含有变异猪伪狂犬病病毒gD蛋白基因的重组腺相关病毒转移载体、病毒及其制备和应用

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，更具体地，涉及一种含有变异猪伪狂犬病病毒gD蛋白基因的重组腺相关病毒转移载体、重组腺相关病毒、其制备和应用。

背景技术

伪狂犬病(Pseudorabies，PR)由伪狂犬病毒(Pseudorabies virus，PRV)引起，家畜(猪、牛、羊)和野生动物发病后以发热、瘙痒和脑炎为主要症状，由于临床症状与狂犬病相似，因此又被称为伪狂犬病。PRV在自然界中有广泛的宿主，猪是主要的天然宿主和储存宿主。PRV可以感染不同日龄的猪，引起不同的临床症状，尤以妊娠母猪和哺乳仔猪感染后引起的损害最严重。PRV导致妊娠母猪繁殖障碍，哺乳仔猪出现神经症状进而出现高死亡率，15日龄仔猪感染后死亡率高达100％；成年猪耐过感染后成为潜伏感染猪，潜伏感染猪终身带毒并周期性排毒，成为PRV流行的传染原，增加了本病根除的难度。伪狂犬病给世界养猪业造成了巨大的经济损失。目前疫苗仍是防控猪伪狂犬病最经济有效的手段。

自2011年以来，在我国的华北和东北地区暴发了变异伪狂犬病病毒引起的伪狂犬病，并迅速蔓延到其他地区，许多免疫过经典毒株疫苗Bartha-K61疫苗的猪场也难以幸免(An et al 2013)。

变异毒株相对于经典毒株，gD蛋白在280和281位置出现2个氨基酸(R和P)的插入(Wang et al 2014)。有学者将变异毒株的gD基因与经典毒株的gD基因进行遗传进化分析，相比于经典毒株，变异毒株的gB蛋白相对于经典毒株，gB蛋白的氨基酸出现了1.1％的变异，核苷酸出现了0.4％的变异(Wang et al 2015)，其表现为gB蛋白少两个氨基酸残基，gB蛋白在第94-77位置上出现3个aa(S，P和G)的缺失，在第94位置存在1个氨基酸(G)插入和22个点突变(Wang et al 2014)。gB蛋白的变异可能是经典毒株不能对变异毒株提供保护的原因。变异毒株的gD基因发生了14个碱基的突变和45个氨基酸的变异(Song et al 2017)，gD蛋白的变异可能是经典毒株不能对变异毒株提供保护的原因。Ye等根据PRV的gC基因遗传进化结果，对PRV进行基因分型，表明当前欧美毒株与我国流行的PRV毒株属于不同的分支，亲缘性较远(Ye et al 2016)。2011年以来中国新分离毒株全部属于基因II型，包括欧美毒株中经典的Bartha-K61毒株、Buchares毒株等都是属于基因I型毒株，这也为经典疫苗对当前流行毒株的保护不佳提供了参考依据(He et al 2018)。

变异PRV与经典毒株在致病力、毒力因子表达和传播效率等方面存在很大的差异。经典疫苗对变异毒株保护力不佳，需要以临床分离的变异伪狂犬病病毒为基因样本，研发更有效的疫苗来防控伪狂犬病，然而用全病毒来制备灭活疫苗和基因缺失弱毒疫苗操作繁琐，成本高，因此DNA疫苗、亚单位疫苗及活载体疫苗等将是研制PRV疫苗的主要方向。

本实验对照采用的商品疫苗是科前生物公司商品化的猪伪狂犬病灭活疫苗，该商品疫苗在PR的防控中起着重要作用，但由于该灭活疫苗的灭活过程中会出现主要抗原决定簇的丢失，导致免疫效力不佳，需要较大的接种剂量并且需要多次免疫，才能起到较好的免疫效果，并且灭活疫苗的成分复杂，常有发生过敏反应。

发明内容

针对现有技术的缺陷或改进需求，本发明的目的在于提供一种含有变异猪伪狂犬病毒gD蛋白基因的重组腺相关病毒转移载体，以实现变异猪伪狂犬病毒gD蛋白在动物机体内的高效、稳定地、长期地的分泌表达。

本发明的目的还在于提供一种能够表达猪伪狂犬病毒gD蛋白的重组腺相关病毒，以及该重组腺相关病毒在制备变异猪伪狂犬病疫苗中的应用。该病毒制备的变异猪伪狂犬病疫苗不仅免疫性高效，而且安全性高、特异性强。

为实现上述目的，本发明提供了一种含有变异流行猪伪狂犬病毒gD蛋白基因的重组腺相关病毒转移载体，该载体为重组腺相关病毒载体，其为将变异流行猪伪狂犬病毒的gD蛋白基因插入到重组腺相关病毒转移载体两端ITR序列之间的编码区而得到的重组腺相关病毒转移载体。

优选地，所述gD蛋白基因具有：

(1)由SEQ ID No.1所示的核苷酸序列；或

(2)与序列SEQ ID No.1限定的核苷酸序列同源性在95％以内的gD蛋白基因序列；而且突变区域位于起始密码子后820-837位。

优选地，所述重组腺相关病毒转移载体为血清型AAV2/9型的重组腺相关病毒转移载体。

优选地，所述重组腺相关病毒转移载体中含有CMV启动子序列。

按照本发明的另一个方面，提供了一种所述的重组腺相关病毒转移载体的构建方法，包括如下步骤：

(1)以流行变异毒株的基因组DNA为模板，PCR扩增得到gD蛋白基因片段；

(2)将重组腺相关病毒载体进行双酶切，用胶回收试剂盒回收目标载体片段后定量，记为线性载体片段；

(3)将所述gD蛋白基因片段和线性载体片段通过DNA聚合酶进行重组反应，构建出所述含有变异猪伪狂犬病病毒gD蛋白基因的重组腺相关病毒转移载体。

按照本发明的另一个方面，提供了一种能够表达猪伪狂犬病毒gD蛋白的重组腺相关病毒，其为将变异猪伪狂犬病病毒gD蛋白抗原基因插入到腺相关病毒载体中形成的重组腺相关病毒。

优选地，所述腺相关病毒载体的血清型为AAV2/9型。

优选地，该病毒基因组中包含CMV启动子序列。

按照本发明的另一个方面，提供了一种所述的重组腺相关病毒在制备变异猪伪狂犬病病毒疫苗中的应用。

优选地，所述重组腺相关病毒被制备为肌肉注射剂。

按照本发明的另一个方面，提供了一种制备所述的重组腺相关病毒的方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)将所述的重组腺相关病毒转移载体与骨架质粒共转染入宿主细胞；

(2)培养步骤(1)所述宿主细胞；

(3)收获从步骤(2)所述细胞中包装的重组腺相关病毒；

(4)对步骤(3)中的重组腺相关病毒进行纯化。

优选地，步骤(2)所述宿主细胞为HEK-293T。

通过本发明所构思的以上技术方案，与现有技术相比，能够取得下列有益效果：

(1)本发明提供的含有变异猪伪狂犬病病毒gD蛋白基因的重组腺相关病毒转移载体，其为重组腺相关病毒载体，rAAV载体具有安全性、有效性、特异性等多种优势。

(2)本发明制备的基因工程毒株表达猪伪狂犬病毒gD基因片段为流行变异猪伪狂犬病毒毒株的免疫原性片段，对多株流行变异猪伪狂犬病毒毒株具有良好的免疫保护性。使用右下肢胫前肌内一次注射，就可以持续高水平诱导机体产生特异性的中和抗体和细胞免疫。

(3)传统的疫苗免疫后，需要多次加强免疫，相较于传统疫苗，本发明提供的活载体病毒疫苗只需要一次免疫就可以获得长效的保护力，不需要加强免疫，操作更方便。因此，用本发明的基因工程毒株制成的疫苗具有广阔的市场应用前景。

(4)现有的PRV商品疫苗主要为灭活疫苗和减毒疫苗。灭活疫苗中灭活的病毒不具有复制增殖的能力，不会潜伏感染和散毒，更具安全性的问题，但灭活疫苗的灭活过程中会出现主要抗原决定簇的丢失，导致免疫效力不佳，一般需要较大的接种剂量，或多次免疫，才能起到较好的免疫效果，并且灭活疫苗的成分复杂，常有发生过敏反应。减毒疫苗虽然有着良好的免疫原性，并且费用较低，在PRV的防控中起着重要作用，但由于其可能出现毒力返强、变异等问题，减毒疫苗会建立潜伏感染，存在长期的散毒风险，进行猪伪狂犬病净化的国家已禁止使用减毒疫苗。然而，本发明提供的用于制备流行变异猪伪狂犬病毒疫苗属于活载体病毒疫苗，其基因组中不含有任何AAV的蛋白编码DNA，该病毒载体不能自主复制，符合疫苗生物安全性要求，并且适用于进行猪伪狂犬病净化。

(5)本发明优选实施例中制备的基因工程毒株表达猪伪狂犬病毒gD基因片段为猪伪狂犬病毒毒株PRV/JXFC/2015的免疫原性片段，交叉中和试验显示该毒株诱导机体产生特异性的中和抗体和细胞免疫，对PRV/JXFC/2015毒株和野毒株CH-18株均具有良好的免疫保护性。病毒的单次注射，免疫后第2，12，20，24，28周采血。针对PRV/JXFC/2015野毒株的病毒血清中和抗体检测，阴性对照PBS组的所有时间点的混合血清样品的中和效价为1:0，阳性对照商品疫苗组混合血清样品的中和效价分别是1:16、1:16、1:16、1:16、1:16、1:22.38；rAAV2/9-PRV-gD-P2A-Mcherry组的混合血清样品的中和效价分别是1:5、1:64、1:32、1:44、1:39.8、1:56.2。对28周的混合血清样品的做的针对CH-18野毒株的交叉中和检测，rAAV2/9-PRV-gD-P2A-Mcherry组≥1:256、阳性对照商品疫苗组为1:42、阴性对照PBS组为1:0。以腺相关病毒为载体的猪伪狂犬病重组疫苗AAV2/9-PRV-gD组具有显著高于商品疫苗组针对流行变异毒株PRV/JXFC/2015的中和抗体水平，同时AAV2/9-PRV-gD组对野毒株CH-18株也具有显著高于商品疫苗的中和水平。

附图说明

图1为本发明使用的载体质粒PT-1540和pAAV-PRV-gD-Mcherry构建示意图；

图2为本发明使用的载体质粒PT-1786和pAAV-PRV-gB-P2A-EGFP物理图谱；

图3为本发明用PRV gB基因引物从基因组模板上扩增的PCR扩增图，图中M为

图4为本发明用PRV gD基因引物从基因组模板上扩增的PCR扩增图，图中M为

图5为本发明使用的载体质粒PT-1786/PT-1540的双酶切胶图,图中M：

图6为本发明中构建的质粒pAAV-PRV-gB-P2A-EGFP的菌落鉴定图，图中M：

图7为本发明中构建的质粒pAAV-PRV-gD-P2A-Mcherry的菌落鉴定图，图中M为

图8为本发明中构建的重组质粒pAAV-PRV-gD-P2A-Mcherry和pAAV-PRV-gB-P2A-EGFP的酶切鉴定图；图中M：

图9为本发明中rAAV2/9-PRV-gB-P2A-EGFP和rAAV2/9-PRV-gD-P2A-Mcherry病毒的细胞转染包装72h形态及荧光照片；图中A1：转染包装rAAV2/9-PRV-gD-P2A-Mcherry的细胞3D红色荧光；A2：转染包装rAAV2/9-PRV-gD-P2A-Mcherry的细胞3D正常白光照片；B1：转染包装rAAV2/9-PRV-gB-P2A-EGFP的细胞3D绿色荧光；B1：转染包装rAAV2/9-PRV-gB-P2A-EGFP的细胞3D正常白光照片；C:对照正常HEK-293T白光照片；

图10为本发明中rAAV2/9-PRV-gB-P2A-EGFP和rAAV2/9-PRV-gD-P2A-Mcherry的SDS PAGE银染胶图，图中M：Marker CAS-26616；1：rAAV2/9-PRV-gD-P2A-Mcherry；2：rAAV2/9-PRV-gB-P2A-EGFP；3：2.5E+12vg/mL胶图滴度的对照病毒；

图11为本发明中rAAV2/9-PRV-gB-P2A-EGFP和rAAV2/9-PRV-gD-P2A-Mcherry病毒电镜照片，A：rAAV2/9-PRV-gB-P2A-EGFP；B：rAAV2/9-PRV-gD-P2A-Mcherry；

图12为本发明中rAAV2/9-PRV-gB-P2A-EGFP和rAAV2/9-PRV-gD-P2A-Mcherry病毒的Western blotting检测结果；

图13为本发明中rAAV2/9-PRV-gB-P2A-EGFP和rAAV2/9-PRV-gD-P2A-Mcherry病毒的小鼠免疫试验的中和抗体水平检测结果；

图14为本发明中rAAV2/9-PRV-gB-P2A-EGFP和rAAV2/9-PRV-gD-P2A-Mcherry病毒的小鼠免疫试验的细胞因子IL-4检测结果；

图15为本发明中rAAV2/9-PRV-gB-P2A-EGFP和rAAV2/9-PRV-gD-P2A-Mcherry病毒的小鼠免疫试验的细胞因子IFN-γ检测结果。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

本发明提供的一种含有变异流行猪伪狂犬病毒的gD蛋白基因的重组腺相关病毒转移载体，该载体为重组腺相关病毒载体，其为将变异流行猪伪狂犬病毒的gD蛋白基因插入到重组腺相关病毒转移载体的两端ITR序列之间的编码区，得到的重组腺相关病毒转移载体。

变异流行猪伪狂犬病毒的gD蛋白也即gD(US6)蛋白，属于I型糖蛋白，相对分子质量约为44KD。gD蛋白是PRV穿透细胞所必须的受体结合蛋白，通过识别细胞表面的HVEM受体，实现病毒蛋白复合体与细胞的结合。gD蛋白是PRV的免疫原性蛋白，能刺激机体产生特异性的中和抗体和细胞免疫应答。

本发明提供的一种重组腺相关病毒转移载体可适用于各种变异流行猪伪狂犬病毒，包括基因型为I型、II型，也可以为包含同源性在95％以内的gD序列的变异流行猪伪狂犬病毒；而且gD序列突变区域位于起始密码子后820-837位的变异流行猪伪狂犬病毒毒株。本发明实施例中以变异流行猪伪狂犬病毒(PRV/JXFC/2015)为例，提供了一种含有变异流行猪伪狂犬病毒(PRV/JXFC/2015)的gD蛋白基因的重组腺相关病毒转移载体，其将变异流行猪伪狂犬病毒(PRV/JXFC/2015)的gD蛋白基因插入到重组腺相关病毒转移载体的两端ITR序列之间的编码区，得到重组腺相关病毒转移载体。变异流行猪伪狂犬病毒(PRV/JXFC/2015)的gD(US6)基因的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。

不难理解，除了变异流行猪伪狂犬病毒(PRV/JXFC/2015)以外，本发明提供的重组腺相关病毒转移载体也包括将其他变异流行猪伪狂犬病毒的gD蛋白基因插入到重组腺相关病毒转移载体的两端ITR序列之间的编码区，得到的重组腺相关病毒转移载体。不同变异流行猪伪狂犬病毒毒株的gD蛋白基因序列稍有不同。有学者将21株猪伪狂犬病毒的gD基因核苷酸序列同源性进行分析，发现21株gD基因开放阅读框(ORF)的核苷酸的长度在1197nt～1215nt之间，核苷酸的同源性在97.3％～100％之间，证明各个毒株之间存在着很高的同源性，证明该基因具有很强的保守性。保守基因一般在病毒的生长周期中承担着重要的功能，一旦出现大的变异该物种就有被淘汰的危险。不同的毒株gD基因的高同源性(≥95％)也就是说明该基因在病毒生长周期中承担的重要功能。毒株间核酸差异最大的地方是启始密码子后820-837位存在一个C(A)GGCCC重复高变去，正是由于这一重复高变区的碱基缺失或插入使得PRV-gD的ORF在1197nt～1215nt间的变化，其它核酸的变异多为一些点突变，但由于该区段增减的碱基数为3的倍数所以并没有影响到该重复高变区后面的序列的阅读。(许雁峰et al 2006)。因此，本发明所述的变异流行猪伪狂犬病毒的gD蛋白基因序列除了可以为SEQ ID No.1所示的序列，也可以为同源性在95％以内的gD序列；而且突变区域位于起始密码子后820-837位。

作为对照组，本发明实施例中制备了含有变异流行猪伪狂犬病毒(PRV/JXFC/2015)的gB蛋白基因的重组腺相关病毒转移载体，其为将变异流行猪伪狂犬病毒的gB蛋白基因插入到重组腺相关病毒转移载体的两端ITR序列之间的编码区，得到的重组腺相关病毒转移载体。其gB(UL27)蛋白是PRV的囊膜蛋白，属于I型糖蛋白，分子量约为100KD。gB是PRV的重要免疫原蛋白，是能刺激机体产生中和抗体的主要糖蛋白。所述gB(UL27)基因的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。

本发明所用的临床流行PRV变异毒株，PRV/JXFC/2015变异毒株，是由本实验室从2015年于江西省某暴发伪狂犬病的猪场中分离、鉴定并保存的。本实验室近年来已分离到的45株PRV变异毒株，并进行了一系列筛选疫苗候选毒株的试验。PRV/JXFC/2015的病毒滴度稳定在10

2011年以来中国新分离毒株全部属于基因II型，与欧美毒株处于不同的分支，PRV/JXFC/2015也属于基因II型，因此将其基因组样本进行新的伪狂犬病基因工程载体活疫苗研究，构建表达PRV的gD和gB蛋白的rAAV，作为PRV疫苗株的研究，预期将对我国多株流行变异猪伪狂犬病毒毒株具有良好的免疫保护性。

rAAV的不致病性，使其安全性很高，并且免疫原性很低，供其生存的宿主广泛。rAAV是能装载外源基因的病毒载体，具有在动物体内长期并且稳定表达的特点，被应用在疫苗、干扰筛选、神经标记、动物疾病模型的造模、基因治疗等领域。rAAV最主要的缺点是受到自身病毒粒子大小的限制，其携带外源基因的能力一般小于4.7kb，否则会造成包装滴度大幅降低，病毒包装的空壳率增高，甚至是无法正常包装。

一些实施例中，本发明所述重组腺相关病毒转移载体的构建方法，包括如下步骤：

(1)以流行变异毒株的基因组DNA为模板，PCR扩增得到gD蛋白基因片段；

(2)将重组腺相关病毒载体进行双酶切，用胶回收试剂盒回收目标载体片段后定量，记为线性载体片段；

(3)将所述gD蛋白基因片段和线性载体片段通过DNA聚合酶进行重组反应，构建出所述含有变异猪伪狂犬病病毒gD蛋白基因的重组腺相关病毒转移载体。

一些实施例中，含有变异猪伪狂犬病病毒gD蛋白基因的重组腺相关病毒转移载体的构建具体包括如下步骤：

(1)以流行变异毒株PRV/JXFC/2015的基因组DNA为模板，PCR扩增得到gD蛋白基因片段；

(2)将重组腺相关病毒载体PT-1540(rAAV-CMV-SOD1-P2A-mcherry-WPRE-hGHpoly)进行Sal I、Spe I双酶切，酶切出两条带(468bp/6001bp)，用胶回收试剂盒回收6001bp后定量，记为线性载体片段Vector2；

(3)将所述gD蛋白基因片段和线性载体片段Vector2通过DNA聚合酶进行重组反应，构建出所述含有变异猪伪狂犬病病毒gD蛋白基因的重组腺相关病毒转移载体。

实施例中构建含有变异猪伪狂犬病病毒gB蛋白基因的重组腺相关病毒转移载体的构建具体包括如下步骤：

(1)以流行变异毒株PRV/JXFC/2015的基因组DNA为模板，PCR扩增得到gB蛋白基因片段；

(2)将重组腺相关病毒载体PT-1786(rAAV-CMV(584bp)-beta arrestin2-Flag-P2A-EGFP-WPREs)进行Xba I、Sal I双酶切，(1305bp/4742bp)，用胶回收试剂盒回收4742bp后定量，记为线性载体片段Vector1；

(3)将所述gB蛋白基因片段和线性载体片段Vector1通过DNA聚合酶进行重组反应，构建出所述含有变异猪伪狂犬病病毒gB蛋白基因的重组腺相关病毒转移载体。

本发明还提供了一种能够表达猪伪狂犬病毒gD蛋白的重组腺相关病毒，其为将变异猪伪狂犬病病毒gD蛋白抗原基因插入到腺相关病毒载体中形成的重组腺相关病毒。同样地，这里gD蛋白抗原基因除了为上述SEQ ID No.1以外，也可以为同源性在95％以内的gD序列；而且突变区域位于起始密码子后820-837位。

本发明所述重组腺相关病毒优选被制备为肌肉注射剂。优选实施例中，所述腺相关病毒载体的血清型为AAV2/9型，AAV2/9型腺相关病毒对肌肉组织亲和性较好。

CMV启动子是广谱启动子，优选实施例中该病毒基因组中包含CMV启动子序列。

本发明还提供了一种制备所述的重组腺相关病毒的方法，包括以下步骤：

(1)将所述的重组腺相关病毒转移载体与骨架质粒共转染大量宿主细胞；

(2)培养步骤(1)所述宿主细胞；

(3)收获从步骤(2)所述细胞中包装的重组腺相关病毒；

(4)对步骤(3)中的重组腺相关病毒进行纯化。

一些实施例中，步骤(1)所述骨架质粒为腺相关病毒的pRC-AAV2/9质粒和病毒包装辅助质粒pHelper质粒。其中pRC-AAV2/9质粒中包含编码AAV病毒Cap蛋白的基因和编码AAV病毒Rep蛋白的基因；所述pHelper质粒中包含编码腺病毒E2a蛋白的基因、编码腺病毒E4orf6蛋白的基因、编码腺病毒VA RNA蛋白的基因。将含有变异猪伪狂犬病毒gB和gD蛋白基因的重组腺相关病毒转移载体分别与腺相关病毒的pAAV2/9质粒和病毒包装辅助质粒pHelper质粒共转染包装得到能够表达猪伪狂犬病毒gB蛋白的重组腺相关病毒，以及能够表达猪伪狂犬病毒gD蛋白的重组腺相关病毒。

本发明制备表达猪伪狂犬病毒gD蛋白的重组腺相关病毒，可以采用现有技术rAAV常规的制备方法，包括质粒转染(本发明实施例采取的制备方法)、质粒转染结合辅助病毒(如腺病毒Adv或单纯疱疹病毒HSV)感染，或利用辅助病毒感染哺乳动物包装细胞系等，也可以构建包含rAAV2/9-PRV-gB、rAAV2/9-PRV-gD的oneBac杆状病毒表达系统杆粒，并将该杆粒转染sf9细胞，拯救收获杆状病毒表达载体(baculovirus expression vector，BEV)，通过BEV扩增的方式包装rAAV。

本发明还提供了所述的重组腺相关病毒在制备变异猪伪狂犬病疫苗中的应用，其为一种载体活病毒疫苗。

PRV的gD(US6)蛋白属于I型糖蛋白，由400或402个氨基酸组成，相对分子质量为44KD。gD蛋白是PRV重要的免疫原性蛋白，可以诱导机体产生特异性的中和抗体和细胞免疫(Zhang et al 2019)。因此，gD蛋白是PRV亚单位疫苗主要的候选抗原(van Rooij et al2010)。gB(UL27)蛋白是PRV的囊膜蛋白，属于I型糖蛋白，分子量约为100KD。gB是PRV的重要免疫原蛋白，是能刺激机体产生中和抗体的主要糖蛋白(van Rooij et al 2010)。PRV的gB和gD蛋白的编码基因是开发PRV的重组载体疫苗的目标基因。

本发明通过从传统的PRV免疫原性蛋白种类中进行筛选，比较不同抗原蛋白基因插入腺相关病毒载体质粒中制备得到的重组腺相关病毒株，在进一步制备变异猪伪狂犬病疫苗时的免疫效果，发现采用gD蛋白基因作为抗原基因，配合腺相关病毒载体，制备得到的工程疫苗对变异猪伪狂犬病毒毒株具有显著优于商品疫苗的免疫保护性。比如，本发明一些实施例中制备的基因工程毒株表达猪伪狂犬病毒gD基因片段为猪伪狂犬病毒毒株PRV/JXFC/2015的免疫原性片段，对猪伪狂犬病毒毒株PRV/JXFC/2015具有良好的免疫保护性。使用右下肢胫前肌内一次注射，就可以持续高水平诱导机体产生特异性的中和抗体和细胞免疫。相较于传统疫苗，只需要一次免疫就可以获得长效的保护力，不需要加强免疫，操作更方便。因此，用本发明的基因工程毒株制成的疫苗具有广阔的市场应用前景。

采用本发明构建的重组腺相关病毒对多株不同的流行变异毒株进行中和抗体检测，发现该病毒对同属于基因II型的CH-18野毒株，也具有良好的免疫效果，预期作为疫苗尤其是对同属于基因II型分支流行变异毒株均具有良好的免疫效果。

以下为具体实施例：

实施例1

1、引物设计和PCR扩增

以猪伪狂犬病毒野毒株PRV/JXFC/2015的基因组为PCR模板，利用分析软件Oligo6.0设计引物，扩增gB和gD基因，扩增片段大小分别为约为2718bp和约为1203bp。引物序列如下：

表1：PCR引物

a：两端分别设计Sal I、Spe I酶切位点。引物序列左端部分为同源臂序列，斜体部分为Sal I、Spe I酶切位点序列，酶切位点后面是转录增强kozak序列，划线部分为gD靶基因引物序列。

b：两端分别设计XbaI、Sal I酶切位点。引物序列左端部分为同源臂序列，斜体部分为XbaI、Sal I酶切位点序列，酶切位点后面是转录增强kozak序列，划线部分为gB靶基因引物序列。

2、猪伪狂犬病毒gB和gD基因的克隆

以猪伪狂犬病毒野毒株PRV/JXFC/2015的基因组为PCR模板，用表3-1中所列的引物gB-F/R、gD-F/R扩增gB和gD基因，PCR扩增反应体系H

表2各引物PCR扩增的反应循环

扩增的PCR产物经0.8％的琼脂糖凝胶电泳分析，用Omega Gel Extraction Kit胶回收试剂盒分别回收gB和gD基因片段。

3、pAAV-PRV-gB-P2A-EGFP和pAAV-PRV-gD-P2A-Mcherry的构建及鉴定

用Xba I、Sal I(购自武汉擎科生物技术有限公司)双酶切腺相关病毒商品载体基因环状质粒PT-1786(rAAV-CMV(584bp)-beta arrestin2-Flag-P2A-EGFP-WPREs)，酶切出两条带(1305bp/4742bp)，4742bp为线性载体片段，用Omega Gel Extraction Kit胶回收试剂盒回收4742bp后定量46ng/μL，记为Vector1。用Sal I和Spe I(购自武汉擎科生物技术有限公司)双酶切腺相关病毒商品载体基因环状质粒PT-1540(rAAV-CMV-SOD1-P2A-mcherry-WPRE-hGH poly)，扩增的PCR产物经0.8％的琼脂糖凝胶电泳分析，扩增的两个片段大小分别是468bp和6001bp，468bp为酶切下来的SOD1基因，6001bp为线性载体片段。用Omega GelExtraction Kit胶回收试剂盒回收线性AAV载体片段(6001bp)后定量43ng/μL，记为Vector2。

载体质粒PT-1540和pAAV-PRV-gD-Mcherry构建示意图如图1所示；载体质粒PT-1786和pAAV-PRV-gB-P2A-EGFP物理图谱如图2所示。图3为用PRV gB基因引物从基因组模板上扩增的PCR扩增图，图中M为

将gB基因片段和线性AAV载体质粒片段Vector1进行重组反应，重组反应体系见表3。将gD基因片段和线性AAV载体质粒片段Vector2进行重组反应，重组反应体系见表4。重组后，转化感受态细菌，筛出阳性单菌落，用引物进行菌落PCR鉴定。

表3 PCR回收产物gB基因和线性的载体重组反应体系

表4 PCR回收产物gD基因和线性的载体重组反应体系

图6为本实施例中构建的质粒pAAV-PRV-gB-P2A-EGFP的菌落鉴定图，图中M：

图8为本实施例中构建的重组质粒pAAV-PRV-gD-P2A-Mcherry和pAAV-PRV-gB-P2A-EGFP的酶切鉴定图；图中M：

4、表达PRV的gD和gB蛋白的rAAV的制备

重组腺相关病毒株rAAV2/9-PRV-gB-P2A-EGFP和rAAV2/9-PRV-gD-P2A-Mcherry的病毒包装制备，参考转染试剂说明书，采用三质粒共转染贴壁HEK293T，三质粒共转染体系见表5，转染3d收获重组腺相关病毒原液。

表5：三质粒共转染体系(10cm皿)

5、表达PRV的gD和gB蛋白的rAAV的纯化

将收获收集的转染72h后的细胞混液加入1/10体积的氯仿37℃剧烈振摇1h，加NaCl至终浓度1mol/L振摇溶解后，4℃，12000rpm/min离心15min，取出上层水相，弃氯仿和沉淀，加PEG8000至终浓度10％(W/V)，振摇溶解后，冰浴放置1h。11000rpm/min离心15min，弃去上清，用1/10原细胞混液体积的PBS吹打洗脱合并重悬，加入核酸酶至终浓度1μg/mL，室温消化30min，加入等体积的氯仿抽提，4℃，12000rpm/min离心5min，取出水相，即完成纯化至中间产品。采用碘克沙醇离心-透析-超滤收获-除菌过滤进行腺相关病毒rAAV2/9-PRV-gB-P2A-EGFP和rAAV2/9-PRV-gD-P2A-Mcherry进一步纯化成成品。

6、表达PRV的gD和gB蛋白的rAAV的SDS-PAGE银染

重组腺相关病毒通常都包含3种衣壳蛋白，将病毒颗粒经煮沸后导致病毒外壳蛋白解聚，经SDS-PAGE电泳后应形成3个特征性条带，VP1、VP2、VP3，其中大小分别为87KDa、72KDa、62KDa，含量比例1:1:10。具体操作为：取样品10μL，加入2.5μL 5x SDS-loadingbuffer，100℃煮沸10min，短暂离心收集样品。配制10％聚丙烯胺凝胶，AAV样品10μL/孔，上样量约为1E+11vg，蛋白质marker 0.5μL/孔，120V电泳1h。使用商品化银染试剂盒，按照说明书的操作进行银染脱色，在凝胶成像系统中进行拍照，对照片进行灰度分析比对确定病毒胶图滴度。成品重组腺相关病毒的SDS-PAGE银染胶图结果见图10，样品泳道中的三条蛋白条带大小显示腺相关病毒外壳VP1、VP2、VP3一致且含量比例约为1：1：10，与腺相关病毒蛋白外壳组成比例相当。样品泳道中除了VP1、VP2、VP3三条明显的蛋白条带外，无明显其他杂蛋白。

7、表达PRV的gD和gB蛋白的rAAV的ITR引物定量检测

重组腺相关病毒都通常包含血清2型腺相关病毒的ITR序列(腺相关病毒基因组部分序列)，我们通过SYBR Green qPCR法，设计特异性结合血清2型重组腺相关病毒的ITR序列的引物，检测ITR序列的拷贝数，从而定量重组腺相关病毒基因组的拷贝数，确定重组腺相关病毒的QPCR滴度。取纯化后的成品病毒，按常规方法提取基因组，通过QPCR检测ITR基因，测定原液和成品病毒的QPCR滴度。具体操作为：将原样稀释100倍后，用核酸酶和蛋白酶K处理，再稀释300倍即为待测样品。将线性化标准品质粒稀释至1.0E+08copies/μL。10μL的标准品质粒加入90μL稀释液，梯度稀释，获得一系列的浓度梯度的标准品包括：1.0E+08copies/μL，1.0E+07copies/μL，1.0E+06copies/μL，1.0E+05copies/μL，1.0E+04copies/μL，1.0E+03copies/μL，即为制备的标准品(STD)。按样品处理及标准品制备方法，处理制备进行SYBY Green qPCR检测的样品，每孔反应体系10μL，标准品质粒和样品均为2μL/孔。ITR扩增引物序列：

正向引物ITR:5'-GGAACCCCTAGTGATGGAGTT-3'

反向引物ITR:5'-CGGCCTCAGTGAGCGA-3'

表6：SYBY Green qPCR检测反应条件

表7：SYBY Green qPCR检测反应条件

8、gD和gB蛋白在重组腺相关病毒中表达的鉴定

将成品腺相关病毒株rAAV2/9-PRV-gB-P2A-EGFP和rAAV2/9-PRV-gD-P2A-Mcherry分别感染PK-15细胞，5％二氧化碳37℃培养3天收取细胞，对收集的PK-15细胞进行处理，离心取上清做Western blotting鉴定，分别鉴定gB和gD蛋白是否表达。用gB和gD蛋白的单抗作为一抗，商品化的羊抗鼠HRP-IgG作为二抗，经化学显色分别看到100KD和44KD的特异性gB和gD蛋白条带，在蛋白水平证明重组腺相关病毒株rAAV2/9-PRV-gB-P2A-EGFP和rAAV2/9-PRV-gD-P2A-Mcherry分别感染PK-15细胞后，分别实现了gB和gD蛋白在PK-15细胞中的表达。重组腺相关病毒株rAAV2/9-PRV-gB-P2A-EGFP和rAAV2/9-PRV-gD-P2A-Mcherry的Western blotting鉴定结果见图12。PRV gB的表达较低，PRV gD表达较高。

9、表达PRV的gD和gB蛋白的rAAV的电镜观察

病毒样品铜片吸附及ATP酶染色操作：滴度在10

10、表达PRV的gD和gB蛋白的rAAV对C57小鼠的免疫试验

用rAAV2/9-PRV-gB-P2A-EGFP、rAAV2/9-PRV-gD-P2A-Mcherry这两种重组腺相关病毒载体的PRV疫苗株，通过小鼠右下肢胫前肌内注射进行免疫，试验组每只小鼠的免疫剂量为5×10

表8小鼠免疫原性试验设计

11、小鼠血清中和抗体测定

在进行一次免疫后，采集各个时间点的血清，测定各组各个时间点的混合血清样品的中和抗体水平。小鼠血清中和抗体实验的结果表明：针对PRV/JXFC/2015野毒株的病毒血清中和抗体检测，阴性对照PBS组以及rAAV2/9-PRV-gB-P2A-EGFP组的所有时间点的混合血清样品的中和效价为1:0，其中rAAV2/9-PRV-gB-P2A-EGFP和rAAV2/9-PRV-gD-P2A-Mcherry相同剂量混合注射组的混合血清样品的中和效价分别是1:8、1:19.95、1:22.9、1:5.6、1:5.01、1:31.6；阳性对照商品疫苗组的混合血清样品的中和效价分别是1:16、1:16、1:16、1:16、1:16、1:22.38；rAAV2/9-PRV-gD-P2A-Mcherry组的混合血清样品的中和效价分别是1:5、1:64、1:32、1:44、1:39.8、1:56.2。对28周的混合血清样品做的针对CH-18野毒株的交叉中和检测，rAAV2/9-PRV-gB-P2A-EGFP组为1:0、rAAV2/9-PRV-gD-P2A-Mcherry组≥1:256、rAAV2/9-PRV-gB-P2A-EGFP和rAAV2/9-PRV-gD-P2A-Mcherry组为1:89.125、阳性对照商品疫苗组为1:42、阴性对照PBS组为1:0。以腺相关病毒为载体的猪伪狂犬病重组疫苗AAV2/9-PRV-gD组具有显著高于商品疫苗组针对流行变异毒株PRV/JXFC/2015的中和抗体水平，同时AAV2/9-PRV-gD组对野毒株CH-18株也具有显著高于商品疫苗的中和水平。

表9中和抗体测定结果(PRV/JXFC/2015野毒株)

表10交叉中和抗体测定结果(28周血清样品、PRV/JXFC/2015野毒株、CH-18野毒株)

12、免疫小鼠血清IFN-γ和IL-4分泌量测定

免疫伪狂犬病活疫苗后，不仅可以激发体液免疫，还可以诱发很高的细胞免疫水平。Th1细胞(I型辅助T细胞)为CD4阳性细胞，主要分泌IL-2、IFN-γ、TNF-β等细胞因子，可以通过测定IFN-γ含量反映出Th1的细胞因子水平；Th2细胞(II型辅助T细胞)主要分泌IL-4、IL-5及IL-13等细胞因子，对IL-4含量测定可反映出Th2(II型辅助T细胞)的诱发的细胞因子水平。测定各组各个时间点的小鼠混合血清样品中IFN-γ、IL-4细胞因子的含量测定结果见表11和表12以及图14和图15。可以看出，腺相关病毒为载体的猪伪狂犬病重组疫苗株rAAV2/9-PRV-gD-P2A--P2A-Mcherry免疫小鼠后，小鼠体内最高产生1973.65pg/mL的IFN-γ水平和161.01pg/mL的IL-4水平，商品疫苗IFN-γ水平最高为1959pg/mL，IL-4水平最高为103.89pg/mL。细胞因子测定实验结果表明rAAV2/9-PRV-gD-P2A-Mcherry组产生出了比商品疫苗组更高的免疫细胞因子表达水平。测定小鼠血清中IFN-γ、IL-4的含量，小鼠体内最高产生1973pg/mL的IFN-γ水平和161.01pg/mL的IL-4水平，说明腺相关病毒为载体的猪伪狂犬病重组疫苗株AAV2/9-PRV-gD可以激发小鼠体内的细胞免疫应答。

表11：免疫小鼠血清IFN-γ分泌量测定

表12：免疫小鼠血清IL-4分泌量测定

实施例中制备rAAV2/9-PRV-gB-P2A-EGFP(rAAV-CMV(584bp)-gB-P2A-EGFP-WPREs)，考虑到gB为2718bp，为避免超出4.7kb限制，采用的截短CMV启动子(584bp)，从Western blotting鉴定的结果显示，截短启动子的启动效果较弱，也是rAAV2/9-PRV-gB-P2A-EGFP组小鼠试验无效的原因之一，并且其整体携带外源基因长为3828bp，携带外源基因过长，病毒包装的空壳率会增高，rAAV2/9-PRV-gB-P2A-EGFP-Z20200103实心率6.34％，也是rAAV2/9-PRV-gB-P2A-EGFP组小鼠实验无效的原因之一。rAAV2/9-PRV-gD-P2A-Mcherry(rAAV-CMV-gD-P2A-Mcherry-WPRE-hGH poly)，采用的全长CMV启动子，整体携带外源基因长为3375bp，属于合适的正常包装范围，rAAV2/9-PRV-gD-P2A-Mcherry-Z20200103实心率59.78％，大部分病毒能正常行使目的基因稳定表达的功能。

rAAV2/9-PRV-gB-P2A-EGFP和rAAV2/9-PRV-gD-P2A-Mcherry相同剂量混合组(gB+gD组)产生同比商品疫苗组中和抗体更低的中和抗体水平，并比同剂量单独接种rAAV2/9-PRV-gD-P2A-Mcherry更低的免疫效果，其原因是rAAV2/9-PRV-gB-P2A-EGFP中大量的空壳病毒，刺激小鼠体内产生大量抗血清型为AAV2/9的rAAV中和抗体，该中和抗体中和掉部分rAAV2/9-PRV-gD-P2A-Mcherry，降低了同剂量rAAV2/9-PRV-gD-P2A-Mcherry的免疫效果。总的来讲，采用重组腺相关病毒载体制备表达猪伪狂犬病毒变异毒株抗原基因的重组腺相关病毒，受限于rAAV装载的限制，合适的抗原基因为猪伪狂犬病毒变异毒株gD蛋白基因。

本领域的技术人员容易理解，以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<120> 含有变异猪伪狂犬病病毒gD蛋白基因的重组腺相关病毒转移载体、病毒及其制备和应用

<141> 2020-11-05

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1203

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 1

ctgctcgcag cgctattggc ggcgctggtc gcccggacga cgctcggcgc ggacgtggac 60

gccgtgcccg cgccgacctt ccccccgccc gcgtacccgt acaccgagtc gtggcagctg 120

acgctgacga cggtcccctc gcccttcgtc ggccccgcgg acgtctacca cacgcgcccg 180

ctggaggacc cgtgcggggt ggtggcgctg atctccgacc cgcaggtgga ccggctgctg 240

aacgaggcgg tggcccaccg gcggcccacg taccgcgccc acgtggcctg gtaccgcatc 300

gcggacgggt gcgcgcacct gctgtacttt atcgagtacg ccgactgcga ccccaggcag 360

atctttgggc gctgccggcg ccgcaccacg ccgatgtggt ggaccccgtc cgcggactac 420

atgttcccca cggaggacga gctggggctg ctcatggtgg cccccgggcg gttcaacgag 480

ggccagtacc ggcgcctggt gtccgtcgac ggcgtgaaca tcctcaccga cttcatggtg 540

gcgctccccg aggggcaaga gtgcccgttc gcccgcgtgg accagcaccg cacgtacaag 600

ttcggcgcgt gctggagcga cgacagcttc aagcggggcg tggacgtgat gcgattcctg 660

acgccgttct accagcagcc cccgcaccgg gaggtggtga actactggta ccgcaagaac 720

ggccggacgc tcccgcgggc ctacgccgcc gccacgccgt acgccatcga ccccgcgcgg 780

ccctcggcgg gctcgccgag gcccaggccc cggccccggc cccggccccg gccgaagccc 840

gagcccaccc cggcgacgcc cgcgcccccc ggccgcctgc ccgagccggc gacgcgggac 900

cacgccgccg ggggccgccc cacgccgcga cccccgaggc ccgagacgcc gcaccgcccc 960

ttcgccccgc cggccgtcgt gcccagcggg tggccgcagc ccgcggagcc gttcccgccc 1020

cggaccaccg ccgcgccggg cgtctcgcgc caccgctcgg tgatcgtcgg cacgggcacc 1080

gcgatgggcg cgctcctggt gggcgtgtgc gtctacatct tcttcagcct gaggggggcg 1140

aaggggtatc gcctcctggg cggtcccgcg gacgccgacg agctaaaagc gcagcccggt 1200

ccg 1203

<210> 2

<211> 2718

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 2

atgcccgctg gtggcggtct ttggcgcggg ccccgcgggc atcggcccgg gcaccacggc 60

ggtgctggcc tcggacgtct ttggcctgct ccacaccacg ctgcagctgc gcggggcgcc 120

gtcgcgctag cgctgctgct gctggcgctc gccgcgaccc cgacgtgcgg cgcggcggcc 180

gtgacgcggg ccgcctcggc ctcgcccgcg cccgggacgg gcgccacccc agacggcttc 240

tccacggagg agtccctcga ggagatcgac ggggccgtct cccccggccc ctcggacgcc 300

cccgacggcg agtacggcga cctggacgcg cgcacggccg tgcgcgcggc cgcgaccgag 360

cgggaccgct tctacgtctg cccgccgccg tccggctcca cggtggtgcg cctggagccc 420

gagcaggcct gccccgagta ctcgcagggg cgcaacttca cggaggggat cgccgtgctc 480

ttcaaggaga acatcgcccc gcacaagttc aaggcccaca tctactacaa gaacgtcatc 540

gtcacgaccg tgtggtccgg gagcacgtac gcggccatca cgaaccgctt cacggaccgc 600

gtgcccgtcc ccgtgcagga gatcacggac gtgatcgacc gccgcggcaa gtgcgtctcc 660

aaggccgagt acgtgcgcaa caaccacaag gtgaccgcct tcgaccgcga cgagaacccc 720

gtcgaggtgg acctgcgccc ctcgcgcctg aacgcgctcg gcacccgcgg ctggcacacc 780

accaacgaca cctacaccaa gatcggcgcc gcgggcttct accacacggg cacctccgtc 840

aactgcatcg tcgaggaggt ggaggcgcgc tccgtgtacc cctacgactc cttcgccctg 900

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ctggactcgc gcctccgcgc ctccgagagc gtgacgcgca actttctgcg cacgccgcac 1080

ttcacggtgg cctgggactg ggcccccaag acgcggcgcg tgtgcagcct ggccaagtgg 1140

cgcgaggccg aggagatgat ccgcgacgag acgcgcggcg ggtccttccg cttcacgtcg 1200

cgggccctgg gcgcctcctt cgtcagcgac gtcacgcagc tcgacctgca gcgcgtgcac 1260

ctgggcgact gcgtcctccg cgaggcctcg gaggccatcg acgccatcta ccggcggcgc 1320

tacaacaaca cgcacgtgct ggccggcgac aggcccgagg tgtacctcgc ccgcgggggc 1380

ttcgtggtgg ccttccgccc gctgatctcg aacgagctgg cgcagctgta cgcgcgcgag 1440

ctcgagcgcc tcggcctcgc cggcgtcgtg ggccccgcgt cccccgcggc cgcccgtcgg 1500

gcccggcgct cccccggccc ggcggggacg cccgagccgc cggccgtcaa cggcacgggg 1560

cacctgcgca tcaccacggg ctcggccgag tttgcgcgcc tgcagttcac ctacgaccac 1620

atccaggcgc acgtgaacga catgctgagc cgcatcgcgg ccgcctggtg cgagctgcat 1680

aacaaggacc gcaccctgtg gggcgagatg tcgcgcctga accccagcgc cgtggccacg 1740

gccgcgctgg gccagcgcgt ctcggcgcgc atgctcggcg acgtgatggc catctcgcgg 1800

tgcgtggagg tgcgcggcgg cgtgtacgtg cagaactcca tgcgcgtgcc cggcgagcgc 1860

ggcacgtgct acagccgccc gctggtgacc ttcgagcaca acggcacggg cgtgatcgag 1920

ggccagctcg gcgacgacaa cgagctcctc atctcgcgcg acctcatcga gccctgcacc 1980

ggcaaccacc ggcgctactt taagctgggc ggcgggtacg tgtactacga ggactacagc 2040

tacgtgcgca tggtggaggt gcccgagacg atcagcacgc gggtgaccct gaacctgacg 2100

ctgctcgagg accgcgagtt cctgcccctc gaggtgtaca cgcgcgagga gctcgccgac 2160

acgggcctcc tggactacag cgagatccag cgccgcaacc agccgcacac gctcaagttc 2220

tacgacattg accgcgtggt caaggtggac cacaacgtgg tgctgctgcg cggcatcgcc 2280

aacttcttcc agggcctcgg cgacgtgggc gccgccgtcg gcaaggtggt cctgggcgcc 2340

acgggggccg tgatctcggc cgtcggcggc atggtgtcct tcctgtccaa ccccttcggg 2400

gcgctcgcca tcgggctgct ggtgctggcc ggcctggtcg cggccttcct ggcctaccgg 2460

cacatctcgc gcctgcgccg caaccccatg aaggccctgt accccgtcac gacgaaggcg 2520

ctcaaggagg acggcgtcga agaggacgac gtggacgagg ccaagctgga ccaggcccgg 2580

gacatgatcc ggtacatgtc catcgtgtcg gccctcgagc agcaggagca caaggcgcgc 2640

aagaagaaca gcgggcccgc gctgctggcc agccgcgtcg gggtgatggc cacgcgccgc 2700

cggcactacc agcgcctc 2718