制备烟酸或其衍生物的核苷、烟酸腺嘌呤二核苷酸、烟酸单核苷酸的方法、酶组合物及应用

技术领域

本发明属于生物医药领域，具体而言，涉及制备烟酸或其衍生物的核苷、烟酸腺嘌呤二核苷酸、烟酸单核苷酸的方法、酶组合物及应用。

背景技术

随着近年的科技发展，科学界在病理学、遗传学等学科取得了重大突破，对上世纪大众认为的“绝症”如癌症和爱滋病等开发出了各种治疗方案，从而有效地延长了病人的寿命，改善了其生活质量甚至达到完全康复。因此，大众对此类“绝症”改变了多年来的看法，不再将它们视为死亡的枷锁，重燃了病人和其家人对生命的希望。与此同时，科学界对生命科学有了更深层的了解，在细胞讯息传递和表征遗传学的领域上了解了人体衰老的原因。科学家认为人类衰老可以延缓，并且可以减低衰老对身体所带来的影响，其中更有部分科学家提出衰老只是人体的疾病而非必然自然现象的理论：衰老可以通过新研发的方案解决，正如有些当年所谓的“绝症”，现今已有治疗的对策和无数的成功案例。许多科学文献和多项研究皆提出烟酰胺腺嘌呤二核苷酸的水平是延缓衰老和改善身体机能的重要物质。烟酰胺腺嘌呤二核苷酸参与身体中多项新陈代谢和氧分子传递的生化作用，对维持细胞和器官的正常运作由其重要。然而，很多研究报告指出，在老鼠和人类中发现烟酰胺腺嘌呤二核苷酸的水平会随年龄的增长而下降，继而出现各类疾病。

随着烟酰胺腺嘌呤二核苷酸的应用研究日趋成熟，使用烟酰胺腺嘌呤二核苷酸补充剂近年得到了广泛的关注和认同。烟酰胺核苷为烟酰胺单核苷酸前体，早年在牛奶中被发现和提取，是用于提升体内烟酰胺腺嘌呤二核苷酸水平的初代物质。

目前，烟酰胺核苷的工业生产主要依赖纯化学工艺，以四乙酰核糖为最初始底物并使用乙腈、甲醇和三丁胺等有机溶剂进行化学合成。随着近年国内外对烟酰胺腺嘌呤二核苷酸的研究的增加，特别是在其基础功能研究上所取得的突破性进展，证实了维持烟酰胺腺嘌呤二核苷酸的体内水平对健康和抗衰老至关重要。大众因而对烟酰胺核苷的需求逐渐增长，但现时的生产工艺过分偏重于单一物料为原材料，特别是当四乙酰核糖无法正常供应时，势必影响烟酰胺核苷的生产量。无法维持烟酰胺核苷的正常供应和稳定的价格将对民众对烟酰胺腺嘌呤二核苷酸的需求造成一定影响。再者，生产烟酰胺核苷的工艺为化学工艺，生产过程中需要使用大量不同的有机溶剂，这将对环境带来严重影响。在可见的未来，随着对烟酰胺核苷需求的增加，提高产能的同时也将对生产地区造成与日具增的环保压力。

发明内容

为解决上述现有技术中所存在的问题，本发明开发了以全生物酶法生产烟酰胺核苷的方法，具体而言，提供了制备制备烟酸或其衍生物的核苷、烟酸腺嘌呤二核苷酸、烟酸单核苷酸的方法、酶组合物及应用。

具体而言，本发明提供了：

(1)一种制备烟酸或其衍生物的核苷的方法，包括使用5’-核苷酸酶以烟酸或其衍生物的单核苷酸或其盐为底物进行反应，其中所述5’-核苷酸酶的氨基酸序列如SEQ IDNO.1所示。

(2)根据(1)所述的方法，其中所述烟酸或其衍生物的核苷选自烟酰胺核苷和烟酸核苷中的至少一者；其中所述烟酰胺核苷包括氧化型α-烟酰胺核苷、氧化型β-烟酰胺核苷、还原型α-烟酰胺核苷和还原型β-烟酰胺核苷，所述烟酸核苷包括氧化型α-烟酸核苷、氧化型β-烟酸核苷、还原型α-烟酸核苷和还原型β-烟酸核苷。

(3)根据(1)所述的方法，其中所述烟酸或其衍生物的单核苷酸选自烟酰胺单核苷酸和烟酸单核苷酸中的至少一者；其中所述烟酰胺单核苷酸包括氧化型α-烟酰胺单核苷酸、氧化型β-烟酰胺单核苷酸、还原型α-烟酰胺单核苷酸和还原型β-烟酰胺单核苷酸，所述烟酸单核苷酸包括氧化型α-烟酸单核苷酸、氧化型β-烟酸单核苷酸、还原型α-烟酸单核苷酸和还原型β-烟酸单核苷酸。

(4)根据(1)所述的方法，其中所述方法还包括使用烟酰胺腺嘌呤二核苷酸二磷酸酶以烟酸或其衍生物的腺嘌呤二核苷酸或其盐为底物进行反应，其中所述烟酰胺腺嘌呤二核苷酸二磷酸酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

(5)根据(4)所述的方法，其中所述烟酸或其衍生物的腺嘌呤二核苷酸选自烟酰胺腺嘌呤二核苷酸和烟酸腺嘌呤二核苷酸中的至少一者；其中所述烟酰胺腺嘌呤二核苷酸包括氧化型α-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸、氧化型β-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸、还原型α-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸和还原型β-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸，所述烟酸腺嘌呤二核苷酸包括氧化型α-烟酸腺嘌呤二核苷酸、氧化型β-烟酸腺嘌呤二核苷酸、还原型α-烟酸腺嘌呤二核苷酸和还原型β-烟酸腺嘌呤二核苷酸。

(6)根据(4)所述的方法，其中所述方法还包括使用烟酰胺腺嘌呤二核苷酸激酶以烟酸或其衍生物的腺嘌呤二核苷酸磷酸或其盐为底物进行反应，其中所述烟酰胺腺嘌呤二核苷酸激酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。

(7)根据(6)所述的方法，其中所述烟酸或其衍生物的腺嘌呤二核苷酸磷酸选自烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸和烟酸腺嘌呤二核苷酸磷酸中的至少一者；其中所述烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸包括氧化型α-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸、氧化型β-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸、还原型α-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸和还原型β-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸，所述烟酸腺嘌呤二核苷酸磷酸包括氧化型α-烟酸腺嘌呤二核苷酸磷酸、氧化型β-烟酸腺嘌呤二核苷酸磷酸、还原型α-烟酸腺嘌呤二核苷酸磷和还原型β-烟酸腺嘌呤二核苷酸磷酸。

(8)根据(1)所述的方法，包括将烟酰胺腺嘌呤二核苷酸激酶、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸二磷酸酶和5’-核苷酸酶与烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸或其盐混合，使反应进行1.5-8小时，其中所述烟酰胺腺嘌呤二核苷酸激酶和烟酰胺腺嘌呤二核苷酸二磷酸酶的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.2所示。

(9)根据(1)所述的方法，包括将烟酰胺腺嘌呤二核苷酸二磷酸酶和5’-核苷酸酶与烟酰胺腺嘌呤二核苷酸或其盐混合，使反应进行1.5-8小时，其中所述烟酰胺腺嘌呤二核苷酸二磷酸酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

(10)根据(1)所述的方法，包括以下步骤：

1)将烟酰胺腺嘌呤二核苷酸激酶与烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸或其盐混合，使其反应产生烟酰胺腺嘌呤二核苷酸或其盐；

2)当所述烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸或其盐的量下降至步骤1)所述的反应初始时的20-100％以下时，将所述烟酰胺腺嘌呤二核苷酸或其盐与烟酰胺腺嘌呤二核苷酸二磷酸酶混合，使其反应产生烟酰胺单核苷酸或其盐；

3)当所述烟酰胺腺嘌呤二核苷酸或其盐的量下降至步骤2)所述的反应初始时的10-100％以下时，将所述烟酰胺单核苷酸或其盐与5’-核苷酸酶混合，使其反应产生烟酰胺核苷；

其中所述烟酰胺腺嘌呤二核苷酸激酶和烟酰胺腺嘌呤二核苷酸二磷酸酶的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.2所示。

(11)根据(1)所述的方法，包括以下步骤：

I)将烟酰胺腺嘌呤二核苷酸或其盐与烟酰胺腺嘌呤二核苷酸二磷酸酶混合，使其反应产生烟酰胺单核苷酸或其盐；

II)当所述烟酰胺腺嘌呤二核苷酸或其盐的量下降至步骤I)所述的反应初始时的10-100％以下时，将所述烟酰胺单核苷酸或其盐与5’-核苷酸酶混合，使其反应产生烟酰胺核苷；

其中所述烟酰胺腺嘌呤二核苷酸二磷酸酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

(12)根据(3)、(10)、(11)中任一项所述的方法，其中所述5’-核苷酸酶和所述烟酰胺单核苷酸或其盐的重量比为(0.01-10):1。

(13)根据(5)、(10)、(11)中任一项所述的方法，其中所述烟酰胺腺嘌呤二核苷酸二磷酸酶和所述烟酰胺腺嘌呤二核苷酸或其盐的重量比为(0.01-10):1。

(14)根据(7)或(10)所述的方法，其中所述烟酰胺腺嘌呤二核苷酸激酶和所述烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸或其盐的重量比为(0.01-10):1。

(15)烟酰胺腺嘌呤二核苷酸激酶、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸二磷酸酶和/或5’-核苷酸酶在制备烟酸或其衍生物的核苷中的应用，其中所述烟酰胺腺嘌呤二核苷酸激酶、所述烟酰胺腺嘌呤二核苷酸二磷酸酶和所述5’-核苷酸酶的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.1所示。

(16)根据(15)所述的应用，其中所述烟酸或其衍生物的核苷选自烟酰胺核苷和烟酸核苷中的至少一者；其中所述烟酰胺核苷包括氧化型α-烟酰胺核苷、氧化型β-烟酰胺核苷、还原型α-烟酰胺核苷和还原型β-烟酰胺核苷，所述烟酸核苷包括氧化型α-烟酸核苷、氧化型β-烟酸核苷、还原型α-烟酸核苷和还原型β-烟酸核苷。

(17)一种酶的组合物，包含：

烟酰胺腺嘌呤二核苷酸激酶、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸二磷酸酶和5’-核苷酸酶，其中所述三种酶的摩尔比为(0.01-2):(0.01-2):(0.01-1)；或者

烟酰胺腺嘌呤二核苷酸二磷酸酶和5’-核苷酸酶，其中所述两种酶的摩尔比为(0.01-9):(0.01-9)；并且

其中所述烟酰胺腺嘌呤二核苷酸激酶、所述烟酰胺腺嘌呤二核苷酸二磷酸酶和所述5’-核苷酸酶的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.1所示。

(18)根据(17)所述的酶的组合物在制备烟酸或其衍生物的核苷中的应用。

(19)根据(18)所述的应用，其中所述烟酸或其衍生物的核苷选自烟酰胺核苷和烟酸核苷中的至少一者；其中所述烟酰胺核苷包括氧化型α-烟酰胺核苷、氧化型β-烟酰胺核苷、还原型α-烟酰胺核苷和还原型β-烟酰胺核苷，所述烟酸核苷包括氧化型α-烟酸核苷、氧化型β-烟酸核苷、还原型α-烟酸核苷和还原型β-烟酸核苷。

(20)根据(1)所述的方法，包括将烟酰胺腺嘌呤二核苷酸激酶、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸二磷酸酶和5’-核苷酸酶与烟酸腺嘌呤二核苷酸磷酸或其盐混合，使反应进行1.5-8小时，其中所述烟酰胺腺嘌呤二核苷酸激酶和烟酰胺腺嘌呤二核苷酸二磷酸酶的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.2所示。

(21)根据(1)所述的方法，包括将烟酰胺腺嘌呤二核苷酸二磷酸酶和5’-核苷酸酶与烟酸腺嘌呤二核苷酸或其盐混合，使反应进行1.5-8小时，其中所述烟酰胺腺嘌呤二核苷酸二磷酸酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

(22)根据(1)所述的方法，包括以下步骤：

1)将烟酰胺腺嘌呤二核苷酸激酶与烟酸腺嘌呤二核苷酸磷酸或其盐混合，使其反应产生烟酸腺嘌呤二核苷酸或其盐；

2)当所述烟酸腺嘌呤二核苷酸磷酸或其盐的量下降至步骤1)所述的反应初始时的30-100％以下时，将所述烟酸腺嘌呤二核苷酸或其盐与烟酰胺腺嘌呤二核苷酸二磷酸酶混合，使其反应产生烟酸单核苷酸或其盐；

3)当所述烟酸腺嘌呤二核苷酸或其盐的量下降至步骤2)所述的反应初始时的20-100％以下时，将所述烟酸单核苷酸或其盐与5’-核苷酸酶混合，使其反应产生烟酸核苷；

其中所述烟酰胺腺嘌呤二核苷酸激酶和烟酰胺腺嘌呤二核苷酸二磷酸酶的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.2所示。

(23)根据(1)所述的方法，包括以下步骤：

I)将烟酸腺嘌呤二核苷酸或其盐与烟酰胺腺嘌呤二核苷酸二磷酸酶混合，使其反应产生烟酸单核苷酸或其盐；

II)当所述烟酸腺嘌呤二核苷酸或其盐的量下降至步骤I)所述的反应初始时的20-100％以下时，将所述烟酸单核苷酸或其盐与5’-核苷酸酶混合，使其反应产生烟酸核苷；

其中所述烟酰胺腺嘌呤二核苷酸二磷酸酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

(24)根据(3)、(22)、(23)中任一项所述的方法，其中所述5’-核苷酸酶和所述烟酸单核苷酸或其盐的重量比为(0.01-10):1。

(25)根据(5)、(22)、(23)中任一项所述的方法，其中所述烟酰胺腺嘌呤二核苷酸二磷酸酶和所述烟酸腺嘌呤二核苷酸或其盐的重量比为(0.01-10):1。

(26)根据(7)、(22)、(23)中任一项所述的方法，其中所述烟酰胺腺嘌呤二核苷酸激酶和所述烟酸腺嘌呤二核苷酸磷酸或其盐的重量比为(0.01-10):1。

(27)一种用酶法制备烟酸腺嘌呤二核苷酸的方法，包括使用烟酰胺腺嘌呤二核苷酸激酶以烟酸腺嘌呤二核苷酸磷酸或其盐为底物进行反应，其中所述烟酰胺腺嘌呤二核苷酸激酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示；其中所述烟酸腺嘌呤二核苷酸包括氧化型α-烟酸腺嘌呤二核苷酸、氧化型β-烟酸腺嘌呤二核苷酸、还原型α-烟酸腺嘌呤二核苷酸和还原型β-烟酸腺嘌呤二核苷酸，所述烟酸腺嘌呤二核苷酸磷酸包括氧化型α-烟酸腺嘌呤二核苷酸磷酸、氧化型β-烟酸腺嘌呤二核苷酸磷酸、还原型α-烟酸腺嘌呤二核苷酸磷和还原型β-烟酸腺嘌呤二核苷酸磷酸。

(28)根据(27)所述的方法，其中所述烟酰胺腺嘌呤二核苷酸激酶和所述烟酸腺嘌呤二核苷酸磷酸或其盐的重量比为(0.01-10):1。

(29)一种用酶法制备烟酸单核苷酸的方法，包括使用烟酰胺腺嘌呤二核苷酸二磷酸酶以烟酸腺嘌呤二核苷酸或其盐为底物进行反应，其中所述烟酰胺腺嘌呤二核苷酸二磷酸酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示；其中所述烟酸单核苷酸包括氧化型α-烟酸单核苷酸、氧化型β-烟酸单核苷酸、还原型α-烟酸单核苷酸和还原型β-烟酸单核苷酸，所述烟酸腺嘌呤二核苷酸包括氧化型α-烟酸腺嘌呤二核苷酸、氧化型β-烟酸腺嘌呤二核苷酸、还原型α-烟酸腺嘌呤二核苷酸和还原型β-烟酸腺嘌呤二核苷酸。

(30)根据(29)所述的方法，其中所述方法还包括使用烟酰胺腺嘌呤二核苷酸激酶以烟酸腺嘌呤二核苷酸磷酸或其盐为底物进行反应，其中所述烟酰胺腺嘌呤二核苷酸激酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示；其中所述烟酸腺嘌呤二核苷酸磷酸包括氧化型α-烟酸腺嘌呤二核苷酸磷酸、氧化型β-烟酸腺嘌呤二核苷酸磷酸、还原型α-烟酸腺嘌呤二核苷酸磷和还原型β-烟酸腺嘌呤二核苷酸磷酸。

(31)根据(29)所述的方法，包括将烟酰胺腺嘌呤二核苷酸激酶和烟酰胺腺嘌呤二核苷酸二磷酸酶与烟酸腺嘌呤二核苷酸磷酸或其盐混合，使反应进行1.5-8小时，其中所述烟酰胺腺嘌呤二核苷酸激酶和烟酰胺腺嘌呤二核苷酸二磷酸酶的氨基酸序列分别如SEQID NO.3和SEQ ID NO.2所示。

(32)根据(29)所述的方法，包括以下步骤：

1)将烟酰胺腺嘌呤二核苷酸激酶与烟酸腺嘌呤二核苷酸磷酸或其盐混合，使其反应产生烟酸腺嘌呤二核苷酸或其盐；

2)当所述烟酸腺嘌呤二核苷酸磷酸或其盐的量下降至步骤1)所述的反应初始时的30-100％以下时，将所述烟酸腺嘌呤二核苷酸或其盐与烟酰胺腺嘌呤二核苷酸二磷酸酶混合，使其反应产生烟酸单核苷酸；

其中所述烟酰胺腺嘌呤二核苷酸激酶和烟酰胺腺嘌呤二核苷酸二磷酸酶的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.2所示。

(33)根据(29)所述的方法，其中所述烟酰胺腺嘌呤二核苷酸二磷酸酶和所述烟酸腺嘌呤二核苷酸或其盐的重量比为(0.01-10):1。

(34)根据(30)所述的方法，其中所述烟酰胺腺嘌呤二核苷酸激酶和所述烟酸腺嘌呤二核苷酸磷酸或其盐的重量比为(0.01-10):1。

(35)根据(1)-(34)中任一项所述的方法，其中所述各反应在25-40℃、pH5-10下进行。

(36)根据(1)-(34)中任一项所述的方法，其中所述各反应在0.01ppm-100000ppm的一种或多种离子的存在下进行。

(37)根据(36)所述的方法，其中所述离子包括金属离子、氯离子、碳酸根离子、亚硫酸根离子和磷离子。

(38)根据(1)-(34)中任一项所述的方法，其中所述烟酰胺腺嘌呤二核苷酸激酶、所述烟酰胺腺嘌呤二核苷酸二磷酸酶和所述5’-核苷酸酶是利用生物工程法并通过微生物发酵得到的。

(39)根据(1)-(34)中任一项所述的方法，其中所述烟酰胺腺嘌呤二核苷酸激酶、所述烟酰胺腺嘌呤二核苷酸二磷酸酶和所述5’-核苷酸酶以固定化酶/细胞的形式提供。

(40)烟酰胺腺嘌呤二核苷酸激酶和/或烟酰胺腺嘌呤二核苷酸二磷酸酶在制备烟酸腺嘌呤二核苷酸和烟酸单核苷酸中的应用，其中所述烟酰胺腺嘌呤二核苷酸激酶、所述烟酰胺腺嘌呤二核苷酸二磷酸酶和所述5’-核苷酸酶的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.1所示；其中所述烟酸单核苷酸包括氧化型α-烟酸单核苷酸、氧化型β-烟酸单核苷酸、还原型α-烟酸单核苷酸和还原型β-烟酸单核苷酸，所述烟酸腺嘌呤二核苷酸包括氧化型α-烟酸腺嘌呤二核苷酸、氧化型β-烟酸腺嘌呤二核苷酸、还原型α-烟酸腺嘌呤二核苷酸和还原型β-烟酸腺嘌呤二核苷酸。

(41)根据(17)所述的酶的组合物在制备烟酸腺嘌呤二核苷酸和烟酸单核苷酸中的应用；其中所述烟酸单核苷酸包括氧化型α-烟酸单核苷酸、氧化型β-烟酸单核苷酸、还原型α-烟酸单核苷酸和还原型β-烟酸单核苷酸，所述烟酸腺嘌呤二核苷酸包括氧化型α-烟酸腺嘌呤二核苷酸、氧化型β-烟酸腺嘌呤二核苷酸、还原型α-烟酸腺嘌呤二核苷酸和还原型β-烟酸腺嘌呤二核苷酸。

本发明与现有技术相比具有以下优点和积极效果：

本发明首次提出利用纯生物酶法生产烟酸或其衍生物的核苷(包括烟酰胺核苷和烟酸核苷)。在所述酶和底物的反应过程中，只需要使用常见的离子和易于控制的物理环境便能有效进行反应，比化学合成的方法更安全和可靠。由于可以避免使用有机溶剂，因此更加环保。

本发明的方法可利用不同的物质(烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸或其盐、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸或其盐和烟酰胺单核苷酸或其盐)作为起始反应底物而非单一的物质，而且在制备方法和条件上不需因底物的改变而作出重大的改变。这样的设计不但能提高生产上的灵活性，也可避免因原料的供应波动而影响生产能力和成本。上述优点能促进更有效地生产烟酰胺核苷，以应付日益增长的需求。

本发明的方法除了可制备烟酸或其衍生物的核苷(包括烟酰胺核苷和烟酸核苷)以外，还可利用所述酶或所述酶的组合以不同的底物制备烟酸腺嘌呤二核苷酸和烟酸单核苷酸。这些物质均参与体内的新陈代谢和蛋白调控，对科研特别是表征遗传学的研究十分重要。

本发明所提出的制备方法以生物酶法为主要工艺，代替以化学合成法生产烟酰胺核苷，在该领域的生产工艺上带来新的方向，亦为工业生产上所遇见的问题带来解决方案，更同时兼备了节能、环保和可持续性发展的优势。

具体实施方式

以下通过具体实施方式的描述对本发明作进一步说明，但这并非是对本发明的限制，本领域技术人员根据本发明的基本思想，可以做出各种修改或改进，但是只要不脱离本发明的基本思想，均在本发明的范围之内。

本发明所述术语“烟酰胺腺嘌呤二核苷酸”包括氧化型β-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸，即NAD

本发明所述术语“烟酰胺核苷”包括氧化型α-烟酰胺核苷、氧化型β-烟酰胺核苷、还原型α-烟酰胺核苷和还原型β-烟酰胺核苷；所述术语“烟酸核苷”包括氧化型α-烟酸核苷、氧化型β-烟酸核苷、还原型α-烟酸核苷和还原型β-烟酸核苷。

本发明所述术语“烟酰胺单核苷酸”包括氧化型α-烟酰胺单核苷酸、氧化型β-烟酰胺单核苷酸、还原型α-烟酰胺单核苷酸和还原型β-烟酰胺单核苷酸；所述术语“烟酸单核苷酸”氧化型α-烟酸单核苷酸、氧化型β-烟酸单核苷酸、还原型α-烟酸单核苷酸和还原型β-烟酸单核苷酸。

本发明所述术语“烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸”包括氧化型α-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸、氧化型β-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸、还原型α-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸和还原型β-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸；所述术语“烟酸腺嘌呤二核苷酸磷酸”包括氧化型α-烟酸腺嘌呤二核苷酸磷酸、氧化型β-烟酸腺嘌呤二核苷酸磷酸、还原型α-烟酸腺嘌呤二核苷酸磷和还原型β-烟酸腺嘌呤二核苷酸磷酸。

本发明的发明人认识到维持体内烟酰胺腺嘌呤二核苷酸的水平具有重要性，而使用补充烟酰胺腺嘌呤二核苷酸的口服剂则是最简便的方法，在可预见的将来，口服烟酰胺腺嘌呤二核苷酸补充剂之一烟酰胺核苷的需求将会增加。因此，本发明的发明人对其生产工艺进行了深入研究，并且发现，目前烟酰胺核苷的生产主要使用化学法，这会对环境造成一定影响，而且只依赖单一原材料四乙酰核糖的供应，在进一步大规模生产时将遇到不稳定因素。为解决上述问题，本发明提出了一种新的制备烟酰胺核苷的方法，该方法使用生物酶法生产烟酰胺核苷，并且所使用的酶和酶的组合还可以用于生产其他重要产物。

一、制备烟酰胺核苷

具体而言，本发明提供了一种用酶法制备烟酰胺核苷的方法，包括使用5’-核苷酸酶以烟酰胺单核苷酸或其盐为底物进行反应，其中所述5’-核苷酸酶的氨基酸序列如SEQID NO.1所示。

5’-核苷酸酶与烟酰胺单核苷酸反应生成烟酰胺核苷和无机磷酸盐。当烟酰胺单核苷酸为氧化型时，生成的烟酰胺核苷也为氧化型；当烟酰胺单核苷酸为还原型时，生成的烟酰胺核苷也为还原型。以氧化型β-烟酰胺单核苷酸为例，上述反应所涉及的化学反应结构式如下：

所述5’-核苷酸酶和所述烟酰胺单核苷酸或其盐的重量比优选为(0.01-10):1。

上述方法还可以包括使用烟酰胺腺嘌呤二核苷酸二磷酸酶以烟酰胺腺嘌呤二核苷酸或其盐为底物进行反应，其中所述烟酰胺腺嘌呤二核苷酸二磷酸酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

烟酰胺腺嘌呤二核苷酸二磷酸酶与烟酰胺腺嘌呤二核苷酸或其盐反应生成烟酰胺单核苷酸和AMP。当烟酰胺腺嘌呤二核苷酸为氧化型时，生成的烟酰胺单核苷酸也为氧化型，当烟酰胺腺嘌呤二核苷酸为还原型时，生成的烟酰胺单核苷酸也为还原型。以氧化型β-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸为例，反应所涉及的化学反应结构式如下：

所述烟酰胺腺嘌呤二核苷酸二磷酸酶和所述烟酰胺腺嘌呤二核苷酸或其盐的重量比优选为(0.01-10):1。

该烟酰胺单核苷酸可以供应上文所述5’-核苷酸酶的反应。

所述方法还可以包括使用烟酰胺腺嘌呤二核苷酸激酶以烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸或其盐为底物进行反应，其中所述烟酰胺腺嘌呤二核苷酸激酶的氨基酸序列如SEQ IDNO.3所示。

烟酰胺腺嘌呤二核苷酸激酶与烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸或其盐反应生成烟酰胺腺嘌呤二核苷酸和磷酸盐。当烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸为氧化型时，生成的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸为氧化型，反之为还原型。以氧化型β-型为例，反应所涉及的化学反应结构式如下：

所述烟酰胺腺嘌呤二核苷酸激酶和所述烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸或其盐的重量比优选为(0.01-10):1。

该烟酰胺腺嘌呤二核苷酸可以供应上文所述烟酰胺腺嘌呤二核苷酸二磷酸酶的反应。

本发明的方法所涉及的底物烟酰胺单核苷酸或其盐、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸或其盐和烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸或其盐还可以商购获得，也可以利用已知的生产方法自行生产得到。所述盐可以为钠盐、二钠盐、锂盐、单磷酸盐、二磷酸盐、硫酸盐、碳酸盐、醋酸盐、硼酸盐等。

本发明可以只利用5’-核苷酸酶以烟酰胺单核苷酸或其盐为底物生产烟酰胺核苷。出于某些特定的原因，例如出于成本考虑或者烟酰胺单核苷酸或其盐供应不足时，可以先利用烟酰胺腺嘌呤二核苷酸二磷酸酶以烟酰胺腺嘌呤二核苷酸或其盐为底物生产烟酰胺单核苷酸，然后再进行所述5’-核苷酸酶的反应。进一步地，出于某些特定的原因，例如出于成本考虑或者烟酰胺腺嘌呤二核苷酸或其盐供应不足时，可以先利用烟酰胺腺嘌呤二核苷酸激酶以烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸或其盐为底物生产烟酰胺腺嘌呤二核苷酸，然后再进行所述烟酰胺腺嘌呤二核苷酸二磷酸酶的反应。

在只利用5’-核苷酸酶以烟酰胺单核苷酸或其盐底物生产烟酰胺核苷的情况中，可以将5’-核苷酸酶和烟酰胺单核苷酸或其盐混合，通过HPLC在特定的时间点检测反应体系中烟酰胺单核苷酸和烟酰胺核苷的量，当烟酰胺单核苷酸的含量已耗用超过10-100％而烟酰胺核苷的含量有着相对的提升时，可以使反应结束。

在利用上述两种酶或三种酶联合制备烟酰胺核苷的情况中，可以单独以分开的步骤分别加入所需的酶，以进行所述酶反应；也可以将所需的酶同时混合加入以进行所述酶反应。

在利用三种酶的一些实施方案中，所述方法包括将烟酰胺腺嘌呤二核苷酸激酶、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸二磷酸酶和5’-核苷酸酶与烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸或其盐混合，使反应进行1.5-8小时。

在上述实施方案中，优选地，基于反应体系的初始总体积，烟酰胺腺嘌呤二核苷酸激酶的量为0.01-20％(w/v)，烟酰胺腺嘌呤二核苷酸二磷酸酶的量为0.01-20％(w/v)，5’-核苷酸酶的量为0.01-20％(w/v)，烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸或其盐的量为0.01-10％(w/v)。

术语“反应体系的初始总体积”是指加入所有所需的反应物时，反应体系的总体积。随着反应的进行，反应体系的体积有可能发生变化，因此，上述反应物的量是基于加入所有所需的反应物时的初始反应体系的体积而言的。

在上述实施方案中，首先烟酰胺腺嘌呤二核苷酸激酶与烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸或其盐反应，随着烟酰胺腺嘌呤二核苷酸或其盐的生成，烟酰胺腺嘌呤二核苷酸二磷酸酶催化烟酰胺腺嘌呤二核苷酸或其盐转化成烟酰胺单核苷酸或其盐，进而烟酰胺单核苷酸或其盐被5’-核苷酸酶转化成烟酰胺核苷。

当反应时间低于1.5小时时，反应不充分，不能获得足够的烟酰胺核苷；当反应时间大于8小时，反应液在不添加抗生素或其他抑菌性的化学品的情况下会出现微生物污染的状况，液体会开始较为粘稠并发出异味难于处理，反应液中的底物和产物的含量也会同时下降，而不能预视的副产物随时间的延长而有所增加，最终将导致反应不能继续进行并报废。

在利用两种酶的一些实施方案中，所述方法包括将烟酰胺腺嘌呤二核苷酸二磷酸酶和5’-核苷酸酶与烟酰胺腺嘌呤二核苷酸或其盐混合，使反应进行1.5-8小时。

在上述实施方案中，优选地，基于反应体系的初始总体积，烟酰胺腺嘌呤二核苷酸二磷酸酶的量为0.01-10％(w/v)，5’-核苷酸酶的量为0.01-10％(w/v)，烟酰胺腺嘌呤二核苷酸或其盐的量为0.01-10％(w/v)。

在上述实施方案中，首先烟酰胺腺嘌呤二核苷酸二磷酸酶催化烟酰胺腺嘌呤二核苷酸或其盐转化成烟酰胺单核苷酸或其盐，随着烟酰胺单核苷酸或其盐的生成，5’-核苷酸酶将烟酰胺单核苷酸或其盐转化成烟酰胺核苷。

当上述反应的时间低于1.5小时时，反应不充分，不能获得足够的烟酰胺核苷；当反应时间大于8小时时，反应液在不添加抗生素或其他抑菌性的化学品的情况下会出现微生物污染的状况，液体会开始较为粘稠并发出异味难于处理，反应液中的底物和产物的含量也会同时下降，而不能预视的副产物随时间的延长而有所增加，最终将导致反应不能继续进行并报废。

在另一些实施方案中，所述方法包括以下步骤：

1)将烟酰胺腺嘌呤二核苷酸激酶与烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸或其盐混合，使其反应产生烟酰胺腺嘌呤二核苷酸或其盐；

2)当所述烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸或其盐的量下降至步骤1)所述的反应初始时的20-100％以下时，将所述烟酰胺腺嘌呤二核苷酸或其盐与烟酰胺腺嘌呤二核苷酸二磷酸酶混合，使其反应产生烟酰胺单核苷酸或其盐；

3)当所述烟酰胺腺嘌呤二核苷酸或其盐的量下降至步骤2)所述的反应初始时的10-100％以下时，将所述烟酰胺单核苷酸或其盐与5’-核苷酸酶混合，使其反应产生烟酰胺核苷。

在上述实施方案中，优选地，基于步骤1)反应体系的初始总体积，烟酰胺腺嘌呤二核苷酸激酶的量为0.01-10％(w/v)，烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸或其盐的量为0.01-10％(w/v)；基于步骤2)反应体系的初始总体积，烟酰胺腺嘌呤二核苷酸二磷酸酶的量为0.1-10％(w/v)；基于步骤3)反应体系的初始总体积，5’-核苷酸酶的量为0.1-10％(w/v)。

可以通过HPLC来监测各步产物的量，以在合适的时间点进行下一步反应。

在另一些实施方案中，所述方法包括以下步骤：

I)将烟酰胺腺嘌呤二核苷酸或其盐与烟酰胺腺嘌呤二核苷酸二磷酸酶混合，使其反应产生烟酰胺单核苷酸或其盐；

II)当所述烟酰胺腺嘌呤二核苷酸或其盐的量下降至步骤I)所述的反应初始时的10-100％以下时，将所述烟酰胺单核苷酸或其盐与5’-核苷酸酶混合，使其反应产生烟酰胺核苷。

在上述实施方案中，优选地，基于步骤I)反应体系的初始总体积，烟酰胺腺嘌呤二核苷酸二磷酸酶的量为0.1-10％(w/v)，烟酰胺腺嘌呤二核苷酸或其盐的量为0.1-10％(w/v)；基于步骤II)反应体系的初始总体积，5’-核苷酸酶的量为0.1-10％(w/v)。

可以通过HPLC来监测各步产物的量，以在合适的时间点进行下一步反应。

本发明所涉及的上述各反应均可以在25-40℃、pH5-10下进行。其中优选的反应温度为30-40℃，更优选为32-40℃。其中优选的pH为pH6-9，更优选为pH6.5-8.5。

优选地，上述反应需要离子的辅助。所述各反应优选在0.01ppm-100000ppm的一种或多种离子的存在下进行。离子优选包括各种金属离子、氯离子、镁离子、钙离子、钾离子、钠离子、锌离子、氟离子、硫离子、碳酸根离子、亚硫酸根离子、各种含磷离子。优选包括钠离子、镁离子、钾离子、碳酸根离子、亚硫酸根离子和各种含磷离子。

本发明的方法可利用不同的物质(烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸或其盐、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸或其盐和烟酰胺单核苷酸或其盐)作为起始反应底物而非单一的物质，而且在制备方法和条件上不需因底物的改变而作出重大的改变。这样的设计不但能提高生产上的灵活性，也可避免因原料的供应波动而影响生产能力和成本。上述优点能促进更有效地生产烟酰胺核苷，以应付日益增长的需求。

优选地，所述5’-核苷酸酶、所述烟酰胺腺嘌呤二核苷酸二磷酸酶、和所述烟酰胺腺嘌呤二核苷酸激酶是利用生物工程法并通过微生物发酵得到的。

5’-核苷酸酶的基因可以来自霍乱弧菌(Vibrio cholerae)(EC 3.1.3.5)；烟酰胺腺嘌呤二核苷酸二磷酸酶的基因可以来自酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)(EC3.6.1.22)；烟酰胺腺嘌呤二核苷酸激酶的基因可以来自艰难梭菌(Clostridioidesdifficile)(EC 2.7.1.23)。

所述三种酶可以分别用表达载体单独表达重组酶，也可以构建到同一个载体中表达三种酶的重组酶。表达载体可以是分子生物学领域中所常用的表达载体，宿主细胞也可以是分子生物学领域中所常用的菌种，如大肠杆菌、酵母菌等。

生物酶法反应可以使用表达重组酶的细胞、细胞破碎液、上清液或纯化酶液进行；也可以将上述重组酶以单独或混合的方式，以任何形式的固定方法和载体制成固定化酶/细胞制品来进行酶反应。

在一些实施方案中，所述烟酰胺腺嘌呤二核苷酸激酶、所述烟酰胺腺嘌呤二核苷酸二磷酸酶和所述5’-核苷酸酶以固定化酶/细胞的形式提供。

在一些具体的实施方案中，本发明的方法使用重组酶技术，以大肠杆菌为宿主分别表达烟酰胺腺嘌呤二核苷酸激酶、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸二磷酸酶和5’-核苷酸酶，提取得上清酶液，将一部分上清酶液制备固定化酶。然后，在反应罐中进行100ml的反应溶液配置，加入1.21g三羟甲基氨基甲烷作为缓冲液(缓冲液亦可以使用任何类型的磷酸盐、碳酸盐、磞酸盐和氨基酸)，78.7mg氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸二钠盐和406mg六水氯化镁，加入80ml纯水后以0.1M盐酸/氢氧化钠调节pH至7.8-8.0。反应溶液维持在37℃，pH 8.0下搅拌，加入烟酰胺腺嘌呤二核苷酸激酶、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸二磷酸酶和5’-核苷酸酶的上清酶液各10ml，以高效液相色谱检测反应液中氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸二钠盐、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸、β-烟酰胺单核苷酸和烟酰胺核苷的浓度，反应2小时后氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸二钠盐的浓度在反应溶液中下降至0.3mM，而烟酰胺核苷的浓度在反应溶液中有所提升，两小时后的浓度达0.6mM，酶反应可以结束。

在另一些具体的实施方案中，以烟酰胺腺嘌呤二核苷酸为反应底物，反应溶液的配置为1.21g三羟甲基氨基甲烷，66.3mg烟酰胺腺嘌呤二核苷酸和406mg六水氯化镁，加入80ml纯水后，以0.1M盐酸/氢氧化钠调节pH至7.8-8.0；反应溶液维持在37℃和pH 8.0下搅拌，加入烟酰胺腺嘌呤二核苷酸二磷酸酶和5’-核苷酸酶各10ml，以高效液相色谱检测反应液中烟酰胺腺嘌呤二核苷酸、β-烟酰胺单核苷酸和烟酰胺核苷的浓度变化，反应2小时后烟酰胺腺嘌呤二核苷酸的浓度在反应溶液中下降至0.24mM，而烟酰胺核苷的浓度在反应溶液中提升，两小时后的浓度达0.57mM，酶反应可以结束。

在另一些具体的实施方案中，以β-烟酰胺单核苷酸为反应的原材料，反应溶液的配置例如为1.21g三羟甲基氨基甲烷，33.4mgβ-烟酰胺单核苷酸和406mg六水氯化镁，加入80ml纯水后以0.1M盐酸/氢氧化钠调节pH至7.8-8.0；反应溶液维持在37℃和pH 8.0下搅拌，加入10ml 5’-核苷酸酶，以高效液相色谱分析反应液中β-烟酰胺单核苷酸和烟酰胺核苷的浓度变化，反应2小时后β-烟酰胺单核苷酸的浓度在反应溶液中下降至0.07mM，而烟酰胺核苷在反应溶液中的浓度两小时后达0.91mM，酶反应可以结束。

在本发明的方法中，同时混合加酶的方式相比分步加酶的方式有同样甚至更高的转化率。

本发明还提供了烟酰胺腺嘌呤二核苷酸激酶、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸二磷酸酶和/或5’-核苷酸酶在制备烟酰胺核苷中的应用，其中所述烟酰胺腺嘌呤二核苷酸激酶、所述烟酰胺腺嘌呤二核苷酸二磷酸酶和所述5’-核苷酸酶的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.1所示。

本发明还提供了一种酶的组合物，包含：

烟酰胺腺嘌呤二核苷酸激酶、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸二磷酸酶和5’-核苷酸酶，其中所述三种酶的摩尔比为(0.01-2):(0.01-2):(0.01-1)；或者

烟酰胺腺嘌呤二核苷酸二磷酸酶和5’-核苷酸酶，其中所述两种酶的摩尔比为(0.01-9):(0.01-9)；并且

其中所述烟酰胺腺嘌呤二核苷酸激酶、所述烟酰胺腺嘌呤二核苷酸二磷酸酶和所述5’-核苷酸酶的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.1所示。

本发明还提供了所述的酶的组合物在制备烟酰胺核苷中的应用。

二、制备烟酸核苷、烟酸腺嘌呤二核苷酸和烟酸单核苷酸

本发明所述的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸激酶、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸二磷酸酶和5’-核苷酸酶还可以用于制备烟酸核苷、烟酸腺嘌呤二核苷酸和烟酸单核苷酸。

具体而言，本发明还提供了一种用酶法制备烟酸核苷的方法，包括使用5’-核苷酸酶以烟酸单核苷酸或其盐为底物进行反应，其中所述5’-核苷酸酶的氨基酸序列如SEQ IDNO.1所示。

5’-核苷酸酶与烟酸单核苷酸或其盐反应生成烟酸核苷和无机磷酸盐。当烟酸单核苷酸为氧化型时，生成的烟酸核苷也为氧化型，反之为还原型。以氧化型β-型为例，上述反应所涉及的化学反应结构式如下：

所述5’-核苷酸酶和所述烟酸单核苷酸或其盐的重量比优选为(0.01-10):1。

上述方法还可以包括使用烟酰胺腺嘌呤二核苷酸二磷酸酶以烟酸腺嘌呤二核苷酸或其盐为底物进行反应，其中所述烟酰胺腺嘌呤二核苷酸二磷酸酶的氨基酸序列如SEQID NO.2所示。

烟酰胺腺嘌呤二核苷酸二磷酸酶与烟酸腺嘌呤二核苷酸或其盐反应生成烟酸单核苷酸或其盐和AMP。当烟酸腺嘌呤二核苷酸为氧化型时，生成的烟酸单核苷酸也为氧化型，反之为还原型。以氧化型β-型为例，反应所涉及的化学反应结构式如下：

所述烟酰胺腺嘌呤二核苷酸二磷酸酶和所述烟酸腺嘌呤二核苷酸或其盐的重量比优选为(0.01-10):1。

该烟酸单核苷酸或其盐可以供应上文所述5’-核苷酸酶与烟酸单核苷酸或其盐的反应。

所述方法还可以包括使用烟酰胺腺嘌呤二核苷酸激酶以烟酸腺嘌呤二核苷酸磷酸或其盐为底物进行反应，其中所述烟酰胺腺嘌呤二核苷酸激酶的氨基酸序列如SEQ IDNO.3所示。

烟酰胺腺嘌呤二核苷酸激酶与烟酸腺嘌呤二核苷酸磷酸或其盐反应生成烟酸腺嘌呤二核苷酸或其盐和无机磷酸盐。当烟酸腺嘌呤二核苷酸磷酸为氧化型时，生成的烟酸腺嘌呤二核苷酸也为氧化型，反之为还原型。以氧化型β-型为例，反应所涉及的化学反应结构式如下：

所述烟酰胺腺嘌呤二核苷酸激酶和所述烟酸腺嘌呤二核苷酸磷酸的重量比优选为(0.01-10):1。

该烟酸腺嘌呤二核苷酸或其盐可以供应上文所述烟酰胺腺嘌呤二核苷酸二磷酸酶与烟酸腺嘌呤二核苷酸或其盐的反应。

上述各反应均可以在25-40℃、pH5-10下进行。其中优选的反应温度为30-40℃，更优选为32-40℃。其中优选的pH为pH6-9，更优选为pH6.5-8.5。

优选地，上述反应需要离子的辅助。所述各反应优选在0.01ppm-100000ppm的一种或多种离子的存在下进行。离子优选包括各种金属离子、氯离子、镁离子、钙离子、钾离子、钠离子、锌离子、氟离子、硫离子、碳酸根离子、亚硫酸根离子、各种含磷离子。优选包括钠离子、镁离子、钾离子、碳酸根离子、亚硫酸根离子和各种含磷离子。

本发明的方法所涉及的底物烟酸单核苷酸或其盐、烟酸腺嘌呤二核苷酸或其盐和烟酸腺嘌呤二核苷酸磷酸或其盐还可以商购获得，也可以利用已知的生产方法自行生产得到。所述盐可以为钠盐、二钠盐、锂盐、单磷酸盐、二磷酸盐、硫酸盐、碳酸盐、醋酸盐、硼酸盐等。

在制备烟酸核苷的情况中，本发明可以只利用5’-核苷酸酶以烟酸单核苷酸或其盐为底物生产烟酸核苷。出于某些特定的原因，例如出于成本考虑或者烟酸单核苷酸或其盐供应不足时，可以先利用烟酰胺腺嘌呤二核苷酸二磷酸酶以烟酸腺嘌呤二核苷酸或其盐为底物生产烟酸单核苷酸或其盐，然后再进行所述5’-核苷酸酶的反应。进一步地，出于某些特定的原因，例如出于成本考虑或者烟酸腺嘌呤二核苷酸或其盐供应不足时，可以先利用烟酰胺腺嘌呤二核苷酸激酶以烟酸腺嘌呤二核苷酸磷酸或其盐为底物生产烟酸腺嘌呤二核苷酸或其盐，然后再进行所述烟酰胺腺嘌呤二核苷酸二磷酸酶的反应。

相似地，在制备烟酸单核苷酸的情况中，可以只利用烟酰胺腺嘌呤二核苷酸二磷酸酶以烟酸腺嘌呤二核苷酸或其盐为底物生产烟酸单核苷酸。出于某些特定的原因，例如出于成本考虑或者烟酸腺嘌呤二核苷酸或其盐供应不足时，可以先利用烟酰胺腺嘌呤二核苷酸激酶以烟酸腺嘌呤二核苷酸磷酸或其盐为底物生产烟酸腺嘌呤二核苷酸或其盐，然后再进行所述烟酰胺腺嘌呤二核苷酸二磷酸酶的反应。

在上述反应过程中，可以通过HPLC在特定的时间点检测反应体系中的底物和产物的量，当底物的量已耗用超过10-100％而产物的量相对提升时，可以使反应结束。

在利用上述两种酶或三种酶联合制备烟酸核苷的情况中，以及在利用上述两种酶联合制备烟酸单核苷酸的情况中，可以单独以分开的步骤分别加入所需的酶，以进行所述酶反应；也可以将所需的酶同时混合加入以进行所述酶反应。

在同时混合三种酶制备烟酸核苷的一些实施方案中，所述方法包括将烟酰胺腺嘌呤二核苷酸激酶、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸二磷酸酶和5’-核苷酸酶与烟酸腺嘌呤二核苷酸磷酸或其盐混合，使反应进行1.5-8小时。

在上述实施方案中，优选地，基于反应体系的初始总体积，烟酰胺腺嘌呤二核苷酸激酶的量为0.1-10％(w/v)，烟酰胺腺嘌呤二核苷酸二磷酸酶的量为0.1-10％(w/v)，5’-核苷酸酶的量为0.1-10％(w/v)，烟酸腺嘌呤二核苷酸磷酸或其盐的量为0.1-5％(w/v)。

在上述实施方案中，首先烟酰胺腺嘌呤二核苷酸激酶与烟酸腺嘌呤二核苷酸磷酸或其盐反应，随着烟酸腺嘌呤二核苷酸或其盐的生成，烟酰胺腺嘌呤二核苷酸二磷酸酶催化烟酸腺嘌呤二核苷酸或其盐转化成烟酸单核苷酸或其盐，进而烟酸单核苷酸或其盐被5’-核苷酸酶转化成烟酸核苷。

当反应时间低于1.5小时时，反应不充分，不能获得足够的烟酸核苷；当反应时间大于8小时时，反应液在不添加抗生素或其他抑菌性化学品的情况下会出现微生物污染的状况，液体会开始较为粘稠并发出异味难于处理，反应液中的底物和产物的含量也会同时下降，而不能预视的副产物随时间的延长而有所增加，最终将导致反应不能继续进行并报废。

在制备烟酸单核苷酸时，上述方法不引入5’-核苷酸酶并且反应时间相应地缩短(例如缩短至1.5-6小时)即可。

在同时混合两种酶联合制备烟酸核苷的一些实施方案中，所述方法包括将烟酰胺腺嘌呤二核苷酸二磷酸酶和5’-核苷酸酶与烟酸腺嘌呤二核苷酸或其盐混合，使反应进行1.5-8小时。

在上述实施方案中，优选地，基于反应体系的初始总体积，烟酰胺腺嘌呤二核苷酸二磷酸酶的量为0.1-10％(w/v)，5’-核苷酸酶的量为0.1-10％(w/v)，烟酸腺嘌呤二核苷酸或其盐的量为0.1-10％(w/v)。

在上述实施方案中，首先烟酰胺腺嘌呤二核苷酸二磷酸酶催化烟酸腺嘌呤二核苷酸或其盐转化成烟酸单核苷酸或其盐，随着烟酸单核苷酸或其盐的生成，5’-核苷酸酶将烟酸单核苷酸或其盐转化成烟酸核苷。

当上述反应的时间低于1.5小时时，反应不充分，不能获得足够的烟酰胺核苷；当反应时间大于8小时时，反应液在不添加抗生素或其他抑菌性化学品的情况下会出现微生物污染的状况，液体会开始较为粘稠并发出异味难于处理，反应液中的底物和产物的含量也会同时下降，而不能预视的副产物随时间的延长而有所增加，最终将导致反应不能继续进行并报废。

在制备烟酸单核苷酸时，上述方法不引入5’-核苷酸酶并且反应时间相应地缩短(例如缩短至1.5-4小时)即可。

在分步制备烟酸核苷的一些实施方案中，所述方法包括以下步骤：

1)将烟酰胺腺嘌呤二核苷酸激酶与烟酸腺嘌呤二核苷酸磷酸或其盐混合，使其反应产生烟酸腺嘌呤二核苷酸或其盐；

2)当所述烟酸腺嘌呤二核苷酸磷酸或其盐的量下降至步骤1)所述的反应初始时的20-100％以下时，将所述烟酸腺嘌呤二核苷酸或其盐与烟酰胺腺嘌呤二核苷酸二磷酸酶混合，使其反应产生烟酸单核苷酸或其盐；

3)当所述烟酸腺嘌呤二核苷酸或其盐的量下降至步骤2)所述的反应初始时的10-100％以下时，将所述烟酸单核苷酸或其盐与5’-核苷酸酶混合，使其反应产生烟酸核苷。

在上述实施方案中，优选地，基于步骤1)反应体系的初始总体积，烟酰胺腺嘌呤二核苷酸激酶的量为0.1-10％(w/v)，烟酸腺嘌呤二核苷酸磷酸或其盐的量为0.1-10％(w/v)；基于步骤2)反应体系的初始总体积，烟酰胺腺嘌呤二核苷酸二磷酸酶的量为0.1-10％(w/v)；基于步骤3)反应体系的初始总体积，5’-核苷酸酶的量为0.1-10％(w/v)。

可以通过HPLC来监测各步产物的量，以在合适的时间点进行下一步反应。

在制备烟酸单核苷酸时，上述方法不引入5’-核苷酸酶并且当所述烟酸腺嘌呤二核苷酸或其盐的量下降至步骤2)所述的反应初始时的10-100％以下时，可以结束反应。

在分步制备烟酸核苷的另一些实施方案中，所述方法包括以下步骤：

I)将烟酸腺嘌呤二核苷酸或其盐与烟酰胺腺嘌呤二核苷酸二磷酸酶混合，使其反应产生烟酸单核苷酸或其盐；

II)当所述烟酸腺嘌呤二核苷酸或其盐的量下降至步骤I)所述的反应初始时的10-100％以下时，将所述烟酸单核苷酸或其盐与5’-核苷酸酶混合，使其反应产生烟酸核苷。

在上述实施方案中，优选地，基于步骤I)反应体系的初始总体积，烟酰胺腺嘌呤二核苷酸二磷酸酶的量为0.1-10％(w/v)，烟酸腺嘌呤二核苷酸的量为0.1-10％(w/v)；基于步骤II)反应体系的初始总体积，5’-核苷酸酶的量为0.1-10％(w/v)。

可以通过HPLC来监测各步产物的量，以在合适的时间点进行下一步反应。

在制备烟酸单核苷酸时，上述方法不引入5’-核苷酸酶并且当所述烟酸腺嘌呤二核苷酸或其盐的量下降至步骤I)所述的反应初始时的10-100％以下时，可以结束反应。

优选地，所述5’-核苷酸酶、所述烟酰胺腺嘌呤二核苷酸二磷酸酶、和所述烟酰胺腺嘌呤二核苷酸激酶是利用生物工程法并通过微生物发酵得到的。

5’-核苷酸酶的基因可以来自肠道沙门氏菌(Salmonella enterica)(EC3.1.3.5)；烟酰胺腺嘌呤二核苷酸二磷酸酶的基因可以来自酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)(EC3.6.1.22)；烟酰胺腺嘌呤二核苷酸激酶的基因可以来自艰难梭菌(Clostridioides difficile)(EC 2.7.1.23)。

可以用表达载体分别单独表达所述三种酶的重组酶，也可以在同一个载体中表达两种或三种酶的重组酶。表达载体可以是分子生物学领域中所常用的表达载体，宿主细胞也可以是分子生物学领域中所常用的菌种，如大肠杆菌、酵母菌等。

生物酶法反应可以使用表达重组酶的细胞、细胞破碎液、上清液或纯化酶液进行；也可以将上述重组酶以单独或混合的方式，以任何形式的固定方法和载体制成固定化酶/细胞制品来进行酶反应。

在一些实施方案中，所述烟酰胺腺嘌呤二核苷酸激酶、所述烟酰胺腺嘌呤二核苷酸二磷酸酶和所述5’-核苷酸酶以固定化酶/细胞的形式提供。

在一个具体的实施方案中，当生产烟酸腺嘌呤二核苷酸时，原材料为烟酸腺嘌呤二核苷酸磷酸，反应溶液的配置为1.21g三羟甲基氨基甲烷，74.4mg烟酸腺嘌呤二核苷酸磷酸和406mg六水氯化镁，加入纯水80ml后以0.1M盐酸/氢氧化钠调节pH至7.8-8.0；反应溶液维持在37℃和pH 8.0下进行搅拌，加入10ml烟酰胺腺嘌呤二核苷酸激酶上清液，以高效液相色谱分析反应液中烟酸腺嘌呤二核苷酸磷酸和烟酸腺嘌呤二核苷酸的浓度，反应2小时后烟酸腺嘌呤二核苷酸磷酸的浓度在反应溶液中下降至0.28mM，烟酸腺嘌呤二核苷酸的浓度在反应溶液中的浓度在两小时后达0.66mM，酶反应可以结束。

当制备烟酸单核苷酸时，上述方法可继续加入10ml烟酰胺腺嘌呤二核苷酸二磷酸酶上清液进行反应，由烟酸腺嘌呤二核苷酸转化合成烟酸单核苷酸，反应2小时后得0.55mM烟酸单核苷酸。

当制备烟酸核苷时，上述方法可以继续加入10ml 5’-核苷酸酶，进一步转化烟酸单核苷酸至烟酸核苷，反应2小时后得0.47mM烟酸核苷。

上述整个反应过程也可以同时混含加入所需的酶，以一步的方式从所选用的原材料转化至所需产品。

在本发明的方法中，同时混合加酶的方式相比分步加酶的方式有同样甚至更高的转化率。

可以利用本发明所述的酶反应单独或同时生产烟酰胺核苷和烟酸核苷。

本发明还提供了烟酰胺腺嘌呤二核苷酸激酶、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸二磷酸酶和/或5’-核苷酸酶在制备烟酸核苷、烟酸腺嘌呤二核苷酸和烟酸单核苷酸中的应用，其中所述烟酰胺腺嘌呤二核苷酸激酶、所述烟酰胺腺嘌呤二核苷酸二磷酸酶和所述5’-核苷酸酶的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.1所示。

本发明还提供了一种酶的组合物，包含：

烟酰胺腺嘌呤二核苷酸激酶、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸二磷酸酶和5’-核苷酸酶，其中所述三种酶的摩尔比为(0.01-2):(0.01-2):(0.01-1)；或者

烟酰胺腺嘌呤二核苷酸二磷酸酶和5’-核苷酸酶，其中所述两种酶的摩尔比为(0.01-9):(0.01-9)；并且

其中所述烟酰胺腺嘌呤二核苷酸激酶、所述烟酰胺腺嘌呤二核苷酸二磷酸酶和所述5’-核苷酸酶的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.1所示。

本发明还提供了所述酶的组合物在制备烟酸核苷、烟酸腺嘌呤二核苷酸和烟酸单核苷酸中的应用。

以下通过实施例的方式进一步解释或说明本发明内容，但这些实施例不应被理解为对本发明保护范围的限制。

例子

以下除非特别说明，否则以下例子中所用实验方法均使用本领域的常规实验流程、操作、材料和条件进行。

实施例中所用材料和设备的描述如下：

反应调控罐：来自基因港(香港)生物科技有限公司，BR-1L；

可调节流量式吸水泵：购自SURGEFLO公司，FL-32；

酸碱度调控装置：来自基因港(香港)生物科技有限公司，AR-1；

六水氯化镁：购自广东西陇化工有限公司；

三羟甲基氨基甲烷：购自Merck,USA；

氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸二钠盐：来自基因港(香港)生物科技有限公司,中国香港；

氧化型β-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸和氧化型β-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸钠盐：来自基因港(香港)生物科技有限公司,中国香港；

氧化型β-烟酰胺单核苷酸：来自基因港(香港)生物科技有限公司,中国香港；

氧化型β-烟酸腺嘌呤二核苷酸磷酸钠盐：购自Merck,USA；

氧化型β-烟酸腺嘌呤二核苷酸：来自基因港(香港)生物科技有限公司,中国香港；

氧化型β-烟酸单核苷酸：来自基因港(香港)生物科技有限公司,中国香港；

氧化型β-烟酸核苷：来自基因港(香港)生物科技有限公司,中国香港；

除非特别说明，否则以下例子中所用酶的底物均为氧化型和β-手性。

实施例1：制备烟酰胺腺嘌呤二核苷酸激酶(EC 2.7.1.23)

根据艰难梭菌(Clostridioides difficile)基因组中编码烟酰胺腺嘌呤二核苷酸激酶的DNA序列(SEQ ID NO.4)(基因bank登录号ARC14363.1)设计PCR引物，具体为：

上游引物NADK1：

5'-CTGACC

下游引物NADK2：

5'-TATGCG

以艰难梭菌(Clostridioides difficile)的基因组DNA为模板，以上述引物进行PCR扩增得烟酰胺腺嘌呤二核苷酸激酶基因，利用限制性内切酶BamH I和EcoRI处理PCR产物并将其连接至pET-21a中，得到pET-NADK。将此重组表达载体转化至大肠杆菌HB101中，得到烟酰胺腺嘌呤二核苷酸激酶重组表达菌株。

将上述菌株挑选单一菌落接种到4mL LB培养基(含100μg/ml氨苄青霉素)中，在37℃、200rpm摇床中培养16小时作为初级种子，完成后按1％接种比例接到100mL LB培养基(含100μg/ml氨苄青霉素)中，在37℃、200rpm摇床中培养10小时作为二级种子，完成后按1％接种比例接到容纳有60L LB培养基(含100μg/ml氨苄青霉素)中的100L发酵罐中培养。发酵初始条件为37℃、200rpm、pH7.0。发酵进行至9小时加入IPTG至最终浓度为1mM，发酵20小时结束。发酵液在4℃下以12,500rpm离心10分钟，得含烟酰胺腺嘌呤二核苷酸激酶的大肠杆菌细胞1.34kg。将所得含烟酰胺腺嘌呤二核苷酸激酶的大肠杆菌细胞配制成酶液,酶液的配制方法为：每1g的细胞中加入磷酸钠缓冲液(PBS 100mM pH 7.5)打浆(即混匀)后，使用压力式细胞破碎器以700-800MPa的设定下进行破碎得细胞破碎液，并以管式离心机在10,000rpm和100L/hr的设定下进行离心，取上清液，每1ml酶液中含0.2g细胞。根据其酶法反应对酶液进行酶活力检测，方法为：在1ml的反应溶液(200mM PBS pH 8.0,20mM氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸二钠盐)中加入含有1mg总蛋白量的酶液，在摄氏37度的温控下进行5分钟反应，完成后以高效液相色谱对样本中在酶反应中所产生的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸进行含量分析。根据上述方法本酶液的酶活约为0.6nmol/min/mg。

实施例2：制备烟酰胺腺嘌呤二核苷酸二磷酸酶(EC 3.6.1.22)

基于酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)基因组中的编码烟酰胺腺嘌呤二核苷酸二磷酸酶的DNA序列(PJP11175.1)(SEQ ID NO.7)设计PCR引物，具体为

上游引物NDP1：

5'-CTGACC

下游引物NDP2：

5'-TATGCG

以酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)的基因组DNA为底物，以上述引物进行PCR扩增得烟酰胺腺嘌呤二核苷酸二磷酸酶基因，利用限制性内切酶BamH I和EcoR I处理PCR产物并将其连接至pET-21a中，得到pET-NDP。将此重组表达载体转化至大肠杆菌HB101中，得到烟酰胺腺嘌呤二核苷酸二磷酸酶重组表达菌株。

将上述菌株挑选单一菌落接种到4mL LB培养基(含100μg/ml氨苄青霉素)中，在37℃、200rpm摇床中培养16小时作为初级种子，完成后按1％接种比例接到100mL LB培养基(含100μg/ml氨苄青霉素)中，在37℃、200rpm摇床中培养10小时作为二级种子，完成后按1％接种比例接到容纳有60L LB培养基(含100μg/ml氨苄青霉素)的100L发酵罐中培养。发酵初始条件为37℃、200rpm、pH7.0。发酵进行至9小时加入IPTG至最终浓度为1mM，发酵20小时结束。发酵液在4℃下以12,500rpm离心10分钟，得含烟酰胺腺嘌呤二核苷酸二磷酸酶的大肠杆菌细胞1.74kg。将所得含烟酰胺腺嘌呤二核苷酸二磷酸酶的大肠杆菌细胞配制成酶液。酶液的配制方法为：每1g的细胞中加入磷酸钠缓冲液(PBS 100mM，pH 7.5)打浆后，使用压力式细胞破碎器以700-800MPa的设定下进行破碎，得细胞破碎液并以管式离心机在10,000rpm和100L/hr的设定下进行离心，取上清液，每1ml酶液中含0.2g细胞。根据其酶法反应对该酶液进行酶活力检测，该方法为：在1ml的反应溶液(200mM PBS pH 8.0,10mM烟酰胺腺嘌呤二核苷酸钠盐中加入含有1mg总蛋白量的酶液，在摄氏37度的温控下进行5分钟反应，完成后以高效液相色谱对样本中在酶反应中所产生的β-烟酰胺单核苷酸进行含量分析。根据上述方法本酶液的酶活约为0.71nmol/min/mg。

实施例3：制备5’-核苷酸酶(EC 3.1.3.5)

基于肠道沙门氏菌(Salmonella enterica)基因组中的编码5’-核苷酸酶的DNA序列(AVB07708.1)(SEQ ID NO.10)设计PCR引物，具体为

上游引物NUCL1：

5'-CTGACC

下游引物NUCL2：

5'-TATGCG

以肠道沙门氏菌(Salmonella enterica)的基因组DNA为底物，以上述引物进行PCR扩增得5’-核苷酸酶基因，利用限制性内切酶BamH I和EcoR I处理PCR产物并将其连接至pET-21a中，得到pET-USHA。将此重组表达载体转化至大肠杆菌HB101中，得到5’-核苷酸酶重组表达菌株。

将上述菌株挑选单一菌落接种到4mL LB培养基(含100μg/ml氨苄青霉素)中，在37℃、200rpm摇床中培养16小时作为初级种子，完成后按1％接种比例接到100mL LB培养基(含100μg/ml氨苄青霉素)中，在37℃、200rpm摇床中培养10小时作为二级种子，完成后按1％接种比例接到容纳有60L LB培养基(含100μg/ml氨苄青霉素)的100L发酵罐中培养。发酵初始条件为37℃、200rpm、pH7.0。发酵进行至9小时加入IPTG至最终浓度为1mM，发酵20小时结束。发酵液在4℃下以12,500rpm离心10分钟，得含5’-核苷酸酶的大肠杆菌细胞1.55kg。将所得含5’-核苷酸酶的大肠杆菌细胞配制成酶液。酶液的配制方法为：每1g的细胞中加入磷酸钠缓冲液(PBS 100mM pH 7.5)打浆后，使用压力式细胞破碎器以700-800MPa的设定下进行破碎得细胞破碎液，并以管式离心机在10,000rpm和100L/hr的设定下进行离心，取上清液，每1ml酶液中含0.2g细胞。根据其酶法反应对该酶液进行酶活力检测，方法为：在1ml的反应溶液(200mM PBS pH 8.0,10mMβ-烟酰胺单核苷酸)中加入含有1mg总蛋白量的酶液，在摄氏37度的温控下进行5分钟反应，完成后以高效液相色谱对样本中在酶反应中所产生的烟酰胺核苷进行含量分析。根据上述方法本酶液的酶活约为0.62nmol/min/mg。

实施例4:以氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸二钠盐为底物使用酶液进行分步酶法反应制备烟酰胺核苷

按实施例1-3制备烟酰胺腺嘌呤二核苷酸激酶、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸二磷酸酶和5’-核苷酸酶的酶上清液备用。使用2L实验用烧杯配制反应溶液，在烧杯内按下述的次序称重12.1g三羟甲基氨基甲烷，0.24g氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸二钠盐和4.1g的六水氯化镁并加入600ml纯水，启动外置搅拌装置至所有原材料完全溶解。以0.1M的盐酸/氢氧化钠调节溶液的酸碱值至pH 8.0，以纯水定溶至1L后，将烧杯连接恒温装置并保温30分钟至溶液的温度稳定在37℃，取样以高效液相色谱分析反应溶液中氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸的浓度和含量。在50-100rpm的搅拌下加入100ml的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸激酶上清酶液，使用酸碱度调控装置实时监控反应过程中的pH变化并以0.1M盐酸/氢氧化钠溶液作调节，每30分钟取样并以实验例1的方法对该样进行氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸和烟酰胺腺嘌呤二核苷酸的含量分析；反应在2hr后，氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸的含量已耗用超过80％而烟酰胺腺嘌呤二核苷酸的含量增加(见下表)，滴加5M盐酸溶液2-5ml调节至pH3.0使第一步反应结束。

反应溶液搅拌30分钟后可以使用中速滤纸过滤除去烟酰胺腺嘌呤二核苷酸激酶或直接进行下一步酶法反应。在反应溶液中滴加5M氢氧化钠溶液1-3ml调节至pH8.0并维持反应条件进行第二步反应。反应溶液中加入100ml的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸二磷酸酶上清酶液，使用酸碱度调控装置实时监控反应过程中的pH变化并以0.1M盐酸/氢氧化钠溶液作调节，每30分钟取样品并以实验例1的方法对该样进行氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸和β-烟酰胺单核苷酸的含量分析。反应至2hr，烟酰胺腺嘌呤二核苷酸的含量已耗用超过90％而β-烟酰胺单核苷酸的含量增加(见下表)，滴加5M盐酸溶液2-5ml调节至pH3.0以使第二步反应结束。

开始下一步反应，加入100ml的5’-核苷酸酶上清酶液，使用酸碱度调控装置实时监控反应过程中的pH变化并以0.1M盐酸/氢氧化钠溶液作调节，每30分钟取样并以实验例1的方法对该样进行β-烟酰胺单核苷酸和烟酰胺核苷的含量分析。反应在2hr后，β-烟酰胺单核苷酸的含量已耗用超过90％而烟酰胺核苷的含量有相应的提升(见下表)，酶法制备烟酰胺核苷的反应可以结束。共生产79.5mg烟酰胺核苷。

实施例5:以氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸二钠盐为底物使用酶液进行混合酶法反应制备烟酰胺核苷

按实施例1-3制备烟酰胺腺嘌呤二核苷酸激酶、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸二磷酸酶和5’-核苷酸酶的酶上清液备用。使用2L实验用烧杯配制反应溶液，在烧杯内按下述的次序称重12.1g三羟甲基氨基甲烷，0.24g氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸二钠盐和4.1g的六水氯化镁并加入600ml纯水，启动外置搅拌装置至所有原材料完全溶解。以0.1M的盐酸/氢氧化钠调节溶液的酸碱值至pH 8.0，以纯水定溶至1L后，将烧杯连接恒温装置并保温30分钟至溶液的温度稳定在37℃，取样以高效液相色谱分析反应溶液中氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸、β-烟酰胺单核苷酸和烟酰胺核苷的浓度和含量(见下表)。在50-100rpm的搅拌下同时加入烟酰胺腺嘌呤二核苷酸激酶、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸二磷酸酶和5’-核苷酸酶各100ml，使用酸碱度调控装置实时监控反应过程中的pH变化并以0.1M盐酸/氢氧化钠溶液作调节，每60分钟取样并以实验例1的方法对该样进行氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸和烟酰胺核苷的含量分析(见下表)。反应在3hr后，氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸的含量已耗用超过80％而烟酰胺核苷的含量有着相对的提升，整套混合酶法制备烟酰胺核苷的反应可以结束，连其他工序共历时3.5小时，共生产73.6mg烟酰胺核苷，以混合酶组的方式生产相比分步酶反应生产效率更高。

实施例6:以烟酰胺腺嘌呤二核苷酸为底物使用酶上清液进行混合酶法反应制备烟酰胺核苷

按实施例2-3制备烟酰胺腺嘌呤二核苷酸二磷酸酶和5’-核苷酸酶的酶上清液备用。使用2L实验用烧杯配制反应溶液，在烧杯内按下述的次序称重12.1g三羟甲基氨基甲烷，0.21g烟酰胺腺嘌呤二核苷酸和4.1g六水氯化镁，加入600ml纯水，启动外置搅拌装置至所有原材料完全溶解，以0.1M的盐酸/氢氧化钠调节溶液的酸碱值至pH 8.0，以纯水定溶至1L后，将烧杯连接恒温装置并保温30分钟至溶液的温度稳定在37℃，取样以高效液相色谱分析反应溶液中烟酰胺腺嘌呤二核苷酸和烟酰胺核苷的浓度和含量。在50-100rpm的搅拌下同时加入烟酰胺腺嘌呤二核苷酸二磷酸酶和5’-核苷酸酶的酶上清液各100ml，使用酸碱度调控装置实时监控反应过程中的pH变化并以0.1M盐酸/氢氧化钠溶液作调节，每60分钟取样并以实验例1的方法对该样进行烟酰胺腺嘌呤二核苷酸和烟酰胺核苷的含量分析。反应在3hr时，烟酰胺腺嘌呤二核苷酸的含量已耗用超过90％而烟酰胺核苷的含量有着相应的提升(见下表)，整套混合酶组的酶法制备烟酰胺核苷的反应可以结束，连其他工序共历时3.5小时，共生产72.6mg烟酰胺核苷。该制备方法、条件和流程与实施例5相同，可见底物的变动不影响生产设备和流程，显示了本发明生产工艺的多元化和灵活性。

实施例7:以β-烟酰胺单核苷酸为底物使用酶上清液进行酶法反应制备烟酰胺核苷

按实施例3制备5’-核苷酸酶的酶上清液备用。使用2L实验用烧杯配制反应溶液，在烧杯内按下述的次序称重12.1g三羟甲基氨基甲烷，0.1gβ-烟酰胺单核苷酸和4.1g的六水氯化镁并加入600ml纯水，启动外置搅拌装置至所有原材料完全溶解，以0.1M的盐酸/氢氧化钠调节溶液的酸碱值至pH 8.0，以纯水定溶至1L后，将烧杯连接恒温装置并保温30分钟至溶液的温度稳定在37℃，取样以高效液相色谱分析反应溶液中β-烟酰胺单核苷酸和烟酰胺核苷的浓度和含量(见下表)。在50-100rpm的搅拌下同时加入5’-核苷酸酶上清液100ml，使用酸碱度调控装置实时监控反应过程中的pH变化并以0.1M盐酸/氢氧化钠溶液作调节，每60分钟取样并以实验例1的方法对该样进行β-烟酰胺单核苷酸和烟酰胺核苷的含量分析；反应3hr时，β-烟酰胺单核苷酸的含量已耗用超过90％而烟酰胺核苷的含量有着相应的提升(见下表)，整套混合酶组的酶法制备烟酰胺核苷的反应结束，共生产75.1mg烟酰胺核苷，工艺流程与实施例5-6相同。

实施例8:以氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸二钠盐为底物使用固定化酶进行混合酶组的酶法反应制备烟酰胺核苷

根据中国专利CN1982445B(其全部内容以引用方式并入本文)的实施例3的方法，在固相载体上按下表所示的酶液总蛋白量重量比制备混合含有烟酰胺腺嘌呤二核苷酸激酶、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸二磷酸酶和5’-核苷酸酶的固定化酶；载体的形状皆为条形：长25cm、宽5cm、厚5mm，固定化酶成品的重量为37.4g，烟酰胺腺嘌呤二核苷酸激酶酶上清液2420ml、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸二磷酸酶酶上清液2165ml和5’-核苷酸酶酶上清液698ml。固定化酶的总酶活力为1.2nmol/min/g。测定酶活的方法为：在1ml的反应溶液(200mM三羟甲基氨基甲烷-盐酸pH 8.0，20mM氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸二钠盐,16mM六水氯化镁)中加入共20mg以剪刀由上述固定化酶成品切成长3mm x阔3mm x高5mm的长方形颗粒，在摄氏37度的温控下和1000rpm的震荡下进行5分钟反应，完成后以高效液相色谱对样本中在酶反应中所产生的烟酰胺核苷进行含量分析。

将上述制得的固定化酶载体安装于固定化酶反应器中。该反应器为有机玻璃制成的圆柱体，高7cm、半径4.5cm。用刀将上述载体头尾端约3cm以斜度45°整齐削去，紧握卷成高5cm、半径2.5cm的均质圆柱体，重量为7.8g。将该圆柱体插入反应器中，使其松紧程度符合中国发明专利申请CN106032520A(其全部内容以引用方式并入本文)中松紧程度符合表1中所述的3级标准，并且使其侧壁与反应器的内壁之间不留空隙。完成安装后，按CN106032520A图1进行其它配备装置的安装程序，其中反应调控罐容量为1L；高流量水泵是可调节流量式吸水泵，流速为0.5L/分钟；酸碱度调控装置采用0.1M盐酸/氢氧化钠溶液进行pH调控，其加液泵的流量为每分钟1ml。

在反应调控罐中按下述的次序加入9.68g三羟甲基氨基甲烷，2.36g氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸二钠盐和3.3g的六水氯化镁并加入550ml纯水，启动搅拌装置至所有原材料完全溶解，以0.1M的盐酸/氢氧化钠调节溶液的酸碱值至pH 8.0，以纯水定溶至800ml后，将反应调控罐连接高流量水泵和装有上述三种固定化酶的反应器并启动反应，每60分钟取样一次，以实验例1的高效液相色谱分析当中的氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸和烟酰胺核苷在反应溶液中的含量变化，经1.5hr反应，氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸的浓度已降至0.3mM而烟酰胺核苷的含量在反应溶液中有相应的增长(见下表)，反应结束共生产550mg烟酰胺核苷。由于三种上清酶液皆平均地固定在同一个载体上，酶法反应更为紧密，促使在反应速度和转化率上有所提升，同时省却当中的生产工序，使操作变得更容易，固定化酶更有可以重复利用的优点，在工艺上和成本上将对工业化更为有利。

实施例9:以烟酸腺嘌呤二核苷酸磷酸钠盐为底物使用上清酶液进行分步酶法反应制备烟酸腺嘌呤二核苷酸、烟酸单核苷酸和烟酸核苷

按实施例1-3制备烟酰胺腺嘌呤二核苷酸激酶、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸二磷酸酶和5’-核苷酸酶的酶上清液备用。使用25ml实验用烧杯配制反应溶液，在烧杯内按下述的次序称重120mg三羟甲基氨基甲烷，0.74mg烟酸腺嘌呤二核苷酸磷酸钠盐和41mg的六水氯化镁并加入5ml纯水，使用磁力搅拌至所有原材料完全溶解，以0.01M的盐酸/氢氧化钠调节溶液的酸碱值至pH 8.0，以纯水定溶至10ml后，将烧杯置于恒温水床中并保温30分钟至溶液的温度稳定在37℃，取样并以实验例1的高效液相色谱方法分析反应溶液中烟酸腺嘌呤二核苷酸磷酸、烟酸腺嘌呤二核苷酸、烟酸单核苷酸和烟酸核苷的浓度和含量(见下表)。在50-100rpm的搅拌下加入1ml的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸激酶上清酶液，使用酸碱度调控装置实时监控反应过程中的pH变化并以0.1M盐酸/氢氧化钠溶液作调节，每60分钟取样并对该样进行烟酸腺嘌呤二核苷酸磷酸、烟酸腺嘌呤二核苷酸、烟酸单核苷酸和烟酸核苷的含量分析。反应2hr后，烟酸腺嘌呤二核苷酸磷酸的含量已耗用超过70％，并且烟酸腺嘌呤二核苷酸的含量有相应的提升，滴加5M盐酸溶液0.1-0.3ml调节至pH3.0以结束第一步反应，得目标产物烟酸腺嘌呤二核苷酸。若以烟酸单核苷酸或烟酸核苷为目标产物，则需要进行第二步反应。在过滤反应溶液后，使用0.1M的氢氧化钠调节至pH8.0，加入1ml的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸二磷酸酶上清酶液；反应2hr烟酸腺嘌呤二核苷酸的含量已耗用超过80％并且烟酸单核苷酸的含量有着相应的提升。滴加5M盐酸溶液0.1-0.3ml调节至pH3.0以结束第二步反应，得目标产物烟酸单核苷酸。以烟酸核苷为目标产物则需进行第三步反应，重复上述处理后加入1ml 5’-核苷酸酶上清酶液，反应2hr后烟酸单核苷酸已耗用超过80％并且烟酸核苷的含量有相应的提升，可以结束整套反应(见下表)。

酶的使用也可按照实施例6-7的方式分别由烟酸腺嘌呤二核苷酸和烟酸单核苷酸为底物转化合成至烟酸核苷。

实施例10:以氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸二钠盐为底物使用酶液在摄氏25度进行混合酶法反应制备烟酰胺核苷

按实施例1-3制备烟酰胺腺嘌呤二核苷酸激酶、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸二磷酸酶和5’-核苷酸酶的酶上清液备用。使用2L实验用烧杯配制反应溶液，在烧杯内按下述的次序称重12.1g三羟甲基氨基甲烷，0.24g氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸二钠盐和4.1g的六水氯化镁并加入600ml纯水，启动外置搅拌装置至所有原材料完全溶解。以0.1M的盐酸/氢氧化钠调节溶液的酸碱值至pH 8.0，以纯水定溶至1L后，将烧杯连接恒温装置并保温30分钟至溶液的温度稳定在25℃，取样以高效液相色谱分析反应溶液中氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸、β-烟酰胺单核苷酸和烟酰胺核苷的浓度和含量(见下表)。在50-100rpm的搅拌下同时加入烟酰胺腺嘌呤二核苷酸激酶、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸二磷酸酶和5’-核苷酸酶各100ml，使用酸碱度调控装置实时监控反应过程中的pH变化并以0.1M盐酸/氢氧化钠溶液作调节，每60分钟取样并以实验例1的方法对该样进行氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸和烟酰胺核苷的含量分析(见下表)。反应在8hr后，氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸的含量已耗用超过20％而烟酰胺核苷的含量有着相对的提升，整套混合酶法制备烟酰胺核苷的反应可以结束，连其他工序共历时10小时，共生产16.2mg烟酰胺核苷。

实施例11:以氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸二钠盐为底物使用酶液在摄氏40度进行混合酶法反应制备烟酰胺核苷

按实施例1-3制备烟酰胺腺嘌呤二核苷酸激酶、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸二磷酸酶和5’-核苷酸酶的酶上清液备用。使用2L实验用烧杯配制反应溶液，在烧杯内按下述的次序称重12.1g三羟甲基氨基甲烷，0.24g氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸二钠盐和4.1g的六水氯化镁并加入600ml纯水，启动外置搅拌装置至所有原材料完全溶解。以0.1M的盐酸/氢氧化钠调节溶液的酸碱值至pH 8.0，以纯水定溶至1L后，将烧杯连接恒温装置并保温30分钟至溶液的温度稳定在40℃，取样以高效液相色谱方法分析反应溶液中氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸、β-烟酰胺单核苷酸和烟酰胺核苷的浓度和含量(见下表)。在50-100rpm的搅拌下同时加入烟酰胺腺嘌呤二核苷酸激酶、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸二磷酸酶和5’-核苷酸酶各100ml，使用酸碱度调控装置实时监控反应过程中的pH变化并以0.1M盐酸/氢氧化钠溶液作调节，每60分钟取样并以实验例1的方法对该样进行氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸和烟酰胺核苷的含量分析(见下表)。反应在8hr后，氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸的含量已耗用超过40％而烟酰胺核苷的含量有着相对的提升，整套混合酶法制备烟酰胺核苷的反应可以结束，连其他工序共历时10小时，共生产16.2mg烟酰胺核苷。

实施例12:以氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸二钠盐为底物使用酶上清液在pH5调控下进行混合酶法反应制备烟酰胺核苷

按实施例1-3制备烟酰胺腺嘌呤二核苷酸激酶、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸二磷酸酶和5’-核苷酸酶的酶上清液备用。使用2L实验用烧杯配制反应溶液，在烧杯内按下述的次序称重12.1g三羟甲基氨基甲烷，0.24g氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸二钠盐和4.1g的六水氯化镁并加入600ml纯水，启动外置搅拌装置至所有原材料完全溶解。以0.1M的盐酸/氢氧化钠调节溶液的酸碱值至pH 5.0，以纯水定溶至1L后，将烧杯连接恒温装置并保温30分钟至溶液的温度稳定在37℃，取样以高效液相色谱分析反应溶液中氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸、β-烟酰胺单核苷酸和烟酰胺核苷的浓度和含量(见下表)。在50-100rpm的搅拌下同时加入烟酰胺腺嘌呤二核苷酸激酶、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸二磷酸酶和5’-核苷酸酶各100ml，使用酸碱度调控装置实时监控反应过程中的pH变化并以0.1M盐酸/氢氧化钠溶液作调节，每60分钟取样并以实验例1的方法对该样进行氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸和烟酰胺核苷的含量分析(见下表)。反应在8hr后，氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸的含量已耗用超过20％而烟酰胺核苷的含量有着相对的提升，整套混合酶法制备烟酰胺核苷的反应可以结束，连其他工序共历时8小时，共生产14.1mg烟酰胺核苷。

实施例13:以氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸二钠盐为底物使用酶上清液在pH10调控下进行混合酶法反应制备烟酰胺核苷

按实施例1-3制备烟酰胺腺嘌呤二核苷酸激酶、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸二磷酸酶和5’-核苷酸酶的酶上清液备用。使用2L实验用烧杯配制反应溶液，在烧杯内按下述的次序称重12.1g三羟甲基氨基甲烷，0.24g氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸二钠盐和4.1g的六水氯化镁并加入600ml纯水，启动外置搅拌装置至所有原材料完全溶解。以0.1M的盐酸/氢氧化钠调节溶液的酸碱值至pH10.0，以纯水定溶至1L后，将烧杯连接恒温装置并保温30分钟至溶液的温度稳定在37℃，取样以高效液相色谱分析反应溶液中氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸、β-烟酰胺单核苷酸和烟酰胺核苷的浓度和含量(见下表)。在50-100rpm的搅拌下同时加入烟酰胺腺嘌呤二核苷酸激酶、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸二磷酸酶和5’-核苷酸酶各100ml，使用酸碱度调控装置实时监控反应过程中的pH变化并以0.1M盐酸/氢氧化钠溶液作调节，每60分钟取样并以实验例1的方法对该样进行氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸和烟酰胺核苷的含量分析(见下表)。反应在8hr后，氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸的含量已耗用超过30％而烟酰胺核苷的含量有着相对的提升，整套混合酶法制备烟酰胺核苷的反应可以结束，连其他工序共历时8小时，共生产22.3mg烟酰胺核苷。

实验例1：高效液相色谱分析参数

SEQUENCE LISTING

<110> 百瑞全球有限公司

<120> 制备烟酸或其衍生物的核苷、烟酸腺嘌呤二核苷酸、烟酸单核苷酸的方法、酶组合物及应用

<130> FI-205732-5952

<160> 12

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 266

<212> PRT

<213> 艰难梭菌（Clostridioides difficile）

<400> 1

Met Lys Arg Ile Ile Thr Ile Asn Thr Asn Gln Leu Asn Lys Ser Leu

1 5 10 15

Glu Thr Lys Glu Leu Leu Thr Arg Lys Leu Ile Asn Ala Gly Phe Glu

20 25 30

Val Tyr Ser Asp Ile Tyr Pro Asp Thr Glu Leu Ile Ile Ser Ile Gly

35 40 45

Gly Asp Gly Ser Phe Leu Arg Thr Val Arg Asp Phe Asp Phe Pro Glu

50 55 60

Ile Pro Ile Met Gly Ile Asn Thr Gly His Leu Gly Phe Phe Pro Asp

65 70 75 80

Ile Leu Pro Asp Lys Ile Asp Ser Phe Ile Glu Ala Tyr Thr Lys Lys

85 90 95

Asp Tyr Ile Ile Gln Glu Met Ser Leu Leu Asn Ala Glu Val Tyr Thr

100 105 110

Thr Thr Ser Gly Ser Asn Met Leu Ala Val Asn Glu Val Val Ile Arg

115 120 125

Gly Asp Lys Ser Arg Thr Ile His Leu Asn Leu Ser Leu Asp Asn Lys

130 135 140

His Ile Gln Asn Phe Ser Gly Asp Gly Met Ile Ile Ser Thr Ser Thr

145 150 155 160

Gly Ser Thr Ala Tyr Asn Tyr Ser Ala Gly Gly Ser Ile Val Asp Ile

165 170 175

Asn Leu Glu Leu Met Gln Ile Thr Pro Leu His Pro Ile Asn Thr Asn

180 185 190

Ala Tyr Arg Cys Phe Thr Ser Ser Ile Ile Cys Ser Asn Glu Ser Val

195 200 205

Ile Lys Ile Ala Pro Glu Tyr Arg Phe Glu Asp Ser Val Leu Ile Val

210 215 220

Val Asp Gly Val Glu His Arg Phe Arg Gln Ile Glu Asn Ile Lys Val

225 230 235 240

Ser Ile Ser Asp Ala Lys Ile Lys Leu Leu Arg Met Ser Asn Tyr Glu

245 250 255

Phe Trp His Arg Val Ser Glu Lys Phe Leu

260 265

<210> 2

<211> 384

<212> PRT

<213> 酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）

<400> 2

Met Ser Thr Ala Val Thr Phe Phe Gly Gln His Val Leu Asn Arg Val

1 5 10 15

Ser Phe Leu Arg Cys Ser Lys Glu Phe Ile Lys Lys Ser Leu Asn His

20 25 30

Asp Ser Thr Val Phe Ile Pro Phe Ile Glu Gly Glu Ala Leu Ile Ser

35 40 45

Pro Glu Asn Gly Asp Leu Val Gln Leu Ser Asn Ser Val Lys Ser Tyr

50 55 60

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65 70 75 80

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100 105 110

Ile Ser Tyr Lys Gly Thr Pro Tyr Phe Gly Leu Asp Ile Arg Val Thr

115 120 125

Glu Ser Thr Leu Phe Lys Lys Val Asp Phe Glu Pro Ile Phe Ser Tyr

130 135 140

Pro Lys Val Thr Arg Asp His Ile Phe Lys Gln Thr Asn Glu Asp Ala

145 150 155 160

Ser Leu Tyr Ser Gln Gly Lys Met Tyr Leu Asp Trp Leu Ala Lys Tyr

165 170 175

Lys Phe Cys Pro Gly Cys Gly Ser Pro Leu Phe Pro Val Glu Ala Gly

180 185 190

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210 215 220

Val Ile Ile Ala Leu Thr Asn Ser Asp Tyr Ser Lys Cys Cys Leu Ala

225 230 235 240

Arg Ser Lys Lys Arg Tyr Gly Asp Phe Val Leu Tyr Ser Thr Ile Ala

245 250 255

Gly Phe Met Glu Pro Ser Glu Thr Ile Glu Glu Ala Cys Ile Arg Glu

260 265 270

Ile Trp Glu Glu Thr Gly Ile Ser Cys Lys Asn Ile Asp Ile Val Arg

275 280 285

Ser Gln Pro Trp Pro Tyr Pro Cys Ser Leu Met Ile Gly Cys Leu Gly

290 295 300

Ile Val Gln Phe Asn Ser Lys Asn Glu Val Ile Asn Leu Asn Arg Asp

305 310 315 320

Asp Glu Leu Leu Asp Ala Gln Trp Phe Asp Thr Thr Glu Ile Ile Gln

325 330 335

Ala Leu Asp Lys Tyr Ala Gly Gly Tyr Arg Val Pro Phe Lys Asn Asp

340 345 350

Ile Asn Leu Pro Gly Ser Thr Thr Ile Ala Phe Gln Leu Ile Asp His

355 360 365

Val Cys Glu Asn Tyr Lys Asn Leu Arg Lys Thr Ser Ser Ser His Leu

370 375 380

<210> 3

<211> 518

<212> PRT

<213> 肠道沙门氏菌（Salmonella enterica）

<400> 3

Met Lys Val Lys Leu Leu Ala Ala Gly Ile Leu Phe Thr Leu Pro Phe

1 5 10 15

Trp Ala Cys Ala Lys Asp Val Thr Ile Ile Tyr Thr Asn Asp Leu His

20 25 30

Ala His Val Glu Pro Tyr Lys Val Pro Trp Ile Ala Asp Gly Lys Arg

35 40 45

Asp Ile Gly Gly Trp Ala Asn Ile Thr Thr Leu Val Lys Gln Glu Lys

50 55 60

Ala Lys Asn Lys Ala Thr Trp Phe Phe Asp Ala Gly Asp Tyr Phe Thr

65 70 75 80

Gly Pro Tyr Ile Ser Ser Leu Thr Lys Gly Lys Ala Ile Ile Asp Ile

85 90 95

Leu Asn Thr Met Gln Tyr Asp Ala Ala Thr Ile Gly Asn His Glu Phe

100 105 110

Asp His Gly Trp Asp Asn Thr Leu Leu Gln Leu Ser Arg Ala Lys Phe

115 120 125

Pro Ile Val Gln Gly Asn Ile Phe Tyr Glu Asp Ser Ser Lys Ser Phe

130 135 140

Trp Asp Lys Pro Tyr Thr Ile Val Glu Lys Asp Gly Val Lys Ile Gly

145 150 155 160

Val Ile Gly Leu His Gly Val Phe Ala Phe Asn Asp Thr Val Ser Ala

165 170 175

Ala Thr Arg Val Gly Ile Glu Ala Arg Asp Glu Ile Lys Trp Leu Gln

180 185 190

Arg Tyr Ile Asp Glu Leu Lys Gly Lys Val Asp Leu Thr Val Ala Leu

195 200 205

Ile His Glu Gly Thr Pro Ala Arg Gln Ser Ser Met Gly Asn Thr Asp

210 215 220

Val Arg Arg Ala Leu Asp Lys Asp Ile Gln Thr Ala Ser Gln Val Lys

225 230 235 240

Gly Leu Asp Ile Leu Ile Thr Gly His Ala His Val Gly Thr Pro Glu

245 250 255

Pro Ile Lys Val Gly Asn Thr Leu Ile Leu Ser Thr Asp Ser Gly Gly

260 265 270

Ile Asp Val Gly Lys Leu Val Leu Asp Tyr Gln Glu Lys Pro His Gln

275 280 285

Phe Thr Val Lys Asn Phe Glu Leu Lys Thr Ile Phe Ala Asp Glu Trp

290 295 300

Lys Pro Asp Pro Gln Thr Lys Gln Val Ile Asp Gly Trp Asn Lys Lys

305 310 315 320

Leu Asp Lys Val Val Gln Gln Thr Val Ala Gln Ser Pro Val Glu Leu

325 330 335

Thr Arg Ala Tyr Gly Glu Ser Ser Ser Leu Gly Asn Leu Ala Ala Asp

340 345 350

Ala Leu Leu Phe Thr Ala Gly Lys Asp Thr Gln Leu Ala Leu Thr Asn

355 360 365

Ser Gly Gly Ile Arg Asn Glu Ile Pro Ala Gly Ala Val Thr Met Gly

370 375 380

Ala Val Ile Ser Thr Phe Pro Phe Pro Asn Glu Leu Val Thr Met Asp

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Ser Ser Lys Pro Val Gly Gln Arg Val Thr Val Leu Thr Leu Asn Gly

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450 455 460

Leu Ala Asp Gly Gly Asp Gly Phe Ala Ala Phe Thr Glu Gly Gln Ala

465 470 475 480

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485 490 495

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515

<210> 4

<211> 801

<212> DNA

<213> 艰难梭菌（Clostridioides difficile）

<400> 4

atgaaaagaa ttataactat aaatacaaac caattaaata agtcccttga gactaaagaa 60

ctcttaacta gaaaacttat caatgctggc tttgaagtgt attcagatat ttatccagac 120

acagagctta ttatatcaat tggtggtgat ggctcttttt taagaacagt tagagatttc 180

gattttcctg agattcccat aatgggaata aatacaggtc atctggggtt ttttcctgat 240

attttaccag ataagattga tagctttatt gaagcttata caaaaaaaga ttatattatt 300

caagaaatgt cacttcttaa tgcggaagta tatacaacta ctagtggttc taatatgctt 360

gctgtaaatg aggttgttat aagaggagac aagtctagga ctatacacct aaatttaagc 420

cttgataata aacatataca aaattttagt ggagatggta tgattatttc tacttccaca 480

ggttcaacag cctataacta ttctgctgga ggtagtattg ttgatataaa tcttgaactt 540

atgcagatta cacctttaca tccgataaat accaatgcat ataggtgctt tacatcaagt 600

ataatatgtt caaatgaatc tgttataaag attgcaccag aatatagatt tgaagattct 660

gtattgattg tcgttgatgg agttgagcac agatttagac aaatcgaaaa tataaaagtt 720

agtatatctg atgcaaaaat aaaattactt agaatgtcaa actatgagtt ttggcataga 780

gtatctgaaa aatttttata g 801

<210> 5

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列（artificial sequence ）

<400> 5

ctgaccggat ccatgaaaag aattataact ataaat 36

<210> 6

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列（artificial sequence ）

<400> 6

tatgcggaat tcctataaaa atttttcaga tactct 36

<210> 7

<211> 1155

<212> DNA

<213> 酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）

<400> 7

atgtccactg cagtgacttt ttttggccag catgtcttga acagagtttc gttcttaaga 60

tgttcgaaag agttcatcaa aaaatcattg aaccatgact ctaccgtttt tatcccattt 120

atcgaagggg aagccctcat ttcgcccgaa aatggtgacc tagttcagct ttctaattct 180

gtaaagtctt acaagaatat tttgtcagca atagttcctt tatacactac tttattgaac 240

acaactcgct caagaagcga tgaatcaggc atcaatgtaa catttttagg tctcctggaa 300

ggcacagatt ctgcatttaa ttttgaatgg tctaatattt cttacaaagg aacaccatat 360

tttggattag atatccgtgt tactgagagc acactcttca agaaagtcga ctttgagcct 420

attttttcct atccgaaggt gaccagagat cacattttca aacaaacaaa tgaggatgct 480

tcactttatt cacaaggtaa gatgtatctg gattggctag caaagtacaa attctgtccc 540

ggttgtgggt ctccgttatt cccagtagag gcaggaacta agcttcagtg ttctaatgaa 600

aatcggaatg tatactgtaa tgtgagagat gcaagaatta ataacgtttg cttcccaaga 660

actgatccaa cggtcattat agccttgacc aattcggatt actctaagtg ttgtctggca 720

agatcaaaaa aaaggtacgg tgattttgta ttgtattcaa caatagcagg ttttatggag 780

ccatcagaaa ccatagagga ggcttgtatc agagaaatat gggaggaaac aggcatttca 840

tgcaaaaata ttgatatagt ccggtcacag ccctggcctt acccttgcag tttgatgatt 900

ggctgtttag gcatagttca attcaattcc aaaaatgagg ttatcaacct gaatcgtgac 960

gacgaattat tggatgctca atggtttgat acaactgaaa tcattcaagc tttggataag 1020

tacgccggcg ggtatcgtgt tccattcaaa aatgatatca atttacctgg aagtactacc 1080

attgccttcc aattaatcga tcatgtttgc gagaactata aaaacttacg taagacctca 1140

tcgagccatc tatag 1155

<210> 8

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列（artificial sequence ）

<400> 8

ctgaccggat ccatgtccac tgcagtgact tttttt 36

<210> 9

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列（artificial sequence ）

<400> 9

tatgcggaat tcctatagat ggctcgatga ggtctt 36

<210> 10

<211> 1557

<212> DNA

<213> 肠道沙门氏菌（Salmonella enterica）

<400> 10

atgaaagtaa aactgcttgc tgccggtatt ttgttcacgc tgccgttctg ggcctgcgcc 60

aaagatgtca ccattattta caccaacgat ctacacgccc atgtggagcc ttataaagta 120

ccgtggattg ctgacggtaa acgcgatatt ggcggttggg ccaatatcac tacgctggtg 180

aagcaggaaa aagccaaaaa taaggcgacg tggttttttg atgccggaga ttactttacc 240

ggaccgtata tcagcagcct gacgaagggt aaagcgatta tcgatatttt gaataccatg 300

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ttgcaactga gccgagcaaa attccctatc gtgcagggca atatttttta tgaggacagc 420

agtaaatcct tctgggataa gccgtacacc attgttgaaa aagatggcgt caagattggc 480

gtaatcggct tacacggtgt ctttgctttt aatgatacgg tatccgccgc gacgcgcgtg 540

ggcattgagg cacgcgatga gattaagtgg ctgcaacgtt acattgatga acttaaaggt 600

aaagtcgatc tgaccgtcgc gctgatccac gaaggcaccc cggcccgcca gtccagcatg 660

gggaataccg atgtgcgacg cgcgctggat aaagatattc agaccgcaag tcaggtaaaa 720

gggctggata ttttgattac cggccacgcg catgtcggta cgccggaacc gattaaagtc 780

ggtaatacgc tgattctttc aacggacagc ggcggcattg atgtcggcaa attggtgctg 840

gactaccagg aaaagccgca tcagtttacc gtgaagaact tcgagctgaa gaccattttt 900

gctgatgagt ggaagccaga tccgcaaacg aaacaggtga tcgacggctg gaacaaaaag 960

ctcgataaag tcgtgcagca aacggtggcg cagtcgccgg ttgagctgac ccgcgcgtat 1020

ggcgaatcgt cgtcgctggg gaatctggcg gcggatgcgc tgctttttac ggcggggaaa 1080

gacacccagt tagcgcttac taactctggc ggtatccgca acgaaatccc ggctggcgcg 1140

gtgacgatgg gggcggtaat cagtaccttc ccgttcccta atgaactggt cacgatggat 1200

ttaaccggta aacaattgcg cagcctgatg gagcatggcg ctggcttaag caacggcgta 1260

ttgcaggtgt ctaaagggct ggagatgaag tatgacagca gcaaacctgt cggccagcgg 1320

gttaccgtgc tgacgctcaa tggcaagccg attgatgatg cggcggttta tcacatcgct 1380

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<210> 11

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列（artificial sequence ）

<400> 11

ctgaccggat ccatgaaagt aaaactgctt gctgcc 36

<210> 12

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列（artificial sequence ）

<400> 12

tatgcggaat tcttacttct tcacatccgc aacgcg 36