一种具有清除细胞内活性氧自由基作用的脂质纳米乳剂及其制备方法

技术领域

本发明属于食品营养与纳米材料技术领域，具体涉及一种具有清除细胞内活性氧自由基作用的脂质纳米乳剂及其制备方法。

背景技术

脂质是有机体赖以生存的重要营养元素之一，其为机体提供所需能量以外，与许多疾病的发生与发展密切相关，在维持有机体稳态、健康等方面发挥着关键作用。

海胆黄为海胆性腺，是一种深受美食饕客追捧的健康食材。其脂质约占总重的10～30%（干基），包含脂肪酸、甘油酯、磷脂、固醇脂、异戊烯醇酯、糖脂及脂溶性微量生物活性物质等，赋予了海胆黄鲜醇甜润的口感，并有益于维持机体健康稳态。然而由于富含共轭、非共轭不饱和键，在高温、高湿、光照、酶、金属、微生物等催化条件下，海胆黄脂质容易发生氧化、降解、异构等反应，导致品质恶化及生物活性物质的损失等。因此，海胆黄脂质的加工及其抗氧化活性的测定成为食品生产商和科研人员面临的难题之一。

目前油脂抗氧化活性评估主要以体外化学模型为主，通过测量油脂醇提物清除合成自由基或天然自由基的相对能力，包括清除DPPH（2,2-二苯基-1-苦味酸自由基）、ABTS（3-乙基苯并噻唑啉磺酸自由基）、FRAP（铁还原抗氧化能力）、TRAP（总自由基捕获抗氧化参数）等，进而与标准抗氧化化合物的抗氧化能力进行比较。

由于化学模型无法充分模拟人体复杂的反应体系（如温度、pH值、微生物等），近年来，基于人肝癌细胞HepG-2的细胞抗氧化活性（Cellular Antioxidant Activity，CAA）模型较传统化学模型更具有生物相关性，较动物模型等更经济、便捷，更好地反应了抗氧化剂在细胞中的摄取、吸收与代谢的情况，成为抗氧化活性评估的热门方法之一。

然而，化学模型或CAA模型的反应底物常为水溶性或醇溶性化学物质，而与活性氧自由基、疾病发生密切相关的醇不溶脂质及微量生物活性物质的抗氧化活性无法得到充分体现。因此，亟需一种较适当、全面的检测脂质氧化程度的模型，以更精准地反应脂质抗氧化活性。

目前国内外关于海胆黄的研究主要集中在单一化学物质，如海胆黄多糖、多肽的分离纯化、免疫活性及其产品（包括即食海胆、口服液、护肤品）等方面，如专利CN201510574046.9、CN201310248186.8、CN201010525618.1、CN200810011855，而关于海胆黄脂质、脂溶性微量生物活性物质、微流化纳米乳剂制备及其清除细胞内活性氧自由基功效的研究尚未有报道。

发明内容

本发明的目的在于提供一种具有清除细胞内活性氧自由基作用的脂质纳米乳剂及其制备方法，本发明要解决的技术问题包括：

基于微流化技术的纳米乳剂（d<200 nm）是脂质及脂溶性活性物质的良好运输载体。本发明以海胆黄脂质为原料，以天然食源蛋白为乳化剂，采用微流化高压均质技术获得一种海胆黄脂质纳米乳剂，建立了脂质纳米乳剂的细胞内抗氧化模型，运用荧光动力学法监测活性氧自由基链式反应的发生过程，更全面地获得了海胆黄脂质抗氧化活性成分在细胞内的生物利用率、吸收与代谢的情况。本发明采用超声、高速混合、高速撞击、强剪切速率和流体动力空化等高压均质方法，有效增强了海胆黄脂质及脂溶性活性物质的水分散系数、稳定性、感官特性及生物利用度。与油脂醇提物的传统化学模型或细胞内抗氧化模型相比，基于微流化纳米制剂技术的细胞内抗氧化模型，更精确地验证了海胆黄脂质及其纳米乳剂在体内清除活性氧自由基的功效与安全性。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种具有清除细胞内活性氧自由基作用的脂质纳米乳剂的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)乳化剂配制：将天然食源两性蛋白完全溶于去离子水中，加入pH 7.0， 80 mMPBS至终浓度为10 mM，获得1～5 %（w/v，g/mL）蛋白溶液，过滤除菌，4℃保存，一周内使用；

(2)海胆黄脂质乳剂制备：分别将脂质、乳化剂避光置于5～60℃水浴5～15 min，使用高速均质仪将1～10%（w/w）的海胆黄脂质与90～99% （w/w）的乳化剂以30000 rpm分散均质2～5 min，获得O/W型乳剂；

(3)海胆黄脂质纳米乳剂制备：在12000 psi的压力下通过高压微射纳米均质机，通过调节微射流的均质压力，进行3次循环，获得粒径均一的、d<200 nm的纳米乳剂。

所述天然食源两性蛋白包括牛血清白蛋白、乳清分离蛋白、小麦面筋蛋白、大豆蛋白、蛋清蛋白、谷蛋白、酪蛋白、明胶、肌球蛋白、肌动蛋白和肌动球蛋白中的一种或一种以上的混合物。

所述海胆黄脂质的制备方法包括以下步骤：

(1)海胆开壳，取出海胆黄，用1％食盐水漂洗后，沥干水分，真空冷冻干燥；

(2)超声辅助有机溶剂提取：将海胆黄粉与溶剂按料液比1:20～1:5 （w/v, g/mL）混合，避光、25℃、超声频率30～200 Hz、超声5～30 min，每5～10分钟调节水浴温度至25℃；

(3)室温混匀10～20 min，3000 rpm离心10 min，萃取液经膜过滤，避光、氮气流下30～60℃减压浓缩，获得海胆黄脂质。

所述海胆包括紫海胆、黄海胆、中间球海胆、光棘列球海胆、马粪海胆、虾夷马粪海胆等。

所述溶剂包括甲醇、乙醇、异丙醇、正丁醇、叔丁醇、乙酸乙酯、石油醚（30～60℃）、甲基叔丁基醚、二氯甲烷、正己烷中的一种或一种以上的混合物。

进一步地，利用上述制备方法制备脂质纳米乳剂。

进一步地，将利用上述制备方法获得的脂质纳米乳剂应用于清除细胞内活性氧自由基中。

本发明的优点在于：

（一）本发明涉及的脂质纳米乳剂及其细胞内抗氧化模型，与油脂醇提物的传统化学模型或细胞内抗氧化模型相比，更能精准验证油脂在体内清除活性氧自由基的功效和安全性。

（二）本发明涉及的海胆黄脂质纳米乳剂的制备方法绿色安全、操作简单、无需化学交联与构造。

（三）本发明涉及的海胆黄脂质纳米乳剂的纳米颗粒粒径可控，具有较好的理化稳定性、生物安全性和较显著的清除细胞内活性氧自由基的功效。

附图说明

图1 海胆黄脂质纳米乳剂中纳米颗粒粒径（A）、多分散性指数（B）、zeta电位（C）和粒度分布图（D）；

图2 基于CCK-8法测定的Quercetin（A）、EAC E.E.（B）、ETH E.E.（C）；EAC E.（D）、ETH E.（E）、EAC N.E.（F）、ETH N.E.（G）、FCH N.E.（H）、HEX N.E.（I）、SOS N.E.（J）和SOXN.E.（K）的体外细胞增殖-毒性活性；

图3 基于HepG2细胞抗氧化模型中不同浓度Quercetin（A）、EAC E.E.（C）、ETHE.E.（E）；EAC E.（G）与ETH E.（I）的时间-荧光曲线及不同浓度Quercetin（B）、EAC E.E.（D）、ETH E.E.（F）；EAC E.（H）与ETH E.（J）的剂量-CAA值曲线；

图4 基于HepG2细胞抗氧化模型中不同浓度EAC N.E.（A）、ETH N.E.（C）、FCH N.E.（E）、HEX N.E.（G）、SOS N.E.（I）、SOX N.E.（K）的时间-荧光曲线及不同浓度EAC N.E.（B）、ETH N.E.（D）、FCH N.E.（F）、HEX N.E.（H）、SOS N.E.（J）、SOX N.E.（L）的剂量-CAA值曲线；

图5基于HepG2细胞抗氧化模型中不同浓度Quercetin（A）、EAC E.E.（B）、ETH E.E.（C）、EAC E.（D）、 ETH E.（E）、EAC N.E.（F）、ETH N.E.（G）、FCH N.E.（H）、HEX N.E.（I）、SOSN.E.（J）与SOX N.E.（K）抑制过氧自由基诱导DCFH氧化还原的半数效应图；

图6 基于HepG2细胞抗氧化模型中海胆黄脂质醇提物、乳剂和纳米乳剂CAA值的比较。

具体实施方式

实施例1 海胆黄脂质纳米乳剂的制备方法

（一）海胆黄脂质的制备

1.预处理

海胆开壳，取出海胆黄，用1％食盐水漂洗后，沥干水分，真空冷冻干燥。

2.超声辅助有机溶剂提取

(1)采用乙酸乙酯体系（EAC）。料液比1:20（w/v, g/mL），避光、25℃、超声频率100Hz、超声30 min，每10分钟调节水浴温度至25℃。室温搅拌20分钟，离心，萃取液经膜过滤，避光、氮气流下35℃减压浓缩，烘干至恒重，得率为20.6%。

(2)采用乙醇体系（ETH）。料液比1:20（w/v, g/mL），避光、25℃、超声频率100 Hz、超声30 min，每10分钟调节水浴温度至25℃。室温搅拌20分钟，离心，萃取液经膜过滤，避光、氮气流下35℃减压浓缩，烘干至恒重，得率为27.6%。

(3)采用二氯甲烷/甲醇（2:1, v/v）体系（FCH）。料液比1:20（w/v, g/mL），避光、25℃、超声频率100 Hz、超声30 min，每10分钟调节水浴温度至25℃。离心，萃取液经膜过滤，加入0.2倍体积氯化钾溶液（0.88%, w/v，g/mL），室温、轨道涡旋20分钟，离心，移取下层溶剂，避光、氮气流下35℃减压浓缩，烘干至恒重，得率为28.9%。

(4)采用正己烷体系（HEX），料液比1:20（w/v, g/mL），避光、25℃、超声频率100Hz、超声30 min，每10分钟调节水浴温度至25℃。室温搅拌20分钟，离心，萃取液经膜过滤，避光、氮气流下30℃减压浓缩，烘干至恒重，得率为20.5%。

(5)采用甲基叔丁基醚/甲醇/去离子水（2.6:2.0:2.4, v/v/v）体系（SOS）。海胆黄粉与甲基叔丁基醚/甲醇（2.6:2.0，v/v）的料液比1:20（w/v, g/mL），避光、25℃、超声频率100 Hz、超声30 min，每10分钟调节水浴温度至25℃。离心，萃取液经膜过滤，加入0.52倍体积去离子水，室温、轨道涡旋20分钟，离心，移取上层溶剂，避光、氮气流下35℃减压浓缩，烘干至恒重，得率为23.5%。

(6)采用石油醚（30～60℃）体系（SOX），料液比1:20（w/v, g/mL），避光、25℃、超声频率100 Hz、超声30 min，每10分钟调节水浴温度至25℃。索氏提取，回流6h，萃取液经膜过滤，避光、氮气流下30℃减压浓缩，烘干至恒重，得率为21.0%。

（二）海胆黄脂质乳剂的制备

1.乳化剂配制：

(1)将牛血清白蛋白完全溶于去离子水中，加入80 mM PBS至终浓度为10 mM，获得1%（w/v，g/mL）蛋白溶液，过滤除菌，4℃保存，3天内使用，用于制备纳米乳剂产品。

(2)将牛血清白蛋白溶于含有1%抗菌-抗真菌剂（每毫升包含 10000 单位青霉素、10000 µg 链霉素和 25 µg 两性霉素 B，货号：15240112，Gibco™）的MEM-α基础培养基（货号：C12571500BT，Gibco™），室温，3000 rpm涡旋震荡5 min，设置电动滴定仪终点自动滴定程序，使用4 moL/L氢氧化钠自动滴定pH至7.0，获得1%（w/v，g/mL）蛋白溶液，过滤除菌，4℃保存，3天内使用，用于细胞培养实验。

2.脂质乳剂制备：

(1)分别将EAC体系与SOS体系提取的海胆黄脂质与乳化剂避光置于35℃水浴10min，使用高速均质仪将10%（w/w）的脂质与90%（w/w）的乳化剂以30000 rpm分散均质2 min，重复1次，获得O/W型乳剂。

(2)分别将ETH体系、FCH体系与HEX体系提取的海胆黄脂质与乳化剂避光置于45℃水浴10 min，使用高速均质仪将10%（w/w）的脂质与90%（w/w）的乳化剂以30000 rpm分散均质2 min，重复1次，获得O/W型乳剂。

(3)分别将SOX体系提取的海胆黄脂质与乳化剂避光置于50℃水浴10 min，使用高速均质仪将10%（w/w）的脂质与90%（w/w）的乳化剂以30000 rpm分散均质2 min，重复1次，获得O/W型乳剂。

（三）海胆黄脂质纳米乳剂制备

将上述海胆黄乳剂在12000 psi的压力下通过高压微射纳米均质机，通过调节微射流的均质压力，进行3次循环，获得粒径均一（d<200 nm）的脂质纳米乳剂。使用MalvernZETASIZER LAB激光粒度仪测定纳米颗粒的粒度及zeta电位，测的EAC.N.E.、ETH N.E.、FCHN.E.、HEX N.E.、SOS N.E.与SOX N.E.的粒径分别为154.7±0.8 nm、139.5±1.7 nm、155.5±3.1 nm、100.3±1.8 nm、179.9±1.0 nm和148.7±2.4 nm，多分散性指数（PI）分别为0.2±0.01、0.1±0.02、0.3±0.03、0.2±0.08、0.1±0.01、0.1±0.01，zeta电位（pH=7.4）分别为-35.1±0.8mV、-35.7±0.4 mV、-37.8±2.0 mV、-34.0±0.6 mV、-27.6±0.3mV和-30.5±0.5 mV。见附图1。

实施例2 海胆黄脂质醇提物的制备方法

选取乙醇作为萃取剂，其萃取液为油脂醇提物，具体步骤如下：

称取4.0 g不同溶剂体系制备的海胆黄脂质至玻璃离心管中，加入5 mL无水乙醇，室温、避光、涡旋震荡5 min，离心，移取上层醇提液至棕色玻璃样品瓶，重复萃取3次，合并上层醇提液，获得0.2 g/mL的海胆黄脂质醇提物。

实施例3 细胞增殖-毒性评价

采用人肝癌细胞株HepG-2对槲黄素、海胆黄脂质的醇提物、乳剂和纳米乳剂进行细胞增殖-毒性评价。采用槲黄素作为标准抗氧化化合物，使用二甲基亚砜溶解槲黄素。使用含1%抗菌-抗真菌剂的MEM-α基础培养基对槲黄素、海胆黄脂质醇提物、海胆黄脂质乳剂和海胆黄脂质纳米乳剂进行稀释。

使用含有终浓度10%胎牛血清、1%抗菌-抗真菌剂的MEM-α完全培养基、于37℃、5%CO

其中As：实验孔(含有细胞的培养基、CCK-8、待测物质)；Ab：空白孔(不含细胞和待测物质的培养基、CCK-8)；Ac：对照孔(含有细胞的培养基、CCK-8、没有待测物质)

基于CCK-8法测定槲黄素（Quercetin）、EAC体系海胆黄脂质醇提物(EAC E.E.)、ETH体系海胆黄脂质醇提物(ETH E.E.)、EAC体系海胆黄脂质乳剂（EAC E.）、ETH体系的海胆黄脂质乳剂（ETH E.）、EAC体系海胆黄脂质纳米乳剂（EAC N.E.）、ETH体系海胆黄脂质纳米乳剂（ETH N.E.）、FCH体系海胆黄脂质纳米乳剂（FCH N.E.）、HEX体系海胆黄脂质纳米乳剂（HEX N.E.）、SOS体系海胆黄脂质纳米乳剂（SOS N.E.）、SOX体系海胆黄脂质纳米乳剂（SOXN.E.）体外细胞增殖-毒性活性的试验结果表明，标准抗氧化化合物槲黄素在所测定浓度下对HepG-2细胞均无毒副作用；海胆黄脂质醇提物EAC E.E.在浓度≥6 mg/mL、ETH E.E.在浓度≥7.5 mg/mL时均对HepG-2细胞增殖活性具有较显著的抑制作用；海胆黄脂质乳剂EACE.、ETH E.在浓度≥35 mg/mL时对HepG-2细胞增殖活性具有较显著的抑制作用；而海胆黄脂质以纳米乳剂的形式（EAC N.E.、ETH N.E.、FCH N.E.、HEX N.E.、SOS N.E.和SOX N.E.）在所测定浓度(≤5 mg/mL)下对HepG-2细胞均无毒副作用，反而具有一定的促进细胞增殖的作用。见附图2。

实施例4 脂质细胞内抗氧化评价模型的构建

采用人肝癌细胞株HepG-2对海胆黄脂质的醇提物、乳剂和纳米乳剂进行细胞内抗氧化活性评价。使用5.13 mL甲醇溶解50 mg 2’,7’- 二氯荧光黄双乙酸盐（DCFH-DA）（货号：D6883，Sigma-Aldrich）制备 20 mM DCFH-DA储备液，并使用含1%抗菌-抗真菌剂的MEM-α基础培养基配制50 μM 的DCFH-DA工作液。采用槲黄素作为标准抗氧化化合物，使用二甲基亚砜溶解槲黄素。使用基础培养基倍比稀释槲黄素、海胆黄脂质的醇提物、乳剂和纳米乳剂。使用PBS溶解2,2-偶氮二(2-甲基丙基咪)二盐酸盐（AAPH）（货号：440914，Sigma-Aldrich），并使用Hank's平衡盐溶液（HBSS）配制600 µM的AAPH工作液。

使用含有10%胎牛血清、1%抗菌-抗真菌剂的MEM-α完全培养基、于37℃、5% CO

CAA unit = 100 - (∫SA/∫CA) × 100

其中∫SA为实验组时间-荧光值曲线下的积分面积；∫CA为对照组时间-荧光值曲线下的积分面积。

结果显示：与海胆黄脂质醇提物（EAC E.E.、ETH E.E.）、海胆黄脂质乳剂（EAC E.、ETH E.）相比，海胆黄脂质纳米乳剂（EAC N.E.、ETH N.E.、FCH N.E.、HEX N.E.、SOS N.E.和SOX N.E.）具有更显著的细胞内抗氧化活性（图3～6）。以EAC体系制备的海胆黄脂质为例（表1），EAC.E.E.和EAC E.半数抑制浓度EC

表1 基于HepG2细胞抗氧化模型中海胆黄脂质醇提物、乳剂和纳米乳剂的EC

以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。