒pPeceiver-B01(金唯智公司提供)被热激活转化到表达菌株BL21(DE3)中，挑取BL21-pPeceiverB01-FBPase重组单菌落接种到20mL LB液体培养基中(含有50μg/mL氨苄青霉素)，37℃，220rpm过夜培养12–16h。然后将上一步过夜培养的菌液按照1％的量接种到500mL 2×YT液体培养基中37℃，220rpm扩大培养，待OD600值为0.6～0.8时，加入IPTG使其终浓度为0.1mM，改变温度到16℃诱导表达Hu-FBPase；24h后，4℃，8000rpm高速离心10min收集菌体，之后用5×裂解缓冲液洗菌1次后弃上清；收集后的菌体放入-20℃冰箱中冷冻备用。

1)HisTrap_FF 5mL亲和层析柱的再：设置AKTA Purifier 10流速2.0mL/min，设置压力报警为0.25MPa，冲洗顺序为EDTA洗脱液2CV，ddH₂O>2O>4>2O>

2)将冰箱中冻藏的菌体细胞放在冰上慢慢融化，稍后用30mL冷处理的5×裂解缓冲液慢慢重悬；

3)冰水浴情况下，细胞超声破碎仪破碎，探头与离心管底部保持1cm的距离，设置工作条件为：电压为220W，(3，5，90)；

4)将破碎后的菌液10000rpm，4℃，离心30min，分离上清和沉淀，0.22μM滤膜过滤上清两次；

5)使用AKTA Purifier 10纯化目的蛋白：

I平衡：设置A泵为5×裂解缓冲液，B泵为50×冲洗缓冲液，使用A泵，流速2.0mL/min，压力报警0.25MPa，3CV平衡第1)步中再生的HisTrap_FF 5mL亲和层析柱，A280紫外值归零；

II上样：使用A泵(5×裂解缓冲液)，流速0.5mL/min，压力报警0.25MPa，将过滤后的上清上样到HisTrap_FF 5mL亲和层析柱上。上样完毕后，流速设置为2.0mL/min，依然使用A泵将未结合到层析柱的杂蛋白冲洗下来，一直到A280紫外值不发生变化；

III洗杂蛋白：待未结合的杂蛋白冲洗完毕后，使用B泵(50×冲洗缓冲液)流速2.0mL/min，压力报警0.25MPa，冲洗结合在层析柱上的非目的蛋白，一直冲洗到A280紫外值<30mA；

IV冲洗目的蛋白：待结合到层析柱上的杂蛋白冲洗完毕后，将A泵溶液换为ETDA洗脱缓冲液，洗泵后，设置A泵流速2.0mL/min，压力报警0.25MPa，冲洗目的蛋白，(EDTA竞争目的蛋白与层析柱上的Ni结合，EDTA与Ni结合能力更强，EDTA与Ni结合后将Ni从层析柱上洗脱下来，而原先与Ni结合的目的蛋白则仍然大量残留在层析上，继续冲洗残留目的蛋白就会大量被从层析柱上洗脱下来。)使用超滤管将目的蛋白浓缩到体积<1.5mL；

V脱盐：使用脱盐缓冲液将HiTrap Desalting脱盐柱平衡5CV，脱盐层析的原则是高浓度上样、快速上样、快速洗脱，故整脱盐过程均设流速2.0mL/min，压力报警0.25MPa，将IV步骤中浓缩后的目的蛋白(<1.5mL，原因是每个HiTrap Desalting脱盐柱能分离的最大体积为1.5mL，若>1.5mL的上样溶液，则需要多个HiTrap Desalting脱盐柱串联或分多部进行。)快速上样到HiTrap Desalting脱盐柱上，快速洗脱收集到EP管中，脱盐后的目的蛋白会被稀释，脱盐过后需要重新浓缩目的蛋白；

6)将纯化后得到的目的蛋白与甘油1:1混合均匀，放置于-20℃冰箱备用。

实施例2利用蛋白F262W判断小分子与果糖1,6-二磷酸酶的底物结合位点

采用晶体结构已经报道结合于果糖1,6-二磷酸酶底物位点的果糖1,6二磷酸(FBP)对F262W进行测试，主要使用的仪器是荧光分光光度计，荧光分光光度计比色皿中的测试体系为：0.8mM Mg²⁺，50mM>0，记录每次加入合适量的小分子后波峰最高点的荧光强度F，小分子的浓度是[Q]，图3为FBP浓度为0～222μM、在301K时对F262W荧光光谱影响。用Stern-Vlomer方程对数据进行处理，得到301K时猝灭常数K_sv。同样地，在310K时也要做相同的实验，得到310K时的猝灭常数K_sv。若K_sv随着温度的升高而升高，表明是动态猝灭，说明小分子和蛋白是碰撞导致猝灭的，进一步用公式对数据进一步处理，得出猝灭常数K。若K_sv随着温度的升高而降低则表明是静态猝灭，说明小分子是和蛋白结合才导致猝灭的。

表1 FBP猝灭F262W的猝灭常数

测试结果如表1所示，从结果可以看出：FBP的猝灭常数K_sv随着温度的升高而降低，说明它是静态猝灭，FBP是和蛋白F262W结合而不是碰撞导致荧光猝灭，由此说明：利用蛋白F262W的荧光猝灭情况，能够特异性、快速准备地判断FBP结合于果糖1,6-二磷酸酶的底物位点上。

实施例3利用蛋白F89W判断小分子与果糖1,6-二磷酸酶的变构结合位点

采用晶体结构已经报道只结合于果糖1,6-二磷酸酶的结合于果糖1,6-二磷酸酶的变构位点的单磷酸腺苷(AMP)对蛋白F89W进行测试，主要使用的仪器是荧光分光光度计，荧光分光光度计比色皿中的测试体系为：0.8mM Mg²⁺，50mM>0，记录每次加入合适量的小分子后波峰最高点的荧光强度F，小分子的浓度是[Q]，图4为AMP浓度为0～282μM、在301K时对F89W荧光光谱影响。用Stern-Vlomer方程对数据进行处理，得到301K时猝灭常数K_sv。同样地，在310K时也要做相同的实验，得到310K时的猝灭常数K_sv。若K_sv随着温度的升高而升高，表明是动态猝灭，说明小分子和蛋白是碰撞导致猝灭的，进一步用公式对数据进一步处理，得出猝灭常数K。若K_sv随着温度的升高而降低则是静态猝灭，说明小分子是和蛋白结合才导致猝灭的。

表2 AMP猝灭F89W的猝灭常数

测试结果如表2所示，从结果可以看出：AMP的猝灭常数K_sv随着温度的升高而降低，说明它是静态猝灭，AMP是和蛋白F89W结合而不是碰撞导致荧光猝灭。由此说明：利用蛋白F89W的荧光猝灭情况，能够特异性、快速准备地判断AMP结合于果糖1,6-二磷酸酶的变构位点上。

实施例4利用蛋白F262W和蛋白F89W判断HS36与果糖1,6-二磷酸酶的结合位点

HS36是本课题组针对Hu-FBPase设计合成的抑制剂，其抑制Hu-FBPase的IC₅₀为0.35μM,利用F262W和F89W两个蛋白判断其在Hu-FBPase上的作用位点。

主要使用的仪器是荧光分光光度计，荧光分光光度计比色皿中的测试体系为：0.8mM Mg²⁺，50mM>0，记录每次加入合适量的小分子后波峰最高点的荧光强度F，小分子的浓度是[Q]，图5为HS36浓度为0～131μM、在301K时对F262W荧光光谱影响，图6为HS36浓度为0～56μM、在301K时对F89W荧光光谱影响，用Stern-Vlomer方程对数据进行处理，得到301K时猝灭常数K_sv。同样地，在310K时也要做相同的实验，得到310K时的猝灭常数K_sv。若K_sv随着温度的升高而升高，表明是动态猝灭，说明小分子和蛋白是碰撞导致猝灭的，进一步用公式对数据进一步处理，得出猝灭常数K。若K_sv随着温度的升高而降低则是静态猝灭，说明小分子是和蛋白结合才导致猝灭的。

表3 HS36猝灭F262W的猝灭常数

表4 HS36猝灭F89W的猝灭常数

测试结果如表3，4，从结果可以看出：HS36在F262W和F89W的猝灭常数K_sv均随着温度的升高而降低，说明它们是静态猝灭，HS36与蛋白F89W、蛋白F262W结合导致了荧光猝灭。由此说明：利用蛋白F89W和F262W的荧光猝灭情况，能够特异性、快速准确地判断HS36结合于果糖1,6-二磷酸酶的变构位点以及果糖1,6-二磷酸酶的底物位点上。

显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的实例，而并非对实施方式的限制。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而因此所引申的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之内。