检测马铃薯主食粉或马铃薯主食中马铃薯粉含量的方法

技术领域

本发明涉及食品加工技术领域，尤其涉及一种检测马铃薯主食粉或马铃薯主食中马铃薯粉含量的方法。

背景技术

马铃薯是世界上仅次于小麦、水稻、玉米的第四大粮食作物。我国是马铃薯生产大国，2014年全国马铃薯产量约为9613万吨(FAO，2014)，居世界首位。马铃薯热量低，营养全面，被称为“十全十美的食物”。然而，马铃薯在我国主要作为鲜食菜用、淀粉加工、饲料原料等，人均消费量偏低，发展参差不齐，难以实现跨越式发展。此外，长期以来以米制、面制为主的精细的饮食结构使我国居民高血糖、高血脂、高血压、超重、肥胖等“现代文明病”的发病几率大大增加。但是，与小麦、大米等主食相比，马铃薯主食热量低，脂肪少，且富含蛋白质、氨基酸、膳食纤维、维生素和矿物质等，可有效地促进肠道蠕动，预防血管中脂肪沉积、动脉粥样硬化和高血压等。

2015年1月，农业部宣布实施马铃薯主食化战略。2016年，中央一号文件明确提出“积极推进马铃薯主食开发”，将马铃薯与我国传统主食如馒头、面条、面包等相结合，与菜用和零食消费相比，“马铃薯主食化”更符合我国居民的消费习惯，此举不仅可以提高马铃薯在我国居民饮食中的比例、推进马铃薯主食化的发展速度，而且对突破马铃薯发展瓶颈、延长马铃薯加工产业链、改善居民营养膳食结构等具有十分重要的意义。

然而，随着马铃薯主食推进速度的加快，消费者对马铃薯主食接受程度的提高，马铃薯主食专用粉及马铃薯主食的掺假也引起人们的广泛关注。目前，有关鉴定马铃薯主食专用粉及马铃薯主食真假的研究报道尚属空白。因此，采用一定的方法检测马铃薯主食专用粉以及相关主食产品，如馒头、面包、面条等主食中是否添加马铃薯粉，以及添加马铃薯粉的比例，不仅可以鉴别马铃薯主食专用粉及马铃薯主食的真假，而且可以防止不法商贩虚假宣传、维护良好的市场秩序和消费者利益，从而推动马铃薯主食化的健康发展。

发明内容

本发明的目的是提供一种检测马铃薯主食粉或马铃薯主食中马铃薯粉含量的方法，包括如下步骤：

(一)绘制标准工作曲线

(1)将小麦粉和马铃薯粉按照(0-10)：(10-0)的重量比例混合，得若干马铃薯主食粉样品，备用；以所述马铃薯主食粉为原料，将其制作成若干个马铃薯主食样品，备用；

(2)取所述马铃薯主食粉样品和马铃薯主食样品，分别加入中性缓冲溶液，使蛋白溶出，取含有蛋白的溶液，得不同浓度梯度的主食粉标准溶液和主食标准溶液；

(3)采用聚丙烯酰胺凝胶电泳法分别对所述主食粉标准溶液和主食标准溶液进行检测，对所得电泳图中的马铃薯糖蛋白进行定量分析，以小麦粉和马铃薯粉的混合比例为横坐标，马铃薯糖蛋白量为纵坐标，绘制标准工作曲线，分别得马铃薯主食粉回归方程和马铃薯主食回归方程；

(二)检测待测样品中马铃薯粉的添加量

取待测样品，按照步骤(2)和(3)的操作对所述待测样品进行处理，得到所述待测样品中马铃薯糖蛋白的含量，依据回归方程，计算得到待测样品中马铃薯粉的添加量。

优选地，小麦粉和马铃薯粉的重量比例分别为10:0，9:1，8:2，7:3，6:4，5:5，0:10。

本发明所述的马铃薯主食包括但不局限于马铃薯馒头、马铃薯面包、马铃薯面条中的一种。它们可采用本领域公知的方法制备得到。

本发明提供了一种马铃薯馒头的制备方法：将马铃薯粉与小麦粉按照上述比例混合均匀后，加入0.4％的糖、1％的羧丙基甲基纤维素(HPMC)、0.5％的谷朊粉、1％的蛋白(如乳清蛋白，大米蛋白，大豆蛋白，蛋清蛋白等)、0.5％的酵母，加入65％-75％的水，搅拌均匀后，揉制成面团，经压片、成型、整型后，置于35-38℃、相对湿度为70％-80％的发酵箱中醒发1-1.5h，沸水蒸制30min，即得。

优选地，步骤(2)的操作为：按照1g：(5-10)mL的固液比，分别将马铃薯主食粉样品、马铃薯主食样品与中性缓冲溶液混合，超声提取，离心所得提取液，取上清液，即得。

进一步优选地，在将马铃薯主食样品与中性缓冲溶液混合前，先对所述马铃薯主食样品进行冷冻干燥。

冷冻干燥能够使马铃薯主食样品中的水分直接由冰升华为蒸汽，从而得到干燥的并可保持原状的马铃薯主食样品，有助于保护马铃薯主食样品中原有的化学组成和多孔结构、胶体性质等。重要的是，冷冻干燥处理不会使蛋白质的结构和性质发生变化，有助于定量的精准度。同时，冷冻干燥后的马铃薯主食样品呈海绵状的疏松多孔结构，加入中性缓冲液后可迅速溶解，能够进一步确保测定结果的精准度。

在具体的实施方式中，冷冻干燥的条件可为将马铃薯主食样品在-30℃～-50℃(优选-40℃)条件下进行预冷冻，使其中的水冻结为冰的状态，然后，置于真空冷冻干燥机内进行水分的升华，此阶段的条件为：温度-50℃～-70℃(优选-60℃)，时间48-52h。此种条件下，具有最佳的冷冻干燥效果。

样品中蛋白的溶出程度是影响检测精准度的关键，不同的蛋白提取液对蛋白的溶出程度有较大影响，发明人对蛋白提取液进行了研究，发现以水提取时，蛋白溶解量低、提取时间较长；以NaCl提取液提取时，提取得到的样品含盐量高，电泳条带易发生扩散；以中性缓冲溶液(如磷酸盐缓冲溶液)提取时，蛋白溶解性好，提取时间短，具有良好的提取效率，电泳效果较佳。进一步地，在磷酸盐缓冲溶液中加入NaCl、KCl、SDS、蔗糖、甘氨酸中的至少一种作为添加剂时，提取效率更好，电泳效果更佳。

因此，本发明优选的蛋白提取液为磷酸盐缓冲溶液、磷酸盐-NaCl缓冲溶液、磷酸盐-NaCl-KCl缓冲溶液、磷酸盐-NaCl-KCl-SDS缓冲溶液、Tris-HCl-蔗糖-SDS-甘氨酸缓冲溶液中的一种，最优选为磷酸盐-NaCl-KCl-SDS缓冲溶液。其中，“磷酸盐-NaCl缓冲溶液”代表的含有为磷酸盐缓冲溶液中添加有NaCl。其他提取液的理解与之相同。

NaCl、KCl、SDS、蔗糖、甘氨酸的添加量为本领域技术人员知晓，本发明优选地，NaCl、KCl、SDS、蔗糖、甘氨酸在各缓冲溶液中的添加量各自独立地为：NaCl为0.5％-1.0％(w/v)，KCl为0.01％-0.05％(w/v)，SDS为0.8％-2％(w/v)，蔗糖为15％-20％(w/v)，甘氨酸为1.2％-1.8％(w/v)。

其中，所述“w/v”指的是质量体积比，如1％(w/v)NaCl指的是每100mL磷酸盐缓冲溶液中添加有1mg NaCl。

具体而言，所述中性缓冲溶液选自磷酸盐-(0.5％-1.0％)NaCl缓冲溶液、磷酸盐-(0.5％-1.0％)NaCl-(0.01％-0.05％)KCl缓冲溶液、磷酸盐-(0.5％-1.0％)NaCl-(0.01％-0.05％)KCl-(0.8％-2％)SDS缓冲溶液、Tris-HCl-(15％-20％)蔗糖-(0.8％-2％)SDS-(1.2％-1.8％)甘氨酸缓冲溶液。

优选地，所述中性缓冲溶液的pH值为6.5-7.4。进一步优选为7.0-7.4，最优选为7.4。

作为本发明最佳的技术方案，采用pH值为7.4的磷酸盐-0.8％NaCl-0.05％KCl-1.5％SDS缓冲溶液对样品处理时，蛋白提取最充分，电泳条带最清晰，定量最准确，具有最佳的检测效果。

优选地，所述聚丙烯酰胺凝胶电泳的分离胶浓度为10-15％；进一步优选为10-12.5％，最优为12.5％。

优选地，所述聚丙烯酰胺凝胶电泳的浓缩胶浓度为4-5％。

发明人对恒流、恒压、变压等电泳条件进行了试验，针对本发明的测定对象，当采用恒压或恒流方式时，由于电流或电压逐渐增大，易造成目的条带不清楚、条带不整齐或条带颜色较浅，不利于后期对马铃薯糖蛋白进行定量。变压方式能够较好地克服上述缺陷，且经过研究发现，先高压再低压电泳条件下，如先用120V，再用80V电泳时，则蛋白样品不能很好地在浓缩胶中聚集，易造成目的条带扩散；而先低压再高压能够很好克服上述缺陷，特别地，先用70-90V电压电泳5-15min，再用110-130V电压电泳0.8-1.2h，能够使蛋白样品很好地在上层浓缩胶中聚集，也可以在下层分离胶中逐渐被分离成不同分子量的条带，具有目的条带不弥散、不模糊、带型整齐、定量准确的优势。因此，本发明优选的电泳条件为先用70-90V电压电泳5-15min，再用110-130V电压电泳0.8-1.2h。进一步优选的电泳条件为先用80V电压电泳10min，再用120V电压电泳1h。

优选地，采用如下方法制备上样样品：向所述主食粉标准溶液和主食标准溶液中加入上样缓冲溶液，沸水浴加热处理1-10min，离心，取上清液，即得。

其中，所述上样缓冲溶液为还原型或非还原型上样缓冲溶液，本发明优选还原型上样缓冲液。还原型上样缓冲溶液中的巯基乙醇能够破坏蛋白分子间的二硫键，有助于蛋白和SDS的结合；此外，加热也可使蛋白样品发生变性，从而促进蛋白与SDS的充分结合，与直接上样相比，此种上样方式得到的电泳条带更加清晰、干扰条带更少、定量准确度更高、相关性更好。

优选地，电泳结束后，采用考马斯亮蓝对电泳后的凝胶进行染色。具体染色方法可为：将凝胶置于容器中，加入考马斯亮蓝R250染色液，震荡染色2-4h后，弃去染色液；加入脱色液，震荡脱色1-3h，脱色期间更换脱色液3-4次。

作为本发明最佳的技术方案，包括如下步骤：

(一)绘制标准工作曲线

(1)将小麦粉和马铃薯粉按照(0-10)：(10-0)的重量比例混合，得若干马铃薯主食粉样品，备用；以所述马铃薯主食粉为原料，将其制作成若干个马铃薯主食样品，备用；

(2)取所述马铃薯主食粉样品和马铃薯主食样品，分别加入pH值为6.5-7.4的中性缓冲溶液，超声，离心，取上清液，得不同浓度梯度的主食粉标准溶液和主食标准溶液；

(3)向所述主食粉标准溶液和主食标准溶液中加入上样缓冲溶液，采用10-12.5％的聚丙烯酰胺凝胶电泳进行检测，先用70-90V电压电泳5-15min，转用110-130V电压电泳0.8-1.2h；对所得电泳图中的马铃薯糖蛋白进行定量分析，以小麦粉和马铃薯粉的混合比例为横坐标，马铃薯糖蛋白量为纵坐标，绘制标准工作曲线，分别得马铃薯主食粉回归方程和马铃薯主食回归方程；

(二)检测待测样品中马铃薯粉添加量

取待测样品，按照步骤(2)和(3)的操作对所述待测样品进行处理，当所述待测样品为马铃薯主食粉时，依据马铃薯主食粉回归方程，计算得到待测样品中马铃薯粉的添加量；当所述待测样品为马铃薯主食时，依据马铃薯主食回归方程，计算得到待测样品中马铃薯粉的添加量。

发明人研究发现，马铃薯中含有的马铃薯糖蛋白(Patatin)与马铃薯粉在主食粉和主食中的添加量呈线性关系，且得到的回归方程的R²在0.97-0.99之间，说明本发明的方法可通过Patatin的含量对主食粉或主食中的马铃薯粉进行定性和定量分析。

其中，本发明对所得电泳图中的马铃薯糖蛋白进行定量分析可采用Image J软件进行。

在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可以相互组合，即得本发明各较佳实例。

本发明涉及到的原料和试剂均可市购获得。

本发明取得了如下积极效果：本发明不仅可以快速检测出马铃薯主食专用粉及马铃薯主食中是否添加马铃薯粉，而且可以计算出马铃薯粉的具体添加量；本发明只需要离心机、电泳仪等装置，操作简单，可以广泛推广；本发明所得结果清晰可见，重复性好，准确率高。

附图说明

图1为实施例1中马铃薯主食专用粉中Patatin的含量；

图2为实施例2中马铃薯馒头中Patatin的含量。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。实施例中涉及的操作如无特殊说明，均为本领域常规技术操作。

实施例1 检测马铃薯主食专用粉中马铃薯粉的添加量

包括如下步骤：

(1)配制混合粉：按照小麦粉与马铃薯粉的重量比例分别为10:0，9:1，8:2，7:3，6:4，5:5，4:6，0:10配制混合粉，备用；

(2)制备标准溶液：将步骤(1)的7个混合粉分别与pH 7.4的磷酸盐-0.8％NaCl-0.05％KCl-1.5％SDS缓冲溶液以1:8(固液比)混合摇匀后，超声波辅助提取80min，将所得提取液置于高速离心机中，10000-12000g离心10-15min，弃去沉淀，收集上清液，旋转蒸发浓缩或冻干后，用pH 7.4的磷酸盐-0.8％NaCl-0.05％KCl-1.5％SDS缓冲溶液复溶，即得；

(3)制备上样溶液：向步骤(2)得到的溶液中加入还原型上样缓冲溶液，沸水浴加热处理5min，离心，取上清液，即得；

(4)电泳：采用12.5％的聚丙烯酰胺凝胶电泳进行检测(浓缩胶浓度5％)，先用80V电压电泳10min，转用120V电压电泳1h；

(5)染色及脱色：凝胶置于保鲜盒中，加入50mL考马斯亮蓝R250染色液，震荡染色3h后，弃去染色液；加入50mL脱色液，震荡脱色2h，脱色期间需更换脱色液3-4次。

(6)定量分析：采用Image J软件对所得电泳图中的马铃薯糖蛋白进行定量分析，以小麦粉和马铃薯粉的重量比例为横坐标，马铃薯糖蛋白量为纵坐标，绘制标准工作曲线，得回归方程为y＝0.19x+0.59，R²＝0.97(如图1所示)。

(7)待测样品检测：自制马铃薯粉与小麦粉重量比为11:9的马铃薯主食专用粉(待测样品)；采用与步骤(2)-(6)相同的方法，仅将混合粉替换为所述待测样品，并将得到的Patatin数值带入回归方程，得马铃薯粉的添加量为54.56％。

实施例2 检测马铃薯主食专用粉中马铃薯粉的添加量

(1)配制混合粉：按照小麦粉与马铃薯粉的重量比例分别为10:0，9:1，8:2，7:3，6:4，5:5，4:6，0:10配制混合粉，备用；

(2)制备马铃薯馒头：取上述7种混合粉，分别向其中加入0.4％的糖、1％的羧丙基甲基纤维素(HPMC)、0.5％的谷朊粉、1％的大豆蛋白、65％-75％的水，倒入和面机中，将0.5％的酵母用水溶解混匀后，也倒入和面机内，在120rpm下搅拌10min，于室温下放置10min，形成生面团；将生面团压成5mm的薄面片，并将薄面片反复折叠辊压8次，使面片厚薄均匀、形态平整、质地细腻；将面片切割成150g左右的面团，揉捏成椭圆形；将椭圆形的面团放入37℃、相对湿度为80％的发酵箱中醒发1h；醒发后的面团用沸水蒸制30min，即得7种马铃薯馒头。

(3)制备标准溶液：各取7种马铃薯馒头样品，冷冻干燥后，分别与pH 7.4的磷酸盐-0.8％NaCl-0.05％KCl-1.5％SDS缓冲溶液以1:8(固液比)比例混合摇匀后，超声波辅助提取80min，将所得提取液置于高速离心机中，于10000-12000g离心10-15min，弃去沉淀，收集上清液，旋转蒸发浓缩或冻干后，用pH 7.4的磷酸盐-0.8％NaCl-0.05％KCl-1.5％SDS缓冲溶液复溶，即得；

(4)制备上样溶液：向步骤(3)得到的溶液中加入还原型上样缓冲溶液，沸水浴加热处理5min，离心，取上清液，即得；

(5)电泳：采用12.5％的聚丙烯酰胺凝胶电泳进行检测(浓缩胶浓度5％)，先用80V电压电泳10min，转用120V电压电泳1h；

(6)染色及脱色：凝胶置于保鲜盒中，加入50mL考马斯亮蓝R250染色液，震荡染色3h后，弃去染色液；加入50mL脱色液，震荡脱色2h，脱色期间需更换脱色液3-4次。

(7)定量分析：采用Image J软件对所得电泳图中的马铃薯糖蛋白进行定量分析，以小麦粉和马铃薯粉的重量比例为横坐标，马铃薯糖蛋白量为纵坐标，绘制标准工作曲线，得回归方程为y＝0.23x+0.67，R²＝0.99，如图2所示。

(8)待测样品检测：采用与步骤(2)相同的方法，自制小麦粉和马铃薯粉的比例为11:9的马铃薯馒头(待测样品)，采用与步骤(3)-(7)相同的方法，对所述待测样品进行检测，并将得到的Patatin数值带入回归方程，得马铃薯粉的添加量为55.23％。

实施例3 检测市售产品中马铃薯粉的添加量

采用与实施例2相同的方法，对市售海乐达有限公司生产的两种海达马铃薯馒头(马铃薯粉添加量分别为30％和55％)进行检测，将Patatin的数值带入回归方程，得30％和55％马铃薯馒头中马铃薯粉的添加量分别为30.79％和55.08％。

可以看出，采用本发明所述的方法，可实现对马铃薯主食专用粉和马铃薯主食中的马铃薯粉含量的定量检测，具有定量准确，操作简便的优势。本领域技术人员可以理解，采用本领域常规的面包或面条制作方法，采用与上述实施例相同的蛋白提取方法，电泳条件，能够实现基本相同的定量效果。

虽然，上文中已经用一般性说明、具体实施方式及试验，对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。