一种PEG‑PCL‑PEG三嵌段共聚物修饰的羟基积雪草苷脂质体及其应用

技术领域

本发明属于药物制剂、皮肤护理用品和日化领域，具体涉及一种PEG-PCL-PEG三嵌段共聚物修饰的羟基积雪草苷脂质体及其应用。

背景技术

羟基积雪草苷(Madecassoside，MA)是积雪草提取物中的一种三萜皂苷，水溶性好，结构中含有三糖链，分子量也较大。在临床上作为广泛应用于治疗手术创伤、烫伤、烧伤等皮肤创伤药物中的主要成分，具有抑菌、消炎、促进成纤维细胞再生等多种药理作用。但是由于它们是极性大分子物质，不易透过皮肤表皮到达病变部位，致使其药效及应用受到一定限制。

脂质体(liposome)是由磷脂在水中自发形成的可以包封药物的囊泡。因其制备工艺简单，且在人体内具有无毒、无免疫原性、可降解、缓释、靶向等特点而常被用作药物载体，利用自身与细胞膜在结构上高度的相似性的特点，将药物送入细胞内部或组织间隙，可用于转基因技术或药物制备方面。

皮肤在作为保护人体的第一道屏障的同时也对药物的有效透过形成阻碍。选取脂质体作为载体来包裹药物，靶向给药于皮肤，以增强药物透过皮肤的能力，促进皮肤伤口的有效愈合。

发明内容

为了克服现有技术的缺点与不足，本发明的首要目的在于提供一种PEG-PCL-PEG三嵌段共聚物修饰的羟基积雪草苷脂质体。

为使MA脂质体更好地发挥促进伤口愈合的功效，本发明针对其皮肤给药时易流动的特性，提供一种乳剂法制备具有更好皮肤黏贴性和烫伤治疗效果的改性脂质体技术。

本发明所述的PECE改性脂质体采用乳剂法，将MA包封在脂质体中。所述脂质体不仅具有长效缓释作用，有利于发挥抑菌、消炎、促进成纤维细胞再生作用；还可有效透过表皮，从而使得更多的药物成分停留在真皮层，提高生物利用率，促进伤口的愈合。再者，PECE的添加，可增强脂质体与皮肤的黏贴性，更好地发挥长效缓释作用。

本发明的另一目的在于提供上述PEG-PCL-PEG三嵌段共聚物修饰的羟基积雪草苷脂质体的制备方法。

本发明的再一目的在于提供上述PEG-PCL-PEG三嵌段共聚物修饰的羟基积雪草苷脂质体的应用。

本发明的目的通过下述技术方案实现：

一种PEG-PCL-PEG三嵌段共聚物修饰的羟基积雪草苷脂质体，所述脂质体包括PECE(PEG-PCL-PEG三嵌段聚合物)、羟基积雪草苷(MA)、胆固醇和脂质成分；所述羟基积雪草苷包封于脂质体中；本发明制备的脂质体施用于皮肤可以由液体转变成凝胶态或膏状，具有良好的皮肤黏贴性和烫伤治疗效果，十分适合于皮肤给药。

所述的脂质成分为磷脂，包括天然磷脂或合成磷脂，具体包括蛋黄卵磷脂、大豆卵磷脂、HSPC(氢化大豆卵磷脂)等。

上述PEG-PCL-PEG三嵌段共聚物修饰的羟基积雪草苷脂质体的制备方法，包括如下步骤：

(1)称取PEG-PCL-PEG三嵌段聚合物与脂质成分、胆固醇，以及少量的抗氧化剂溶解于一定量的有机溶剂中，获得有机相溶液；

(2)将含有羟基积雪草苷的水相溶液加入步骤(1)获得的有机相溶液中，搅拌，形成W/O乳剂，或者将上述W/O乳剂再加入到第二水相中，搅拌，形成W/O/W复乳；

(3)将步骤(2)中的W/O乳剂或W/O/W复乳减压蒸发除去有机溶剂，再真空干燥除去乳液中的剩余有机溶剂，过滤膜，制得PEG-PCL-PEG三嵌段共聚物修饰的羟基积雪草苷脂质体；4℃环境下保存，备用。

优选的，步骤(1)中所述的脂质成分为磷脂，优选为蛋黄卵磷脂、大豆卵磷脂、HSPC(氢化大豆卵磷脂)等；PEG-PCL-PEG三嵌段聚合物与脂质成分的质量比为(0.5～1)：1，优选为(0.8～1)：1，更优选为1:1；所述的抗氧剂为维生素C、BHA(丁基羟基茴香醚)、维生素E醋酸酯(V_E醋酸酯)；所述的有机溶剂优选为乙醚、二氯甲烷、三氯甲烷等。

所述的脂质成分与胆固醇的质量比为5：1。

优选的，步骤(1)中所述的有机相溶液中胆固醇的浓度为10～50mg/mL，优选为10mg/mL。

优选的，步骤(1)中所述的有机相溶液中抗氧剂的浓度为5mL/L；

优选的，步骤(2)中所述水相或第二水相为含有羟基积雪草苷的水溶液或PBS溶液，浓度为1～160mg/mL，优选20mg/mL；搅拌时间为1～30min，优选为1～10min，更优选5min；搅拌转速100～1000rpm，优选为400～1000rpm，更优选500rpm；复乳法第二次搅拌时间1～30min，优选为3～5min，更优选5min；搅拌转速100～1000rpm，优选为500～800rpm，更优选500rpm。

优选的，步骤(3)中所述滤膜的孔径为0.22～1μm，优选0.45μm；通过W/O乳剂制备的羟基积雪草苷脂质体优选油性滤膜，通过W/O/W复乳制备的MA脂质体优选水性滤膜，更优选为聚碳酸酯滤膜。

步骤(1)中所述的PEG-PCL-PEG三嵌段共聚物的制备方法，包括如下步骤：

加入己内酯(ε-CL)与聚乙二醇单甲醚(MPEG)，在催化剂的作用下，ε-CL中酯键断裂，与MPEG中的羟基反应生成新的酯键，即PEG-PCL片段(第一步反应)，然后加入六亚甲基二异腈酸酯(HMDI)，其中的异氰酸酯基团与PEG-PCL中生成的羟基继续反应生成酰胺键(第二步反应)，纯化后获得PEG-PCL-PEG三嵌段聚合物(PECE)，真空干燥至恒重备用；该聚合物是一种可生物降解的温敏性材料。

第一步反应原料比n_(MPEG)：n_(ε-CL)为1：(1～15)，优选为1：(5～15)，更优选为1:10；反应条件为100～200℃反应4～15h，优选为120℃反应12h；

第二步反应原料比n_(ε-CL)：n_(HMDI)之比为(1～15)：1，优选为10:1；反应条件为50～100℃反应3～9h，优选为80℃反应6h；

在该最优化条件下，分别对第一步反应产物PEG-PCL和第二步反应产物PEG-PCL-PEG进行红外波谱表征。

所述的催化剂为辛酸亚锡。

上述PEG-PCL-PEG三嵌段共聚物修饰的羟基积雪草苷脂质体在药物制剂或护肤化妆品技术领域的应用。

优选的，上述羟基积雪草苷脂质体在制备治疗皮肤烫伤、皮肤切割伤、粘膜损伤或瘢痕的透皮或粘膜吸收药物制剂中的应用；

优选的，上述羟基积雪草苷脂质体在制备用于疤痕修复、深层皮肤受损或抗衰老抗氧化或美白养颜的护肤化妆品中的应用。

本发明的机理是：

PEG-PCL-PEG系分子量较低的三嵌段共聚物，其特定浓度范围内的水溶液在受到外界环境(如温度、PH、压力等)刺激后能产生溶液与凝胶状态的转换，在药物控释、细胞包埋和组织修复等原位凝胶领域方面具有广阔的应用前景。经PEG-PCL-PEG修饰的MA脂质体，在大鼠二级烫伤试验中表现出良好的皮肤黏贴性和烫伤治疗效果。

脂质体载药系统与皮肤组织具有良好的生物相容性，能载药透过表皮，将药物递送至真皮治疗部位，可作为外用制剂施用于皮肤，然而脂质体流动性大，限制了这一应用。因此，本发明针对药物溶液或其脂质体制剂流动性较强，药物容易流失，且难以长时间驻留于皮肤表面等缺点，合成PEG-PCL-PEG(PECE)三嵌段共聚物温敏材料，采用乳剂法制备羟基积雪草苷(MA)脂质体的过程中均匀加入(PECE)，通过优化PECE的合成条件以及PECE与脂质的比例，获得PECE修饰的MA脂质体，具有适宜的相转变温度，使其在体表温度时呈凝胶态或半固体膏状，制备出具有良好皮肤黏贴性和烫伤治疗效果的PEG-PCL-PEG修饰的羟基积雪草苷脂质体，优化出最佳制备工艺。

本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：

(1)本发明以乳化剂法为基础，将温敏材料PECE巧妙运用到MA脂质体的制备过程中，改善了MA脂质体易流动，涂药不便，皮肤粘附性差的问题；PECE修饰的MA脂质体呈凝胶态或膏状，便于皮肤给药，且在大鼠烫伤实验中的治疗效果明显高于MA脂质体。

(2)本发明制备的PECE修饰的MA脂质体由液态转变为凝胶态或膏状的相转变温度为18～32℃，该特点突出解决了MA溶液或常规MA脂质体流动性强造成的皮肤涂药容易流失等问题。

(3)本发明所述的PECE修饰的MA脂质体经皮给药系统与普通皮肤局部应用制剂相比，具有长效缓释性，脂质体包裹MA透过角质层后，可以在表皮、真皮内形成药物贮库，使药物缓慢释放，直接持久地对伤口病变部位发挥治疗作用。

(4)本发明以PECE来修饰MA脂质体，可提高药物与皮肤的贴合效果，特别是将其施用于皮肤可以由液体转变成膏状，起到药物储库的作用，延长了MA与皮肤的作用时间，长效缓释，增强治疗效果。本发明方法制备工艺简单，易于放大，对于以后大规模医药生产及其潜在的医疗用途具有广阔的应用前景。

附图说明

图1是实施例2中合成的第一步反应产物PEG-PCL的红外光谱图。

图2是实施例2中合成的第二步反应产物PEG-PCL-PEG的红外光谱图。

图3是实施例2中制得的PECE修饰的MA脂质体的粒径大小分布图。

图4是实施例2中制得的PECE修饰的MA脂质体的冷场扫描电镜图。

图5是实施例2中制得的PECE修饰的MA脂质体在4℃与32℃放置的状态对比图。

图6是实施例2中制得的PECE修饰的MA脂质体在烫伤实验中的治疗效果。

具体实施方式

下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明内。

本发明实施例使用的主要试剂：

聚乙二醇单甲醚(MPEG，Mn＝550，TCL，分析纯)

己内酯(ε-CL，Macklin，分析纯)

辛酸亚锡(Sn(Oct)₂，萨恩化学技术上海有限公司)

六亚甲基二异氰酸酯(HMDI，Macklin，分析纯)

实施例1

(1)称取5.05g MPEG与10.96gε-CL(n_(MPEG)：n_(ε-CL)为1:10)与圆底烧瓶中，加入0.08g辛酸亚锡(Sn(Oct)₂)在120℃反应12h后，加入1.66g>(ε-CL)：n_(HMDI)之比为10:1)在80℃反应6h，纯化后，获得PEG-PCL-PEG三嵌段聚合物(PECE)，真空干燥至恒重备用。

(2)称取PECE 0.50g，蛋黄卵磷脂0.50g、胆固醇0.10g、V_E醋酸酯0.05mL溶于10mL二氯甲烷中制成有机相溶液；

(3)将20mg/mL羟基积雪草苷溶液溶于步骤(2)制成的有机相溶液中，再以500r/min搅拌5min，形成W/O乳剂；

(4)将步骤(3)中的W/O乳剂转移到茄形瓶中，通过旋转蒸发仪减压蒸发除去有机溶剂；再将茄形瓶放入真空干燥箱内干燥，除去乳液中的剩余有机溶剂，超声60s后，过0.45μm油性滤膜，制得PEG-PCL-PEG三嵌段共聚物修饰的羟基积雪草苷脂质体溶液，并置于4℃下保存。

实施例2

(1)称取5.05g MPEG与10.96gε-CL(n_(MPEG)：n_(ε-CL)为1:10)与圆底烧瓶中，加入0.08g辛酸亚锡(Sn(Oct)₂)在120℃反应12h后，加入1.66g>(ε-CL)：n_(HMDI)之比为10:1)在80℃反应6h，纯化后，真空干燥至恒重备用。

分别对第一步反应产物PEG-PCL和第二步反应产物PEG-PCL-PEG进行红外波谱表征。结果如图1和2所示，从图1中可知，在1700～1750波段出现了很强的羰基的吸收峰，意味着ε-CL与MPEG之间反应生成了酯键；从图2种可以看到，在2250～2270之间没有出现吸收峰，说明HMDI完全参与反应生成了PEG-PCL-PEG，再者出现了酰胺键的特征吸收峰，进一步证明了PEG-PCL-PEG的合成。

(2)称取PECE 0.50g、蛋黄卵磷脂0.50g、胆固醇0.10g、V_E醋酸酯0.05mL溶于10mL二氯甲烷中制成有机相溶液；

(3)将20mg/mL MA溶液溶于步骤(2)制成的有机相溶液中，再以500r/min搅拌5min，形成W/O乳剂；再将上述W/O乳剂加入到20mg/mL MA的PBS溶液中，以500r/min第二次搅拌5min，形成W/O/W复乳；

(4)将步骤(3)中的W/O/W复乳转移到茄形瓶中，通过旋转蒸发仪减压蒸发除去有机溶剂；再将茄形瓶放入真空干燥箱内干燥，除去乳液中的剩余有机溶剂，超声60s后，过0.45μm水性滤膜，制得PEG-PCL-PEG三嵌段共聚物修饰的羟基积雪草苷脂质体溶液，并置于4℃下保存。

(5)将步骤(4)中制备的样品，用马尔文粒径分析仪进行粒度分布测试，冷场扫描电镜(SEM)观察表观形貌并探究相转变温度；

样品粒径大小分布图如图3所示，从图中可知，PECE修饰的MA脂质体粒径比较均一，粒径约为200nm。

样品冷场扫描电镜图如图4所示，从图中可知，PECE修饰的MA脂质体的表观形貌呈分散的球状。

样品在4℃与32℃放置的状态对比图如图5所示，从图中可知，PECE修饰的MA脂质体在4℃时呈流动态，在32℃则呈半膏状固体。

(6)取8只SD大鼠单笼饲养，自由饮食饮水，室温下12h有光，12h黑暗。将所有大鼠用戊巴比妥钠(40mg/kg)腹腔注射麻醉后，机械剃去背部鼠毛，剩余鼠毛用8％的Na₂S溶液除去。24h后造成二级烫伤模型，随机分成PBS溶液组，PECE载药组，MA脂质体组和PECE修饰的MA脂质体组，每组各2只大鼠，每只大鼠背部6个伤口。各组大鼠每天给药2次，观察并记录创面伤口愈合情况。PECE修饰的MA脂质体在烫伤实验中的治疗效果如图6所示，从图中可知，PECE修饰的MA脂质体的治愈指数在整个伤口愈合期均比MA脂质体的高，治愈效果更好，其次是PECE载药组，PBS溶液组。

实施例3

(1)称取2.14g MPEG与6.67gε-CL(n_(MPEG)：n_(ε-CL)为1:15)与圆底烧瓶中，加入0.05g辛酸亚锡(Sn(Oct)₂)在100℃反应15h后，加入0.65g>(ε-CL)：n_(HMDI)之比为15:1)在50℃反应9h，纯化后，真空干燥至恒重备用。

(2)称取PECE 0.40g、氢化大豆卵磷脂(HSPC)0.50g、胆固醇0.10g、BHA 0.05mL溶于10mL三氯甲烷中制成有机相溶液；

(3)将160mg/mL MA溶液溶于步骤(2)制成的有机相溶液中，再以800r/min搅拌3min，形成W/O乳剂；再将上述W/O乳剂加入到160mg/mL MA水溶液中，以800r/min第二次搅拌3min，形成W/O/W复乳；

(4)将步骤(3)中的W/O/W复乳转移到茄形瓶中，通过旋转蒸发仪减压蒸发除去有机溶剂；再将茄形瓶放入真空干燥箱内干燥，除去乳液中的剩余有机溶剂，超声60s后，过0.45μm水性滤膜，制得PEG-PCL-PEG三嵌段共聚物修饰的羟基积雪草苷脂质体溶液，并置于4℃下保存。

实施例4

(1)称取3.46g MPEG与3.59gε-CL与圆底烧瓶中(n_(MPEG)：n_(ε-CL)为1:5)，加入0.04g辛酸亚锡(Sn(Oct)₂)在120℃反应12h后，加入5.29g>(ε-CL)：n_(HMDI)之比为1:1)在60℃反应8h，纯化后，真空干燥至恒重备用。

(2)称取PECE 0.40g、蛋黄卵磷脂0.50g、胆固醇0.10g、V_E醋酸酯0.05mL溶于10mL二氯甲烷中制成有机相溶液；

(3)将160mg/mL羟基积雪草苷溶液溶于步骤(2)制成的有机相溶液中，再以400r/min搅拌10min，形成W/O乳剂；

(4)将步骤(3)中的W/O乳剂转移到茄形瓶中，通过旋转蒸发仪减压蒸发除去有机溶剂；再将茄形瓶放入真空干燥箱内干燥，除去乳液中的剩余有机溶剂，超声60s后，过0.45μm油性滤膜，制得PEG-PCL-PEG三嵌段共聚物修饰的羟基积雪草苷脂质体溶液，并置于4℃下保存。

实施例5

(1)称取2.68g MPEG与4.45gε-CL(n_(MPEG)：n_(ε-CL)为1:8)与圆底烧瓶中，加入0.04g辛酸亚锡(Sn(Oct)₂)在180℃反应8h后，加入1.64g>(ε-CL)：n_(HMDI)之比为4:1)在100℃反应3h，纯化后，真空干燥至恒重备用。

(2)称取PECE 0.40g、氢化大豆卵磷脂(HSPC)0.50g、胆固醇0.10g、维生素C0.05mL溶于10mL乙醚中制成有机相溶液；

(3)将5mg/mL羟基积雪草苷溶液溶于步骤(2)制成的有机相溶液中，再以500r/min搅拌5min，形成W/O乳剂；再将上述W/O乳剂加入到5mg/mL MA的PBS溶液中，以500r/min第二次搅拌5min，形成W/O/W复乳；

(4)将步骤(3)中的W/O/W复乳转移到茄形瓶中，通过旋转蒸发仪减压蒸发除去有机溶剂；再将茄形瓶放入真空干燥箱内干燥，除去乳液中的剩余有机溶剂，超声60s后，过0.45μm水性滤膜，制得PEG-PCL-PEG三嵌段共聚物修饰的羟基积雪草苷脂质体溶液，并置于4℃下保存。

实施例6

(1)称取2.52g MPEG与6.27gε-CL(n_(MPEG)：n_(ε-CL)为1:12)与圆底烧瓶中，加入0.05g辛酸亚锡(Sn(Oct)₂)在200℃反应4h后，加入0.65g>(ε-CL)：n_(HMDI)之比为14:1)在50℃反应9h，纯化后，真空干燥至恒重备用。

(2)称取PECE 0.50g、大豆卵磷脂0.50g、胆固醇0.10g、维生素C 0.05mL溶于10mL三氯甲烷中制成有机相溶液；

(3)将40mg/mL羟基积雪草苷溶液溶于步骤(2)制成的有机相溶液中，再以1000r/min搅拌1min，形成W/O乳剂；

(4)将步骤(3)中的W/O乳剂转移到茄形瓶中，通过旋转蒸发仪减压蒸发除去有机溶剂；再将茄形瓶放入真空干燥箱内干燥，除去乳液中的剩余有机溶剂，超声60s后，过0.45μm油性滤膜，制得PEG-PCL-PEG三嵌段共聚物修饰的羟基积雪草苷脂质体溶液，并置于4℃下保存。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。