寡核苷酸，寡核苷酸组，脑膜炎奈瑟菌、肺炎链球菌和流感嗜血杆菌同时检测方法和试剂盒

技术领域

本发明总体上涉及核酸的扩增和检测。特别是，提供了在单个步骤中同时证实和鉴别细菌性脑膜炎病原体的方法、寡核苷酸和诊断试剂盒，更具体地说是脑膜炎奈瑟菌(Neisseria meningitidis)、肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)和流感嗜血杆菌(Haemophilus influenzae)。

背景技术

细菌性脑膜炎是全球性的公共卫生问题。脑膜炎是一种严重的感染，会引起脑膜炎症，影响中枢神经系统。细菌性脑膜炎的三种主要病原体是脑膜炎奈瑟菌、流感嗜血杆菌和肺炎链球菌，占细菌性脑膜炎病例的80％以上。除脑膜炎外，这些病原体还可通过侵入血液而引起侵袭性疾病，这可能与脑膜炎有关，也可能无关。在疑似脑膜炎的情况下，通过微生物学或免疫学实验室方法收集并分析血液或CSF样品。病原体的快速检测有助于患者的治疗选择，从而导致更好的预后。将预防性抗生素施用于患者的接触部位，以减少感染的传播和扩散。常规实验室测试可能花费36个小时以上才能由可疑的临床材料进行诊断，并且由于病原体的挑剔性质，可能会释放出大量假阴性结果，从而难以通过常规方法对其进行检测。由于这些原因，这些感染的快速诊断对于确定适当的治疗，从而避免对患者造成严重后果并有助于流行病学监控至关重要。

细菌性脑膜炎的三种主要病原体(脑膜炎奈瑟菌、肺炎链球菌和流感嗜血杆菌)的特征是难以通过常规实验室方法在临床材料中进行培养和检测的细菌。由这些病原体引起的伤害被认为是非常严重的，具有迅速的进化和20％的致死率或后遗症，例如耳聋、脑损伤以及四肢或手足截肢。由于这些原因，对这些病原体的快速诊断对于患者的快速管理非常重要，从而能够更好地预后。已经开发出一些检测这些病原体的分子诊断方法。这些方法基于聚合酶链反应(polymerase chain reaction,PCR)，可以采用常规方法，也可以采用常规PCR(conventional PCR,qPCR)，后者更为敏感，其中Taqman系统最为常用。Taqman系统使用与常规PCR相同的试剂，并添加荧光探针以指示靶标的存在，从而指示阳性诊断。与反应中所用的其他试剂相比，这些探针的成本非常高，并且由于它们是三种不同的靶标，因此必须使用三种不同的探针，从而使系统更昂贵。

因此，在本领域需要允许检测和鉴别上述病原体、快速且经济有效的诊断方法。

本发明人已经基于实时PCR开发了更经济且更快的方法。

因此，本发明包括设计通过实时PCR(qPCR)检测和鉴别细菌性脑膜炎病原体，即脑膜炎奈瑟菌、肺炎链球菌和流感嗜血杆菌的引物。这些引物和探针构成了使用qPCR方法同时检测上述病原体的方案。

该技术的主要优点是：除了对患者的最佳预后之外，还可以通过实时PCR快速鉴定细菌性脑膜炎的病原体。另外，还为细菌性脑膜炎的诊断检查提供了更大的范围，因为它的成本可能低于当前使用的成本。值得一提的是，尽管通过本发明的方法和试剂盒大大降低了成本，但分析的质量仍然保持了高度的灵敏度和特异性。

因此，本文所述的技术的实施可意味着满足了对具有高度特异性和灵敏度的安全诊断结论的方法学的需求。

下面会更详细地介绍本发明。

发明概述

一方面，本发明提供了能够差异性检测细菌性脑膜炎病原体DNA的寡核苷酸。

在具体方面，本发明提供了用于本发明方法的引物。

在具体方面，本发明提供了用于本发明方法的探针。

在具体方面，用于检测脑膜炎奈瑟菌DNA的引物靶向nspA基因。在更具体的方面，用于检测nspA基因的引物如SEQ ID NO:1和2所示。

在具体方面，用于检测流感嗜血杆菌DNA的引物靶向P6基因。在更具体的方面，用于检测P6基因的引物如SEQ ID NO:3和4所示。

在具体方面，用于检测肺炎链球菌DNA的引物靶向ply基因。在更具体的方面，用于检测ply基因的引物如SEQ ID NO:5和6所示。

在一个实施方案中，适合作为探针的寡核苷酸标记有包含供体荧光团对和猝灭剂的可检测标记，优选荧光簇(fluorescent cluster)。

在另一个具体方面，用于检测脑膜炎奈瑟菌的探针具有如SEQ ID NO:7所示的序列。

在另一个具体方面，用于检测流感嗜血杆菌的探针具有如SEQ ID NO:8所示的序列。

在另一个具体方面，用于检测肺炎链球菌的探针具有如SEQ ID NO:9所示的序列。

在另一方面，提供了用于检测和鉴别细菌性脑膜炎病原体的方法，包括以下步骤：

a)使用至少两种引物寡核苷酸产生至少一种扩增子，所述寡核苷酸如上文所定义；

b)并检测至少一种扩增子。

在可选的实施方案中，通过至少一种寡核苷酸探针检测扩增子。

在可选的实施方案中，通过解链温度差(TM)检测扩增子。

在具体实施方案中，脑膜炎奈瑟菌扩增子的TM＝85.8℃。在另一个实施方案中，流感嗜血杆菌扩增子的TM＝80℃。在另一种方式中，肺炎链球菌扩增子的TM＝77℃。

在前述方法的一个实施方案中，所述产生至少一种扩增子的步骤包括通过单重PCR扩增、多重PCR扩增、定性PCR扩增或实时PCR扩增中的至少一种。

在另一个实施方案中，该方法使得可以鉴别脑膜炎奈瑟菌感染、流感嗜血杆菌感染和肺炎链球菌感染。

本发明的另一方面涉及用于诊断和鉴别脑膜炎奈瑟菌感染、流感嗜血杆菌感染和肺炎链球菌感染的试剂盒，包括：a)至少一对适合作为引物的寡核苷酸；和/或b)任选地，至少一种适合作为探针的寡核苷酸；和c)任选地，使用说明。

在一个实施方案中，本发明的试剂盒还包括能够扩增和鉴别细菌性脑膜炎病原体的寡核苷酸引物。在另一个实施方案中，这些细菌病原体选自脑膜炎奈瑟菌、流感嗜血杆菌和肺炎链球菌。

在可选的实施方案中，试剂盒包括探针寡核苷酸，其允许检测使用本发明的寡核苷酸引物由扩增获得的扩增子。

另外，在一个实施方案中，本发明的试剂盒仍包括阴性对照和/或阳性反应对照。

附图简要说明

图1.利用Taqman单重系统与脑膜炎奈瑟菌进行PCR，以确定检测限(LD)。1A：242ng/μL和242pg/μL.1B:2.42pg/μL和242fg/μL。

图2.利用Taqman uniplex系统与流感嗜血杆菌进行PCR，以确定LD。2A：109ng/μL，2B：1.09pg/μL和109fg/μL。

图3.利用Taqman单重系统与肺炎链球菌进行PCR，以确定LD。3A：0.479ng/μL。3B：479fg/μL和200fg/μL。

图4.利用Taqman多重系统与脑膜炎奈瑟菌进行PCR，确定LD为2.42ng/μL、242pg/μL和242fg/μL。

图5.利用Taqman多重系统与流感嗜血杆菌进行PCR，确定LD为1.09ng/μL、1.09pg/μL和200fg/μL。

图6.利用Taqman多重系统与肺炎链球菌进行PCR，确定LD为0.479ng/μL、4.79pg/μL和200fg/μL。

图7.利用单重HRM系统与脑膜炎奈瑟菌进行PCR，确定LD为2.42ng/μL、2.42pg/μL和242fg/μL。

图8.利用单重HRM系统与流感嗜血杆菌进行PCR，确定LD为1.09ng/μL、1.09pg/μL和200fg/μL。

图9.利用单重HRM系统与肺炎链球菌进行PCR，确定LD为0.47ng/μL、479fg/μL和200fg/μL。

图10.利用肺炎链球菌INCQS 00543(BinC)、流感嗜血杆菌INCQS00434(BinB)和脑膜炎奈瑟菌INCQS 00140(BinA)的单重/多重HRM系统进行PCR，显示了这三种靶标的标准解离曲线(TM)。每种病原体的检测分别与77℃、80℃和85.8℃的温度直接相关。

图11.通过Taqman多重系统进行PCR，并从临床材料中检测参照脑膜炎奈瑟菌(INCQS 00140)，表明通过与寡核苷酸(oligos)的特异性和荧光团通道(FAM)波长的相关性检测到病原体。

图12.通过Taqman多重系统进行PCR，并从临床材料中检测参照肺炎链球菌(INCQS00543)，表明通过与寡核苷酸(oligos)的特异性和荧光团通道波长(Cy5)的相关性检测到病原体。

图13.通过HRM多重系统进行PCR，并从临床材料中检测参照肺炎链球菌(INCQS00543)，表明通过与解链温度(TM＝77℃)的相关性检测到病原体。

图14.通过HRM多重系统进行PCR，并从临床材料中检测参照脑膜炎奈瑟菌(INCQS00164)，表明通过与解链温度(TM＝85.8℃)的相关性检测到病原体。

图15.利用HRM多重系统与表1(下文)的阴性对照进行PCR。寡核苷酸显示出对靶微生物的特异性，使用阴性对照时无干扰。

发明详述

除非有不同的定义，否则本文使用的所有技术术语和科学术语与本发明所属领域有经验的技术人员所理解的具有相同的含义。常规分子生物学技术对于有经验的技术人员而言是众所周知的，并且可以在例如Ausubel et al.,eds.Current Protocols inMolecular Biology(最新分子生物学实验方法汇编),John Wiley&Sons,Inc.NY(1987-2008)，包括所用的增补；Sambrook et al.,Molecular Cloning:A Laboratory Manual(实验室手册),2nd edition(第二版),Cold Spring Harbor,N.Y.(1989)。为了有助于解释本文的描述和主张，还提供了术语的定义。

除非另外指出，否则，说明书和权利要求书中使用的所有表示数量、百分比和比例的数字和其他数值，均应理解为在所有情况中均由术语“约”修饰。因此，除非另外指出，否则，说明书和权利要求书中所示的数值参数是可以根据要获得的性质而变化的近似值。

这里描述的本发明涉及用于扩增、检测、区分细菌性脑膜炎病原体，特别是脑膜炎奈瑟菌、流感嗜血杆菌和肺炎链球菌的新的寡核苷酸以及相关方法和试剂盒。具体而言，本发明提供了适合检测和鉴别脑膜炎奈瑟菌、流感嗜血杆菌和肺炎链球菌的寡核苷酸，包括引物和可选的探针。

“寡核苷酸”是指任何短核苷酸聚合物，其中核苷酸可以是核糖核苷酸、脱氧核糖核苷酸、双脱氧核糖核苷酸、简并核苷酸等。这类寡核苷酸优选是单链的。这类寡核苷酸的长度可以变化，并且通常小于150个核苷酸(nt)，优选在10-100nt范围内，更优选在10-60nt范围内，甚至更优选在13-50nt范围内。它们还可以具有化学修饰，例如标记或标签，例如荧光、放射性、生物素化、DIG(地高辛)等。本发明的寡核苷酸可以是正向(有义)的或反向(反义)的。

一方面，本发明的寡核苷酸包括引物和任选的探针。除非另有说明，否则链(strings)以5'至3'方向显示。这类寡核苷酸可以采用各种形式，例如采用在合适的溶剂中期望浓度的溶液/悬浮液形式，干燥形式或冻干形式。本领域技术人员知道适合本发明寡核苷酸的溶剂、浓度和储存条件。特别是，有经验的技术人员知道如何制备这种寡核苷酸作为储备溶液。本发明的寡核苷酸可以具有不同的纯度，这可以由经验丰富的技术人员使用例如HPLC色谱法来评估。

另外，应当记住，尽管针对某些寡核苷酸可能提到了优选的功能，但是显然，给定的寡核苷酸可以具有多种功能，并且可以根据本发明以不同的形式使用。如本领域技术人员所知，在某些情况下，除了适用于杂交程序、检测等之外，引物的序列还可以用作探针，反之亦然。因此，观察到本发明的产物，尤其是寡核苷酸，尤其不限于本文所示的用途，相反，无论本文中指示的用途如何，都必须广义地解释用途。

另外，当将寡核苷酸描述为可用作能够与扩增子结合的探针时，本领域技术人员还应理解，该寡核苷酸的互补序列也可用作与相同扩增子结合的探针。对于描述为用作引物的序列也是如此。另外，同样明显的是，在本发明的意义和范围内，用于多重方案的任何合适引物也可以用于单重方案。在本发明的意义内，这同样适用于用于实时PCR方案的合适引物，其可以用于常规PCR方案中。

术语“杂交”和“环状”可互换使用，并且是指一个核酸与另一核酸的碱基配对相互作用，导致形成双链、三链或其他更复杂的链。在一些实施方案中，主要相互作用是特异性的，例如通过氢键键合的C/G和A/T。

在这方面，本领域技术人员应当理解，本发明的寡核苷酸，即引物和探针，不需要与靶序列的一部分完全互补。引物可以充分互补，以与靶序列杂交并执行引物的固有功能。探针同样如此，即探针可以充分互补，以与靶序列杂交并执行探针的固有功能。因此，在一个实施方案中，引物或探针不需要与靶序列完全互补。在一个实施方案中，引物或探针可以与靶标的一部分杂交或退火以形成双链。以下文献描述了核酸的杂交条件：JosephSambrook et al.,Molecular Cloning,A Laboratory Manual(分子克隆：实验室手册),Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.(2001)和Haymes etal.,Nucleic Acid Hybridization,A Practical Approach(核酸杂交：实用方法),IRLPress,Washington,D.C.(1985)。因此，由于进行退火不需要完全互补，因此，本领域技术人员应当理解，可以对本文所述引物和探针的序列进行一定程度的修饰，而不会失去它们作为脑膜炎奈瑟菌、流感嗜血杆菌和肺炎链球菌的特异性引物和探针的有用性。

关于“引物”的定义，本领域技术人员知道其包括以下任何单链寡核苷酸：该单链寡核苷酸能够在足够严格的条件下退火至互补靶模，并且充当在合适的条件下利用DNA聚合酶延长链来由引物合成延伸产物(扩增子)的起点。这些条件包括在合适的温度条件下和合适的缓冲液中的4种不同类型的脱氧核苷三磷酸和DNA聚合酶或逆转录酶。引物的长度可以根据几个因素而变化，但是引物的典型长度是10-50nt，优选15-30nt，更优选15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30nt。根据本发明，优选每种引物为15-30nt。正向引物和反向引物是分别与通过PCR反应扩增的靶标特定区域的3'端和5'端结合的引物。

在Oligo Architect SIGMA软件(http://www.oligoarchitect.com/)的帮助下，由每种微生物特有的靶基因序列设计了用于实时PCR的Taqman和HRM系统的每种物种的特定寡核苷酸。这些序列是从GenBank(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/)获得的。

优选地，这些引物是但不特别限于包含SEQ ID No:1-6所述序列及其互补序列中任一个的至少10-15连续核苷酸的引物。SEQ ID No:1和2的引物能够扩增脑膜炎奈瑟菌nspA基因的区域；而SEQ ID No:3和4的引物能够扩增流感嗜血杆菌P6基因的区域；而SEQID No:5和6的引物能够扩增肺炎链球菌ply基因的区域。引物也可以由序列SEQ ID No:1-6及其互补序列的任何能够扩增脑膜炎奈瑟菌、流感嗜血杆菌和肺炎链球菌靶基因的片段组成。

在可替代实施方案中，探针用于检测通过PCR获得的扩增子。探针的定义对于本领域技术人员也是已知的，并且包括能够在合适的杂交条件下与互补靶序列杂交的任何寡核苷酸。探针一旦被标记，则其可用于检测某些核苷酸序列的存在。可以以单链DNA、双链DNA、RNA或杂合DNA-RNA的形式制备探针。探针的典型长度是10-60nt，优选15-55nt，更优选20-50nt，更优选30-45nt，甚至更优选10-30nt。因此，根据本发明，探针可以包括或包含来自SEQ ID No:7-9所述序列的至少8-15个连续核苷酸。探针也可以包含序列SEQ ID No:7和9及其互补序列中的任一个或由其组成。

每种探针都标记有不同的荧光团，因此它们可以在多重系统中同时使用。每种荧光团均使用适当的淬灭剂。

可以使用各种探针格式来执行实时PCR，例如荧光标记的探针。具体而言，探针可以是FRET(荧光共振能量转移)类型的，该类型的探针包括但不限于TaqMan

具体而言，关于TaqMan

在本发明优选的实施方案中，选择这类探针的光谱特性，从而使得一种探针不干扰另一种探针。特别是，当将探针用于多重反应时，每种探针应具有其自己的荧光团，该荧光团具有光谱并且与另一种探针显著不同，换而言之，不同探针的吸收光谱/发射光谱基本上是不重叠的。这有利地允许分别检测每种探针，因为各信号在检测期间不会相互干扰。

测量在靶核酸扩增反应期间发射的荧光，以便监测特定扩增产物的积累。荧光信号与产生的特定扩增子的量成比例。在存在脑膜炎奈瑟菌、流感嗜血杆菌和肺炎链球菌靶序列的情况下，荧光会增加。在没有靶序列的情况下，荧光会在整个反应过程中始终保持低水平。

在优选的实施方案中，荧光团选自HEX、Cys-5和FAM。

在优选的实施方案中，淬灭剂选自BHQ-1和3。

另外，在一个实施方案中，为了提供用于确定从待测试生物样品中提取核酸的标准(内部对照)，所述生物样品可包含脑膜炎奈瑟菌、流感嗜血杆菌和肺炎链球菌的靶序列，或为了确定是否存在潜在的反应抑制剂、能够扩增的引物和能够检测的探针，可以使用由人类内源序列扩增产生的扩增子。非限制性实例是使用靶向例如人β-珠蛋白、β-肌动蛋白、RNase和GAPDH的RNA的引物。

同样，为了提供用于靶标扩增的阳性对照和/或为了便于定量待分析的给定生物样品中的目标病原体，可以掺入外部阳性对照。在本发明中,可以使用来自不同血清组和血清型的参照菌株，含有脑膜炎奈瑟菌、流感嗜血杆菌和肺炎链球菌的靶标拷贝的核酸样品，例如，包含待扩增的靶序列的盒或载体。下文的表1说明性地且以非限制性方式列出了本发明人所用的参照血清型和血清组，其中还列出了待检测的参照微生物。

同样可以掺入阴性反应对照。这种对照可以是不含有脑膜炎奈瑟菌、流感嗜血杆菌和肺炎链球菌靶基因的任何拷贝的核酸样品，例如，取自除了脑膜炎奈瑟菌、流感嗜血杆菌和肺炎链球菌以外的参照细菌物种的样品。本发明人说明而非限制性地使用以下作为阴性对照的参照微生物：百日咳奈瑟菌(Neisseria perflva)(ATCC11076)、黏膜炎莫拉氏菌(Moraxella catarralis)(ATCC25238)、无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)(ATCC13813)、化脓链球菌(Streptococcus pyogenes)(ATCC 19615)、肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)(ATCC 13883)、单核细胞增生李斯特氏菌(Listeriamonocytogenes)(ATCC 15313)、不动杆菌(Acinetobacter sp.)(ATCC 14293)或大肠杆菌(Escherichia coli)(ATCC 11775)。

本发明的另一方面是用于同时诊断和区分由脑膜炎奈瑟菌、流感嗜血杆菌和肺炎链球菌引起的感染的试剂盒，其包含至少一组寡核苷酸。“寡核苷酸组”是指包含至少一种寡核苷酸，优选至少两种，例如2-20种寡核苷酸的任何组合。这种组可以例如包含至少一种引物，或至少一对引物。或者，除了至少一种引物或至少一对引物对之外，这种组还可包含至少一种探针。此类寡核苷酸可以保持分开或部分混合或完全混合。

优选，这种试剂盒包含至少一组本发明的专门针对脑膜炎奈瑟菌、流感嗜血杆菌和肺炎链球菌设计的寡核苷酸。此类寡核苷酸可以保持分开或部分混合或完全混合。根据本领域的知识，寡核苷酸可以以干燥形式提供或溶解在合适的溶剂中。例如，合适的溶剂包括TE、超纯水等。

在一个实施方案中，本发明的试剂盒还可以包含适合扩增反应的其他试剂，包括水、无核酸酶的水、无RNase的水、无DNase的水、超纯水、盐(例如镁盐、钾盐)、缓冲液(例如本领域已知的常规PCR缓冲液)、酶，包括热稳定的聚合酶，例如Taq、Vent、Pwo、Pfu、逆转录酶等，核苷酸，例如脱氧核苷酸、双脱氧核苷酸、dNTP、dATP、dTTP、dCTP、dGTP、dUTP，其他试剂，例如添加剂、RNase或DNase抑制剂，以及多核苷酸，例如poliT、polidT，和其他寡核苷酸，作为其他病原体和内部对照的引物和探针，作为对照阳性(例如人β-珠蛋白)，或噬菌体(例如MS2)。可以以浓缩形式提供试剂，供最终用户稀释至适当的浓度。另外，至少部分试剂可以作为预混合物提供。

可以将这类试剂容纳在容器中，出于本发明的目的，所述容器包括但不限于微管、试管、具有不同数量的孔的PCR板、芯片或发生扩增反应并且不与本发明的流体和溶液反应的任何其他合适的惰性介质。另外，容器还可以例如用颜色标记和标识，以避免混淆并为实验室技术人员提供方便的使用。

除此之外，在一个实施方案中，本发明的试剂盒包括其使用说明。这些说明可以在小册子、卡片或类似物上。这些说明可以采用两种形式：详细说明，提供有关试剂盒及其使用的详尽信息，可能还包括文献数据；以及快速指南形式的简单说明，提供使用试剂盒所需的基本信息。

在优选形式中，这种试剂盒是诊断试剂盒，尤其是体外诊断试剂盒。更优选地，这种试剂盒是用于诊断和区分脑膜炎奈瑟菌、流感嗜血杆菌和肺炎链球菌的试剂盒。

在本发明的另一个实施方案中，诊断试剂盒还可以包括用于从生物样品中提取和分离核酸的试剂盒。这种提取试剂盒可以包括裂解缓冲液、洗涤缓冲液和洗脱缓冲液。提取试剂盒还可以配备有用于提取和分离核酸的空容器和吸附柱。

脑膜炎病原体的多核苷酸，更具体地说，脑膜炎奈瑟菌、流感嗜血杆菌和肺炎链球菌的多核苷酸是本发明扩增反应的靶标或靶标源。术语“靶序列”，或简称为“靶标”，是指在PCR反应中用作扩增模板的核酸序列。这些核酸序列可以含有脱氧核糖核苷酸、核糖核苷酸和/或其类似物。该序列可以是基因或基因片段、mRNA、cDNA、分离的总DNA、分离的总RNA等。

更具体地说，本发明的靶序列是由脑膜炎奈瑟菌nspA基因、流感嗜血杆菌P6基因和肺炎链球菌ply基因转录而来的。

在一个实施方案中，靶序列存在于从个体收集的生物材料的样品中。因此，“样品”是指可能含有一些细菌性脑膜炎病原体，特别是脑膜炎奈瑟菌、流感嗜血杆菌或肺炎链球菌中的一种或多种菌株的任何生物物质或材料。样品包括但不限于血液、血浆、血清、液体等。

核酸的提取和纯化方法是本领域众所周知的。从全血中提取核酸的方法的实例教导于例如Casareale et al.(Genome Res.,2:149-153,1992)和美国专利No.5,334,499中。

一旦制备了引物，就可以通过多种方法进行靶核酸扩增，所述方法包括但不限于常规PCR、实时PCR、RT-PCR、巢式PCR、半PCR定量等。优选地，所使用的方法是实时PCR。

“扩增”是指使用引物和聚合酶生成多个靶核酸拷贝的核酸扩增程序。像“PCR”(聚合酶链反应)这种扩增反应对本领域有经验的技术人员而言是已知的，出于本发明的目的，PCR又包括任何基于PCR的方法，包括常规、定性、半定量、实时、逆转录反应(RT-PCR)、单重PCR、多重PCR等。

术语“扩增子”或“PCR产物”可互换使用，是指在扩增程序中合成的核酸(或统称为多个核酸分子)。扩增子通常是但不限于DNA片段。

“逆转录”(RT)是指由RNA分子产生cDNA拷贝的现象。所得的cDNA可用作PCR的模板。

“RT-PCR”是指RNA分子被反转录以产生产物(cDNA)并且随后在PCR反应中扩增cDNA的反应。通常，RT-PCR反应的逆转录和PCR反应均在单个试管中进行。

“定量PCR”(qPCR)是指允许估计给定样品中给定靶序列的初始量的任何基于PCR的方法。

“实时PCR”是指，允许监测反应期间发射的荧光，作为每个PCR循环中PCR产物或扩增子产生的指标的任何基于PCR的方法，与常规PCR方法在所有循环运行结束时进行检测相反。

如本文所用，“多重PCR”是指旨在同时扩增一种以上靶标的任何PCR反应。例如，多重PCR包括双重PCR(两种靶标)、三重PCR(三种靶标)等。多重PCR包括具有多于一对引物的PCR反应，例如两对引物。在这种情况下，可能有四种不同的引物，但也可能有共同引物，例如正向引物和两种不同的反向引物。多重PCR还包括具有一对引物但具有一种以上探针的PCR反应。另外，作为非限制性实例，多重扩增包括由不同基因、单个基因的不同等位基因和/或单个基因的不同片段进行的扩增反应。

“缓冲液”是添加到扩增反应中、包含缓冲剂的组合物，其通过调节扩增反应的pH来改变扩增反应的一种或多种组分的稳定性、活性和/或寿命。本发明的缓冲剂与要使用的聚合酶，即DNA聚合酶的活性相容。缓冲剂是本领域公知的，包括但不限于Tris、Tricin、MOPS(3-(N-吗啉代)丙烷磺酸)和HEPES(4-(2-羟乙基)-1-哌嗪酸-乙磺酸)。

此外，在dBuffer、dCTP、dGTP和dTTP核苷酸各自为约50-500μM时，PCR缓冲液通常可以含有高达约70mM KCl和约1.5mM或更多的MgCl

本发明的缓冲剂还可以含有添加剂。添加剂是添加到组合物中并改变组合物的一种或多种组分的稳定性、活性和/或寿命的化合物。在一些实施方案中，该组合物是扩增组合物。在一些实施方案中，添加剂使污染性酶失活，稳定蛋白质折叠和/或减少聚集。根据本发明，可以添加添加剂来改善引物和/或探针退火的选择性，只要添加剂不干扰DNA聚合酶活性即可。

添加剂的例子包括但不限于甜菜碱、甘油、甲酰胺、KCl、CaCl

本文所用术语“热稳定的”，当应用于酶时，是指在升高的温度(例如，在55℃或更高)下保持其生物学活性，或在重复的加热和冷却循环后保持其生物学活性的酶。对于本发明而言，热稳定核苷酸聚合酶是特别优选的，因为它们消除了在每个PCR循环之前添加酶的需要。

“聚合酶活性”是指催化脱氧核糖核苷酸聚合的酶促活性。通常，酶会在与靶序列成环的引物的3'端开始合成，并向模板链的5'端进行。在某些实施方案中，该酶是热稳定的DNA聚合酶。

热稳定DNA聚合酶的非限制性实例包括但不限于从以下分离的聚合酶：水生栖热菌(Thermus aquaticus)(Taq聚合酶)、嗜热栖热菌(Thermus thermophilus)(Tth聚合酶)、沿海嗜热球菌(Thermococcus coastalis)(Tli或VENT

PCR反应可包含不止一种具有互补特性的热稳定聚合酶，从而可以更有效地扩增靶序列。例如，具有扩增大片段核苷酸的强能力的聚合酶可以与另一种能够校正在靶核酸序列延伸过程中发生的错误的聚合酶互补，从而产生可高以高保真度扩增长靶序列的PCR反应。可以使用野生形式的热稳定聚合酶，或者，可以修饰聚合酶以含有酶的片段或含有提供有益特性以促进PCR反应的突变。在一实施方案中，聚合酶可以是Taq聚合酶。Taq聚合酶的许多具有改善的特性的变体是已知的，包括但不限于AmpliTaq

如上文已经提到的，术语“杂交条件”是指允许引物或探针与目的核苷酸序列成环的条件。这些条件取决于发生杂交的溶液的温度和离子强度。这些是严格条件。如经验丰富的技术人员所理解的，可以改变退火严格性，以便鉴定或检测相同或相关的多核苷酸序列。如经验丰富的技术人员应当理解的，解链温度Tm可以通过本领域已知的公式来计算，这取决于几个参数，例如以核苷酸数量计的引物或探针的长度或缓冲液中存在的成分和条件。为此，参见例如T.Maniatis et al.,Molecular Cloning:A Laboratory Manual(分子克隆：实验室手册),Cold Spring Harbor Laboratory,Cold Spring Harbor,N.Y.,1982和J.Sambrook et al.,Molecular Cloning:A Laboratory Manual(分子克隆：实验室手册),Cold Spring Harbor Laboratory,Cold Spring Harbor,N.Y.,1989)。

退火温度可以在约50℃和65℃之间变化，但是引物经设计可以在约58℃至62℃最佳。设计引物时的其他考虑因素是鸟嘌呤和胞嘧啶的含量。通常，起始子的GC含量可以为30-70％左右，但是可以更低，且可以由经验丰富的技术人员适当调整。与给定靶标互补或部分互补的寡核苷酸的退火可通过改变退火条件以增加或降低严格性来获得，例如通过调节缓冲液的温度或盐浓度。经验丰富的技术人员可以以常规方式进行维持对脑膜炎奈瑟菌、流感嗜血杆菌或肺炎链球菌的特异性的此类修饰。

为了扩增，可以单独使用一对特定类型的引物(例如，脑膜炎奈瑟菌的正向引物和反向引物；流感嗜血杆菌的正向引物和反向引物；或肺炎链球菌的正向引物和反向引物等)。多重扩增可用于扩增脑膜炎奈瑟菌、流感嗜血杆菌或肺炎链球菌靶基因的区域。可以适当地调整引物的终浓度，从而SEQ ID No:1-6所示每种引物的浓度为约10pmol至50pmol(以20μl计)。

经验丰富的技术人员也可以适当地调整探针的最终浓度，从而使其为约50nM至1000nM。对于由SEQ ID No:7-9所示的每种探针，最终浓度更优选为约100nM至约300nM，更优选为150nM至250nM。

在本发明的另一个方面，提供了用于由从生物样品中提取的核酸同时检测是否存在脑膜炎奈瑟菌、流感嗜血杆菌或肺炎链球菌的方法。该方法包括在合适的容器中混合dNTP、DNA聚合酶、缓冲液、本申请所述的至少一种引物和至少一种探针、从生物样品中提取的核酸，并使含有混合物的容器在热循环仪中进行孵育。

在另一方面，本发明提供了用于检测脑膜炎奈瑟菌、流感嗜血杆菌或肺炎链球菌是否存在的方法，包括使用至少一种或一组选自SEQ ID No:1、3和5的正向引物和至少一种或一组选自SEQ ID No:2、4和6的反向引物进行聚合酶链反应。经验丰富的技术人员了解PCR反应条件，尤其是热循环条件，例如温度、持续时间、循环数、加热/冷却速率等。在优选的实施方案中，PCR反应条件包括适合于多重PCR的条件。在另一个优选的实施方案中，所述条件包括适合于实时定量多重PCR的条件。在另一个可选的实施方案中，所述方法包括以下步骤：在探针存在的情况下，将样品置于适合将此类探针退火至扩增子的条件下。

在另一个优选的实施方案中，该方法包括以下步骤：实时检测至少一种扩增子，从而评估样品中是否存在脑膜炎奈瑟菌、流感嗜血杆菌或肺炎链球菌。这通过扩增子的荧光强度或TM测量来实现，但非限于此。

荧光和TM测量程序是本领域已知的。

在优选的实施方案中，在PCR板上，包括具有24个孔、48个孔、96个孔和384个孔的PCR板，进行至少一个步骤，优选几个步骤，最优选大多数步骤。PCR板的使用有利地确保了可以在反应过程中平行处理样品。另外，它允许大规模实施该方法，从而节省时间。

在另一优选形式中，在热循环仪中进行至少一个步骤，优选几个步骤，更优选大多数步骤。除了其他的以外，以下是一些用于实时PCR的具有HRM系统热循环仪：Qiagen的RotorGene Q 5-plex HRM、Thermo Fisher的7500Fast Real Time PCR System和QuantStudio 6、INNOVA MOLARRAY的BIO-MA-6000、COLE-PARMER的PCRmax Eco 48。

通过以下实施例举例说明本发明，这些实施例仅旨在举例说明实施本发明的无数方式之一，但并不限制其范围。经验丰富的技术人员根据实施例提出的各种修改或建议均包括在权利要求书的精神和范围内。特别是，尽管它们适合于通过多重和/或实时方案进行检测，但是本发明的方法、寡核苷酸、寡核苷酸组和试剂盒当然也适合于定性的单重、双重、三重和类似方案，使用Taqman系统的常规PCR和实时PCR及其组合。

实施例

实施例1.参照微生物

用作参照的菌株是FIOCRUZ的国家卫生质量控制研究所(National Institutefor Quality Control in Health-INCQS)健康监测参照微生物保藏中心(Collection ofReference Microorganisms in Health Surveillance-CMRVS)的一部分。使用来自不同血清组和血清型的参照菌株，以保证系统在检测所研究的三种物种时的特异性。其他物种用作阴性对照。表1列出了所用参照微生物的完整列表。

表1.所用参照微生物的完整列表

实施例2.引物和探针的设计

在Oligo Architect SIGMA软件(http://www.oligoarchitect.com/)的帮助下，由每种微生物特有的靶基因序列设计了用于实时PCR的Taqman和HRM系统的每种物种的特异性寡核苷酸。这些序列从GenBank(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/)获得的。表2显示了用于PCR扩增反应的引物和探针，其中在荧光团(报告子)和淬灭剂探针上带有各自的标记。它们是在Carlos Chagas Institute-FOCOCRUZ,Curitiba,Brazil合成的。每种探针都标记有不同的荧光团，使得它们可以在多重系统中同时使用。对于每种荧光团，使用适当的淬灭剂。

表2.本发明所用的引物和探针

根据本发明，正向引物分别由SEQ ID NO:1、3和5表示，而反向引物分别由SEQ IDNO:2、4和6表示。

本发明可选实施方案所用的探针分别由SEQ ID NO:7、8和9表示。

确定每种靶标的最佳引物浓度和探针浓度，以优化从对照细菌菌株提取的DNA和临床样品(CSF、血液、血清)的反应。

实施例4.Taqman系统的参照细菌的检测限(LD)

在此针对Taqman系统所述的测定中使用的所有试剂(MasterMix)、引物和探针均由Molecular Biology Institute of Paraná(IBMP-PR)提供。在另一方面，可以使用可用于Taqman系统的任何商业Mastermix。

为了确定用作对照的微生物的DNA检测限，在提取和测定DNA浓度后，将其连续稀释，并确定每种微生物的各自LD和循环阈值(CT)(表3)。

CT是通过绘制阈值线生成的值。这些值指示扩增在哪个运行循环开始。高于阈值线的所有样本均视为阳性的。根据DNA浓度将CT制成表。表3显示了使用单重Taqman系统进行的实时PCR的CT结果，以达到检测限。确定了每种靶标的特定LD和CT。

表3.使用每种靶标基因组DNA的稀释液，Taqman单重系统的LD。

粗体值表示LD及其各自的CT值。

图1、2和3显示了从运行到LD所得到的所有DNA的定量分析图(QuantificationAnalysis graph)，带有检测到的浓度及其各自的CT，如表4所示。

为了确定Taqman系统同时(多重)检测靶标的灵敏度，在单个实验中使用了相同的引物和探针。所使用的策略是在一次运行中一次包括三种引物/探针系统和来自每种靶标的一种DNA，因为直到有一种以上的在此分析的病原体的共同感染时才有记录。这些图形对应于图4、5和6。多重系统的使用节省了试剂和时间。表4以粗体显示了多重检测的靶标检测限。

表4.使用每种靶标基因组DNA的稀释液，Taqman多重系统的LD。

粗体值表示LD值及其各自的CT。

实施例5.HRM系统通过单重和多重PCR的检测限

对于HRM检测系统，使用Qiagen MasterMix“Type-It HRM”Cat，其具有下述制剂：

-HotStar

-Type-it HRM PCR Buffer(带有Eva

-Q-

-dNTP混合物(dATP、dCTP、dGTP、dTTP)

引物购自ThermoFisher。

表5列出了HRM系统对靶标的检测。图7、8和9显示了HRM的定量分析以及每种靶标的曲线和CT。图1显示了每种靶标的标准解离曲线或解链(TM)曲线(单重)。注意，根据每种微生物的解离曲线峰和不同的TM进行每种靶标的检测，对于肺炎链球菌TM为77℃，对于流感嗜血杆菌TM为80℃，对于脑膜炎奈瑟菌TM为85.8℃，该检测可以明确地用于这些病原体的诊断。图11和12显示了使用与Taqman多重系统相同的策略的HRM多重系统，其中在单个运行中一次使用了三种引物/探针系统和来自每种靶标的一种DNA。当将参照微生物的基因组DNA用作靶标时，由HRM单重系统和多重系统进行的测试显示出相同的TM结果。

表5.使用每种靶标基因组DNA的稀释液，Taqman单重系统的LD。

粗体值表示LD值及其各自的CT。

实施例6.通过Taqman系统用临床材料进行测试

通过Taqman系统，利用参照微生物的基因组DNA分别(单重)和同时(多重)测定LD后，用疑似患有所研究的三种病原体之一引起的细菌性脑膜炎的患者的临床材料开始进行实验。然后将结果与常规PCR进行比较。

公立医院的LACEN-RJ接受的人临床材料(血液、血清和CSF)是从疑似患有此处所列三种病原体之一引起的侵袭性疾病的患者收集的。该材料的一部分被送到我们的实验室(LMR/INCQS)，以共同努力通过LACEN的常规实验室检测在阴性诊断的情况下检测病原体。

单重和多重实验显示了相似的结果。Taqman多重的第一个实验在反应中表现出了良好的特异性。图11显示了使用脑膜炎奈瑟菌的参照DNA和临床材料一式两份进行的多重测试，表明它涉及所述病原体。其他样品为阴性的，因为未获得扩增曲线，并且全部以线性进行反应。在图12中，可以观察到多重测试，其图形类似于前一个图形。在该测试中，使用了肺炎链球菌的参照DNA和临床材料，表明存在微生物的DNA。

实施例7.通过HRM系统用临床材料进行测试

与Taqman系统进行的测试并行，根据先前的实施例，即，使用HRM多重系统进行的实验，实验包括用于确定病原体的临床材料。由于解链温度(TM)的差异，可以检测病原体。脑膜炎奈瑟菌呈现的TM＝85.8℃，流感嗜血杆菌呈现的TM＝80℃，肺炎链球菌呈现的TM＝77℃。单重和多重测试都显示TM在相同温度下。图13显示了肺炎链球菌的检测，图14显示了脑膜炎奈瑟菌的检测。

实施例8.不同PCR系统之间的比较

Taqman和HRM系统获得的结果表明，这两种方法在细菌性脑膜炎的诊断中都是有效的，因为它们表现出相似的结果，其中，如表6所示，对HRM系统而言，灵敏度更高。与常规PCR相比，基于实时PCR的方法(Taqman和HRM)所表现出的灵敏度更高。HRM系统由于不使用标记的探针，因此，对于快速检测此处分析的三种病原体更具成本效益。用表1所列和图15所示阴性对照进行的测试证明了引物和探针对每种靶标微生物的特异性。为了读取结果，常规PCR需要琼脂糖凝胶电泳以可视化DNA条带的额外步骤，这在qPCR中是没有必要的，因为结果被绘制在图形中，并且可以用与热循环仪连接的特定计算机软件进行实时查看。通过Taqman、HRM和常规PCR系统，全部以同时(多重)的形式，表6比较了不同临床样品的脑膜炎奈瑟菌、流感嗜血杆菌和肺炎链球菌的DNA检测。对于Taqman和HRM PCR系统，使用相同的引物(Taqman，HRM)和探针(Taqman)。对于常规PCR，使用不同的引物，但以相同的基因作为靶标，针对的区域包含由Taqman和HRM系统中所用的引物扩增的相同区域。

表6.常规PCR和实时PCR(Taqman和HRM)对病原体检测的比较。(Nm＝脑膜炎奈瑟菌，Hi＝流感嗜血杆菌，Sp＝肺炎链球菌，NEG＝阴性结果)。

通过确定上面显示的检测限(LD)评估测试的灵敏度。还针对通过常规PCR预分析的一组对Nm、Sp和阴性对照而言结果均为阳性的临床样品，测试Taqman和HRM这两种检测系统。结果显示在表6中，并且表明Taqman和HRM系统通常比常规PCR更为灵敏，确认了在常规PCR确定的阳性样品和一些阴性样品中存在病原体DNA。该组中所用的所有临床样品均是从临床怀疑患有病原体之一引起的侵袭性疾病的患者获得的，因此，通过Taqman和HRM系统检测到被常规PCR视为阴性的样品的细菌DNA，表明两个新的诊断系统更灵敏。在仅一组样品中，Taqman系统未检测到通过常规PCR和HRM检测到的病原体DNA。针对一组参照细菌菌株评估了Taqman和HRM系统的特异性，这些参照细菌菌株的特征是具有侵袭性，该侵袭性已经在具有类似于所研究的三种病原体引起的症状的患者中检测到(表1)。这两个系统仅鉴定了此处研究的物种的菌株(脑膜炎奈瑟菌、流感嗜血杆菌和肺炎链球菌)。

显然，上述实施例仅出于说明性目的而提出，并且其对本领域技术人员显而易见的修改和变化视为包括在本发明的所附权利要求书所限定的范围内。

序列表

<110> 奥斯瓦道·克鲁兹基金会

<120> 寡核苷酸，寡核苷酸组，脑膜炎奈瑟菌、肺炎链球菌和流感嗜血杆菌同时检测方法和试剂盒

<130> R000532

<160> 9

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

caagctcttt aggttctg 18

<210> 2

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

gctgtaaagt ttgaaatcg 19

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

gaaggtaata ctgatgaacg 20

<210> 4

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

tcaccgtaag atactgtg 18

<210> 5

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

ccaagtctat ctcaagttg 19

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

ctaccttgac tccttttatc 20

<210> 7

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

atctccgcag gctaccgcat 20

<210> 8

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

caccagaata caacatcgca ttaggac 27

<210> 9

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

agcagcctct acttcatcac tcttac 26