一种ABO血型正定型及RhD血型检测卡及其制备方法

技术领域

本申请涉及血型定型卡领域，特别涉及一种ABO血型正定型及RhD血型检测卡及其制备方法。

背景技术

ABO 血型系统和Rh血型系统是人类最为重要的两个血型系统，高度的免疫原性使二者具有重要的临床意义，在急诊抢救、手术治疗、贫血治疗、输血前检查等过程中都是不可缺少的，试验结果的正确与否直接关系到病人的生命安危。

根据红细胞膜表面有无A抗原和（或）B抗原，将血型分为A型、B型、AB型及O型四种。Rh血型系统在输血医学中的重要性仅次于ABO血型系统，Rh系统主要的抗原有D、C、c、E、e抗原，因为D抗原的免疫原性远远强于其他Rh抗原，所以临床中通常根据D抗原的有无将人群的Rh血型分为“Rh阴性”与“Rh阳性”两类。

目前，市面上已经有很多ABO血型正定型及RhD血型检测卡产品，但是大多数产品中葡聚糖凝胶采用生理盐水进行溶胀，溶胀后的葡聚糖凝胶与抗体混合后，不能长期维持抗体的稳定性，在产品放置较长时间后，检测结果的准确性显著下降。

发明内容

针对现有技术中ABO血型正定型及RhD血型检测卡长期储存抗体稳定性不高的问题，本申请提供了一种ABO血型正定型及RhD血型检测卡及其制备方法。

第一方面，本申请提供了一种ABO血型正定型及RhD血型检测卡，是通过以下技术方案得以实现的：

一种ABO血型正定型及RhD血型检测卡，包括八个微柱凝胶管，八个所述微柱凝胶管包括两管含有IgM 性质的单克隆抗A 抗体的凝胶管、两管含有IgM 性质的单克隆抗B抗体的凝胶管、两管含有IgM 性质的单克隆抗D抗体的凝胶管以及两管空白凝胶管；所述凝胶均包括凝胶溶胀液和聚丙烯酰胺葡聚糖，所述凝胶溶胀液包括以下组分：

磷酸二氢钠 0.1-0.4g/L；

磷酸氢二钠 0.1-0.4g/L；

NaCl 1-2 g/L；

肝素钠 3-5 g/L；

多元醇 5-8g/L；

环糊精 1-2 g/L；

甘露糖基甘油酸 0.05-0.08g/L。

通过采用上述技术方案，本申请的凝胶溶胀液包括缓冲组分、盐、抗凝剂以及抗体稳定剂，以上成分的组合不仅可以很好的溶胀葡聚糖，使凝胶颗粒呈圆球颗粒，从而更好的截留凝集或致敏的红细胞，提高检测的灵敏度，还能够提高抗体的稳定性，使抗体在较高的活性状态下保持较长时间。具体的，缓冲组分可以保持整个体系处于要求的缓冲范围内，为抗体的保存提供了最适宜的pH；本申请在缓冲体系中进一步加入较低浓度的盐，可以使葡聚糖充分溶胀，使凝集的红细胞更容易被截留在胶体上，未凝集的红细胞更容易穿过凝胶颗粒间隙到达凝胶管的底部，使结果更容易判读，另外，盐的加入还可以进一步提高抗体的稳定性，防止抗体在储存过程中发生沉淀、凝集；抗凝剂的加入一方面可以提高抗体的稳定性，另一方面还可以提高待测样本中红细胞的稳定性，提高检测结果的准确性；本申请三种抗体稳定剂的复配，可以有效维持抗体的物理性质、化学性质、生物性质的稳定性，不会随着保存时间的延长和条件的改变，出现较大的差异，从而保证了检测结果的准确性，提高了检测卡的使用有效期。

可选的，所述凝胶溶胀液包括以下组分：

磷酸二氢钠 0.2-0.3g/L；

磷酸氢二钠 0.2-0.3g/L；

NaCl 1.4-1.6 g/L；

肝素钠 3.5-4.5 g/L；

多元醇 6-7g/L；

环糊精 1.5-1.8 g/L；

甘露糖基甘油酸 0.06-0.07g/L。

通过采用上述技术方案，本申请进一步对凝胶溶胀液各组分的用量进行限定，从而可以更好的提高检测结果的准确性，以及延长血型检测卡的使用期限。

可选的，所述多元醇选用山梨醇或甘露醇。

通过采用上述技术方案，本申请的多元醇选用山梨醇或甘露醇，二者均可以较好的提高抗体的稳定性，而且两种组分价格低廉，降低了产品的成本。

可选的，所述凝胶溶胀液还包括10-15mg/L防腐剂。

通过采用上述技术方案，本申请在凝胶溶胀液中进一步加入防腐剂，防腐剂的加入可以防止抗体在长期储存过程中细菌的滋生，避免形成与抗体结合的蛋白，降低了假阳性的发生率，从而提高了检测结果的准确性。

可选的，所述防腐剂选用硫柳汞或单辛酸甘油酯。

通过采用上述技术方案，本申请的硫柳汞或单辛酸甘油酯均对微生物具有较强的抗性，且抗菌谱较广，能够有效抑制凝胶管中有害微生物的滋生。

第二方面，本申请提出了一种ABO血型正定型及RhD血型检测卡的制备方法，是通过以下技术方案得以实现的：

一种ABO血型正定型及RhD血型检测卡的制备方法，包括以下步骤：

S1.凝胶溶胀液的配制：称取规定量的磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、NaCl、肝素钠、多元醇、环糊精、甘露糖基甘油酸溶于水中，得到凝胶溶胀液；

S2.凝胶制备：聚丙烯酰胺葡聚糖粉末采用4-6倍体积的步骤S1制备的凝胶溶胀液浸泡24-48h，然后洗涤3-5次，除去凝胶破损碎片和聚集的凝胶颗粒，收集颗粒大小均匀且完整呈球形凝胶颗粒，得到葡聚糖凝胶；

S3.抗体稀释：采用生理盐水对IgM性质的单克隆抗A抗体、IgM性质的单克隆抗B抗体、IgM 性质的单克隆抗D抗体分别进行溶解，使IgM性质的单克隆抗A抗体的效价≥128、IgM 性质的单克隆抗B抗体的效价≥128、IgM性质的单克隆抗D抗体的效价≥64；

S4.凝胶的配制：将步骤S3稀释后的三种抗体分别与步骤S2制备的葡聚糖凝胶按体积比为(1-5):1的比例混合，分别制备得到含IgM性质的单克隆抗A抗体的凝胶、含IgM性质的单克隆抗B抗体的凝胶、含IgM性质的单克隆抗D抗体的凝胶；

S5.分装：将步骤S4制备的三种带有抗体的凝胶和步骤S2制备的凝胶分别加入到不同微柱管中，每种凝胶分装两管，形成八个微柱凝胶管的ABO血型正定型及RhD血型检测卡。

通过采用上述技术方案，本申请将聚丙烯酰胺葡聚糖采用本申请配置的凝胶溶胀液进行溶胀，然后将稀释的抗体与溶胀的聚丙烯酰胺葡聚糖进行混合获得含有抗体的凝胶，再将含有抗体的凝胶加入到凝胶管进行封口。本申请血型检测卡的制备方法简单，适合大规模生产，且制备获得的血型检测卡特异性高，检测结果准确，符合临床快速检测的要求。另外，本申请血型检测卡还具有较长的使用时效，提高了产品的市场竞争力。

可选的，步骤S1中，调节凝胶溶胀液pH值至6.6-6.8。

通过采用上述技术方案，本申请将凝胶溶胀液的pH调节至6.6-6.8，一方面使聚丙烯酰胺葡聚糖更好的溶胀，另一方面在该pH条件下，抗体具有较好的稳定性，提高了抗体的活性，从而提高了检测结果的准确性。

可选的，步骤S2中，聚丙烯酰胺葡聚糖的粒径为20-50nm。

通过采用上述技术方案，本申请的聚丙烯酰胺葡聚糖的粒径限制在20-50nm，可以更好的截留凝集的红细胞，从而使检测结果更加容易判读。

可选的，步骤S2中，浸泡后的聚丙烯酰胺葡聚糖采用凝胶溶胀液洗涤1-2次，再采用蒸馏水洗涤2-3次。

通过采用上述技术方案，本申请将溶胀的聚丙烯酰胺葡聚糖首先采用凝胶溶胀液清洗，再采用蒸馏水清洗，可以有效去除凝胶破损碎片和聚集的凝胶颗粒，从而更好的截留凝集的红细胞。

可选的，步骤S5中，每个微柱管分装20-25μL凝胶。

综上所述，本申请具有以下有益效果：

1、本申请能够准确对待检者ABO/ RhD血型进行检测，降低了交叉配血过程中危险的发生率，且检测过程简单，较短时间内便可获得检测结果，提高了临床检测的效率；

2、本申请的凝胶溶胀液一方面可以对葡聚糖进行充分溶胀，提高了检测的灵敏度，另一方面可以使抗体在较长时间内保持较高的活性，提高了检测结果的准确性、可靠性，延长了产品的使用有效期；

3、本申请的检测卡制备方法简单，适合大规模生产。

具体实施方式

以下结合实施例对本申请作进一步详细说明。

本申请的肝素钠购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司；

本申请的甘露糖基甘油酸购自爱必信(上海)生物科技有限公司；

本申请的硫柳汞购自陕西缔都医药化工有限公司；

本申请的单辛酸甘油酯青岛华之元食品添加剂有限公司。

制备例1

凝胶溶胀液的配制：

称取0.1g磷酸二氢钠、0.4g磷酸氢二钠、1g NaCl、5 g肝素钠、5g山梨醇、2 g环糊精、0.05g甘露糖基甘油酸溶于1L水中，调节溶液pH至6.8，得到凝胶溶胀液。

制备例2

凝胶溶胀液的配制：

称取0.4g磷酸二氢钠、0.1g磷酸氢二钠、2 g NaCl、3g肝素钠、8g甘露醇、1 g环糊精、0.08g甘露糖基甘油酸溶于1L水中，调节溶液pH至6.6，得到凝胶溶胀液。

制备例3

凝胶溶胀液的配制：

称取0.2g磷酸二氢钠、0.3g磷酸氢二钠、1.4g NaCl、4.5 g肝素钠、6g山梨醇、1.8g环糊精、0.06g甘露糖基甘油酸溶于1L水中，调节溶液pH至6.7，得到凝胶溶胀液。

制备例4

凝胶溶胀液的配制：

称取0.3g磷酸二氢钠、0.2g磷酸氢二钠、1.6g NaCl、3.5 g肝素钠、7g甘露醇、1.5g环糊精、0.07g甘露糖基甘油酸溶于1L水中，调节溶液pH至6.7，得到凝胶溶胀液。

制备例5

凝胶溶胀液的配制，与制备例1的不同指出在于：还加入10mg硫柳汞。

制备例6

凝胶溶胀液的配制，与制备例2的不同指出在于：还加入15mg硫柳汞。

制备例7

凝胶溶胀液的配制，与制备例3的不同指出在于：还加入10mg单辛酸甘油酯。

制备例8

凝胶溶胀液的配制，与制备例4的不同指出在于：还加入15mg单辛酸甘油酯。

实施例1

一种ABO血型正定型及RhD血型检测卡的制备方法，包括以下步骤：

S1.凝胶制备：聚丙烯酰胺葡聚糖粉末采用4倍体积的制备例1制备的凝胶溶胀液浸泡48h，然后采用凝胶溶胀液洗涤2次，再采用蒸馏水洗涤2次，除去凝胶破损碎片和聚集的凝胶颗粒，收集颗粒大小均匀且完整呈球形凝胶颗粒，得到葡聚糖凝胶；聚丙烯酰胺葡聚糖的粒径为20-50nm；

S2.抗体稀释：采用生理盐水对IgM性质的单克隆抗A抗体、IgM性质的单克隆抗B抗体、IgM 性质的单克隆抗D抗体分别进行溶解，使IgM性质的单克隆抗A抗体的效价≥128、IgM 性质的单克隆抗B抗体的效价≥128、IgM性质的单克隆抗D抗体的效价≥64；

S3.凝胶的配制：将步骤S2稀释后的三种抗体分别与步骤S1制备的葡聚糖凝胶按体积比为5:1的比例混合，分别制备得到含IgM性质的单克隆抗A抗体的凝胶、含IgM性质的单克隆抗B抗体的凝胶、含IgM性质的单克隆抗D抗体的凝胶；

S4.分装：将步骤S3制备的三种带有抗体的凝胶和步骤S1制备的凝胶分别加入到不同微柱管中，每种凝胶分装两管，每个微柱管分装25μL凝胶，形成八个微柱凝胶管的ABO血型正定型及RhD血型检测卡；

S5. 封口：采用铝箔复合封口膜对本实施例制备的ABO血型正定型及RhD血型检测卡进行热封封口。

实施例2

一种ABO血型正定型及RhD血型检测卡的制备方法，包括以下步骤：

S1.凝胶制备：聚丙烯酰胺葡聚糖粉末采用6倍体积的制备例1制备的凝胶溶胀液浸泡24h，然后采用凝胶溶胀液洗涤1次，再采用蒸馏水洗涤3次，除去凝胶破损碎片和聚集的凝胶颗粒，收集颗粒大小均匀且完整呈球形凝胶颗粒，得到葡聚糖凝胶；聚丙烯酰胺葡聚糖的粒径为20-50nm；

S2.抗体稀释：采用生理盐水对IgM性质的单克隆抗A抗体、IgM性质的单克隆抗B抗体、IgM 性质的单克隆抗D抗体分别进行溶解，使IgM性质的单克隆抗A抗体的效价≥128、IgM 性质的单克隆抗B抗体的效价≥128、IgM性质的单克隆抗D抗体的效价≥64；

S3.凝胶的配制：将步骤S2稀释后的三种抗体分别与步骤S1制备的葡聚糖凝胶按体积比为1:1的比例混合，分别制备得到含IgM性质的单克隆抗A抗体的凝胶、含IgM性质的单克隆抗B抗体的凝胶、含IgM性质的单克隆抗D抗体的凝胶；

S4.分装：将步骤S3制备的三种带有抗体的凝胶和步骤S1制备的凝胶分别加入到不同微柱管中，每种凝胶分装两管，每个微柱管分装20μL凝胶，形成八个微柱凝胶管的ABO血型正定型及RhD血型检测卡；

S5. 封口：采用铝箔复合封口膜对本实施例制备的ABO血型正定型及RhD血型检测卡进行热封封口。

实施例3

一种ABO血型正定型及RhD血型检测卡的制备方法，与实施例1的不同之处在于：步骤S1中，采用制备例2制备的凝胶溶胀液浸泡聚丙烯酰胺葡聚糖粉末。

实施例4

一种ABO血型正定型及RhD血型检测卡的制备方法，与实施例2的不同之处在于：步骤S1中，采用制备例2制备的凝胶溶胀液浸泡聚丙烯酰胺葡聚糖粉末。

实施例5

一种ABO血型正定型及RhD血型检测卡的制备方法，与实施例1的不同之处在于：步骤S1中，采用制备例3制备的凝胶溶胀液浸泡聚丙烯酰胺葡聚糖粉末。

实施例6

一种ABO血型正定型及RhD血型检测卡的制备方法，与实施例2的不同之处在于：步骤S1中，采用制备例3制备的凝胶溶胀液浸泡聚丙烯酰胺葡聚糖粉末。

实施例7

一种ABO血型正定型及RhD血型检测卡的制备方法，与实施例1的不同之处在于：步骤S1中，采用制备例4制备的凝胶溶胀液浸泡聚丙烯酰胺葡聚糖粉末。

实施例8

一种ABO血型正定型及RhD血型检测卡的制备方法，与实施例2的不同之处在于：步骤S1中，采用制备例4制备的凝胶溶胀液浸泡聚丙烯酰胺葡聚糖粉末。

实施例9

一种ABO血型正定型及RhD血型检测卡的制备方法，与实施例1的不同之处在于：步骤S1中，采用制备例5制备的凝胶溶胀液浸泡聚丙烯酰胺葡聚糖粉末。

实施例10

一种ABO血型正定型及RhD血型检测卡的制备方法，与实施例2的不同之处在于：步骤S1中，采用制备例5制备的凝胶溶胀液浸泡聚丙烯酰胺葡聚糖粉末。

实施例11

一种ABO血型正定型及RhD血型检测卡的制备方法，与实施例1的不同之处在于：步骤S1中，采用制备例6制备的凝胶溶胀液浸泡聚丙烯酰胺葡聚糖粉末。

实施例12

一种ABO血型正定型及RhD血型检测卡的制备方法，与实施例2的不同之处在于：步骤S1中，采用制备例6制备的凝胶溶胀液浸泡聚丙烯酰胺葡聚糖粉末。

实施例13

一种ABO血型正定型及RhD血型检测卡的制备方法，与实施例1的不同之处在于：步骤S1中，采用制备例7制备的凝胶溶胀液浸泡聚丙烯酰胺葡聚糖粉末。

实施例14

一种ABO血型正定型及RhD血型检测卡的制备方法，与实施例2的不同之处在于：步骤S1中，采用制备例7制备的凝胶溶胀液浸泡聚丙烯酰胺葡聚糖粉末。

实施例15

一种ABO血型正定型及RhD血型检测卡的制备方法，与实施例1的不同之处在于：步骤S1中，采用制备例8制备的凝胶溶胀液浸泡聚丙烯酰胺葡聚糖粉末。

实施例16

一种ABO血型正定型及RhD血型检测卡的制备方法，与实施例2的不同之处在于：步骤S1中，采用制备例8制备的凝胶溶胀液浸泡聚丙烯酰胺葡聚糖粉末。

对比例1

一种ABO血型正定型及RhD血型检测卡的制备方法，与实施例1的不同之处在于：凝胶溶胀液中不含肝素钠。

对比例2

一种ABO血型正定型及RhD血型检测卡的制备方法，与实施例1的不同之处在于：凝胶溶胀液中不含环糊精。

对比例3

一种ABO血型正定型及RhD血型检测卡的制备方法，与实施例1的不同之处在于：凝胶溶胀液中不含甘露糖基甘油酸。

对比例4

一种ABO血型正定型及RhD血型检测卡的制备方法，与实施例1的不同之处在于：凝胶溶胀液为生理盐水。

一种ABO血型正定型及RhD血型检测卡的制备方法，与实施例1的不同之处在于：

本申请实施例1-16及对比例1-4制备获得的ABO血型正定型及RhD血型检测卡的使用方法如下：

1. ABO血型正定型及RhD血型检测卡，包括八个微柱凝胶管，其中第一和第五为含有IgM 性质的单克隆抗A抗体的凝胶管、第二和第六管为含有IgM 性质的单克隆抗B抗体的凝胶管、第三和第七管为含有IgM 性质的单克隆抗D抗体的凝胶管、第四和第八管为空白凝胶管；

2.用生理盐水将待检者红细胞配置成0.5-0.8%浓度，分别加入第一至第四或第五至第八微管中，每管50μL；

3.混匀后用微柱凝胶卡专用离心机离心，900rpm离心2min，1500rpm离心3min，取出后肉眼判断结果；

4.结果判读：红细胞沉于微柱凝胶的底部为阴性结果，红细胞浮在凝胶表面或胶中为阳性结果，具体判读标准参见表1，判定结果参见表2。

注：“+”为阳性，“0”为阴性；若Ctr管出现阳性、溶血或双群结果，该实验结果无效，需要进一步查明原因。

性能检测实验

采用本申请实施例1-16和对比例1-4制备获得的血型检测卡以及生产18个月和24个月的血型检测卡对确定血型的100例A型血志愿者、100例B型血志愿者、100例AB型血志愿者、100例O型血志愿者、50例RhD阳性志愿者、20例RhD阴性志愿者进行血型检测，实验结果见表3-5。

从表3-5可以看出，本申请实施例1-16制备的血型检测卡不仅可以检测ABO血型，还能够检测RhD血型，检测结果与预定的结果相同，检测结果准确、可靠。另外，采用生产18个月后的血型检测卡对确定血型的样本进行检测时，本申请实施例1-16制备的血型检测卡依旧能够准确检测待测样本，尤其是实施例9-16制备的血型检测卡，在生产24个月后对待检者血型进行检测，实验结果的准确率为100%，使产品具有较长的有效期和较高的准确率。

对比例1-3与实施例1的区别在于凝胶溶胀液中分别不含肝素钠、环糊精和甘露糖基甘油酸，从表3-5中可以看出，采用对比例1-3制备得到的血型检测卡在放置18个月后，对待检者血型进行检测，检测结果准确性下降明显，以上实验结果表明，肝素钠、环糊精和甘露糖基甘油酸可以维持抗体的长期稳定性，从而提高检测结果的准确性。

对比例4与实施例1的区别在于采用生理盐水作为凝胶溶胀剂，从表3-5可以看出，采用对比例4制备得到的血型检测卡在放置18个月后，对待检者血型进行检测，检测结果的准确性非常差，以上实验结果表明，生理盐水无法长期保持抗体的稳定性。

本具体实施方式的实施例均为本申请的较佳实施例，并非依此限制本申请的保护范围，故：凡依本申请的结构、形状、原理所做的等效变化，均应涵盖于本申请的保护范围之内。