人腹膜间皮细胞

摘要： 目的探讨绿茶提取物表没食子儿茶素没食子酸酯(epigallocatechin gallate, EGCG)对腹膜透析(peritoneal dialysis,PD)患者腹膜纤维化的防治作用及其机制。方法培养人腹膜间皮细胞(human peritoneal mesothelial cells, HPMCs),分别以0、12.5、25、50、100μmol/L的EGCG对HPMCs进行预处理后,采用晚期糖基化终末产物(advanced glycation end products, AGEs)诱导建立上皮-间充质转化(epithelial-mesenchymal transition, EMT)模型,将未做任何处理的细胞作为对照组。采用MTT法分析EGCG对HPMCs增殖的影响;划痕实验法分析EGCG对HPMCs迁移的影响;蛋白质免疫印迹法检测HPMCs上皮细胞分子标志蛋白(Snail、E-cadherin、CK、ZO-1)和间质细胞分子标志蛋白(α-SMA、FSP1)表达水平;上皮跨膜细胞电阻仪检测EGCG对HPMCs跨细胞电阻(transcellular resistance, TER)的影响。结果与对照组比较,EMT模型组的细胞活力明显增加,Snail、E-cadherin、CK和ZO-1蛋白表达水平降低,α-SMA和FSP1蛋白表达水平升高,TER值增加(P<0.05);EGCG可以剂量依赖性地减少HPMCs细胞活力,抑制HPMCs细胞迁移,增加Snail、E-cadherin、CK和ZO-1蛋白表达水平,减少α-SMA和FSP1蛋白表达水平,降低TER值(P<0.05)。结论 EGCG可有效抑制HPMCs增殖和迁移,并通过上调上皮细胞分子标志蛋白表达,下调间质细胞分子标志蛋白表达,增加HPMCs通透性,抑制HPMCs的EMT,延缓腹膜纤维化,具有临床应用价值。

摘要： 目的观察转化生长因子(TGF)-β1对人腹膜间皮细胞(HPMCs)肾素(前体)受体(P)RR和V-ATP酶的mRNA和蛋白表达影响。方法取健康成年人大网膜进行原代培养。用5 ng/ml TGF-β1刺激第三代培养细胞,采用免疫组织化学染色、Western印迹、酶联免疫吸附试验(ELISA)及RT-PCR等方法,分别观察肾素(前体)受体和V-ATP酶的mRNA和蛋白表达。结果(P)RR和V-ATPase mRNA表达水平随TGF-β1浓度增加和孵育时间的延长而上调,且均显著高于Con组(均P<0.05)。TGF-β1组(4.23±0.98)、TGF-β1+si-N组(3.42±1.05)、TGF-β1+si-(P)RR组(2.48±0.56)组V-ATPase mRNA水平均显著高于Con组(1.00±0.00,P<0.05),且TGF-β1+si-(P)RR组V-ATPase mRNA水平显著低于TGF-β1+si-N组(P<0.05)。结论TGF-β1在致腹膜纤维化过程中诱导了HPMCs内(P)RR和V-ATPase的转录与蛋白表达,(P)RR介导了TGF-β1引起的V-ATPase表达升高,调节(P)RR和V-ATPase产生可用作防治腹膜纤维化的新型治疗策略。

摘要： 目的 关于黄芪甲苷(AS-Ⅳ)能否调控PMCs铁死亡的研究报道少见。文章探究AS-Ⅳ对高糖腹透液(PDS)诱导人腹膜间皮细胞(HMrSV5)铁死亡的干预作用及可能机制。方法 (1)采用4.25%PDS构建PD小鼠模型,予以不同剂量的AS-Ⅳ干预(0.5与1 mg/kg),分组为对照组,PD模型组,低、高剂量干预组。免疫荧光检测腹膜组织GPX4的表达。(2)体外培养HMrSV5细胞,CCK-8检测PDS及AS-IV对HMrSV5细胞活性的影响,根据检测结果确定后续实验的PDS浓度及AS-Ⅳ剂量范围。(3)采用3%PDS构建HMrSV5细胞损伤模型,予以不同剂量AS-Ⅳ干预(50、100及200μmol/L),分组为:空白组,模型组,低、中、高剂量AS-Ⅳ干预组,FerroOrange荧光探针检测Fe^(2+)水平;DCFH-DA荧光探针检测活性氧水平;相应的试剂盒检测GSH和MDA含量;Western blot和RT-PCR分别检测P53、SLC7A11、GPX4和ACSL4等铁死亡相关蛋白及mRNA的表达。结果 与对照组相比,高剂量AS-Ⅳ部分上调PD小鼠模型腹膜组织GPX4的表达;模型组GSH含量[(15.82±1.00)μmol/g]较空白组[(32.63±1.44)μmol/g]减少(P<0.01),MDA含量[(3.87±0.21)nmol/mg]较空白组[(1.48±0.09)nmol/mg]增加(P<0.01),Fe^(2+)、活性氧、P53及ACSL4的表达较空白组上调(P<0.01),GPX4与SLC7A11的表达较空白组下调(P<0.01);与模型组相比,中、高剂量AS-Ⅳ干预组GSH含量[(25.23±2.02、30.03±1.21)μmol/g]增加(P<0.01),MDA含量[(2.92±0.25、1.89±0.15)nmol/mg]减少(P<0.01),Fe^(2+)、活性氧、P53及ACSL4表达下调(P<0.01),GPX4和SLC7A11的表达上调(P<0.01),mRNA的水平与蛋白表达一致。结论 PDS诱导的HMrSV5细胞损伤模型中存在铁死亡,且AS-Ⅳ能通过抑制细胞铁死亡,发挥保护细胞的作用,其机制可能与AS-Ⅳ降低细胞内Fe^(2+)含量、抑制活性氧生成、提高xCT与GPX4活性有关。

摘要： 目的 研究苦参碱对成纤维细胞生长因子2(FGF-2)在人腹膜间皮细胞(HPMCs)上皮间充质转分化(EMT)中的调控作用.方法 将HPMCs分为三组(对照组、TGF-β1刺激组及0.8 mg/mL苦参碱+TGF-β1处理组);TGF-β1刺激组用含5 ng/mL TGF-β1的完全培养基,处理组用含0.8 mg/mL苦参碱和5 ng/mL TGF-β1的完全培养基,对照组用等量完全培养基.干预处理48 h后,采用转录组测序分析各组HPMCs细胞FGF-2的mRNA表达情况,最后采用蛋白免疫印迹和实时荧光定量PCR分别检测各组HPMCs细胞FGF-2蛋白和mRNA的表达情况.结果 5 ng/mL TGF-β1刺激HPMCs细胞,发现其能上调FGF-2的蛋白和mRNA的表达水平(其中蛋白上调2.00倍,mRNA上调6.18倍),而苦参碱干预后能显著下调TGF-β1刺激后FGF-2的蛋白和mRNA的表达水平(其中蛋白下调1.77倍,mRNA下调4.30倍).结论 苦参碱通过对成纤维细胞生长因子2发挥抑制作用,进而阻止成纤维细胞在腹膜聚集,最终防止腹膜纤维化的发生.

摘要： 目的 观察甲泼尼龙(MP)对高糖腹膜透析液(PDS)诱导人腹膜间皮细胞(HMPCs)纤维化相关细胞因子表达的影响.方法 体外培养HPMCs,随机分为空白组(10％FBS培养液)、模型组(4.25％PDS和10％FBS培养液)和MP低、中、高剂量组(含MP浓度为0.1、0.2、0.4μg/mL的4.25％PDS和10％FBS培养液).采用CCK-8法检测细胞存活率;MTT法检测各组细胞增殖活性;流式细胞仪检测细胞内ROS水平;RT-PCR法检测IL-6、α-SMA、HA的mRNA表达;Western blotting法检测核转录因子(NF-κB)、转化生长因子β1(TGF-β1)、结缔组织生长因子(CTGF)、血管内皮生长因子(VEGF)、α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)、透明质酸(HA)、Smads蛋白表达.结果 MP浓度在0.032～0.256μg/mL时,HPMCs存活率升高(P<0.05);MP对HPMCs的半抑制率(IC50)为0.842μg/mL.与空白组相比,模型组增殖活性减弱(P<0.05),ROS、IL-6、NF-κB、TGF-β1、CTGF、VEGF、α-SMA、HA、p-Smad2/3、Smad7的表达增强(P均<0.05);与模型组相比,ROS在MP中、高剂量组的表达减少(P均<0.05),IL-6、NF-κB、TGF-β1、CTGF、VEGF、α-SMA、HA、p-Smad2/3、Smad7在MP三个剂量组表达下调(P均<0.05).结论 MP通过减少高糖PDS诱导HPMCs纤维化相关细胞因子的表达,发挥抗PF的作用.

摘要： 目的 探索Kruppel样因子4(KLF-4)与E-钙黏素(E-cadherin)在人腹膜间皮细胞(HPMCs)中的关系,以及二者在高糖腹膜透析液诱导的腹膜纤维化动物模型中的表达及作用.方法 在HPMCs中共转染KLF-4及E-cadherin启动子区域结合位点或其突变体质粒,利用试剂盒检测各结合位点及其匹配的突变体的荧光素酶活性,判断KLF-4是否可与E-cadherin启动子区域结合位点相结合;采用染色质免疫共沉淀实验(CHIP)检测KLF-4是否可与E-cadherin启动子区域结合位点相结合;采用Real-time PCR及Western blotting检测b、d、f、g结合位点及其匹配突变体E-cadherin的表达.将30只SD大鼠随机均分为盐水组、腹膜透析液组及实验组,每组10只.盐水组腹腔内注射0.9％NaCl溶液,腹膜透析液组腹腔内注射4.25％高糖腹膜透析液,实验组腹腔内注射4.25％高糖腹膜透析液并经尾静脉注射含有超声微泡的KLF-4质粒混悬液.采用HE染色观察3组大鼠腹膜组织的厚度,Masson染色观察3组大鼠腹膜组织中胶原纤维的沉积情况,免疫组织化学染色观察3组大鼠腹膜组织中KLF-4、E-cadherin、α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)及纤维连接蛋白(FN)的表达水平.结果 启动子荧光素酶报告基因及CHIP检测结果显示,KLF-4可以与HPMCs中E-cadherin启动子区域的结合位点相结合.Real-time PCR及Western blotting结果显示,KLF-4可正向调控E-cadherin的表达.HE染色结果显示,腹膜透析液组大鼠的腹膜组织厚度[(105.91±12.0)μm]明显大于盐水组[(20.89±5.39)μm]及实验组[(23.05±6.07)μm],差异有统计学意义(P0.05).Masson染色结果显示,腹膜透析液组的胶原纤维沉积(0.89±0.09)明显高于盐水组(0.19±0.03)及实验组(0.15±0.06),差异有统计学意义(P0.05).免疫组织化学染色结果显示,腹膜透析液组的KLF-4(0.27±0.09)及E-cadherin(0.31±0.03)表达明显低于盐水组(0.79±0.19,0.83±0.13)及实验组(0.85±0.11,0.76±0.11),差异有统计学意义(P0.05).腹膜透析液组的α-SMA(0.83±0.09)及FN(0.63±0.09)表达明显高于盐水组(0.22±0.08,0.30±0.07)及实验组(0.19±0.05,0.11±0.03),差异有统计学意义(P0.05).结论 KLF-4可能通过与E-cadherin启动子区域的结合位点相结合,并正向调控E-cadherin的表达,从而抑制高糖腹膜透析液诱导的腹膜纤维化.

摘要： 目的 研究人脐带间充质干细胞(human umbilical cord mesenchyma] stem cells,hUCMSCs)条件培养液(conditioned medium,CM)对高糖(high glucose,HG)诱导人腹膜间皮细胞(human peritoneal mesothelial cells,HPMCs)发生上皮细胞-间充质转化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)的影响及其作用机制.方法 应用CCK-8法检测不同浓度葡萄糖(1.5％,2.5％,4.25％)和不同体积分数(5％,7.5％,10％,12.5％,15％)的间充质干细胞条件培养液(mesenchymal stem cells conditioned medium,MSC-CM)对HPMCs增殖的影响.实验分组:①对照组;②HG组(2.5％葡萄糖);③CM组(2.5％葡萄糖+7.5％MSC-CM),作用48h.光镜下观察HG和MSC-CM处理后HPMCs的形态学变化.应用Western blot检测HG和MSC-CM处理后HPMCs中EMT标志物以及Wnt/β-catenin通路蛋白的表达.结果 HG抑制HPMCs的增殖,MSC-CM促进HPMCs的增殖.光镜下,HG组细胞形态多数呈梭形改变,MSC-CM可以缓解HG引起的细胞形态学改变.与对照组相比,HG组中E-cadherin表达减少(t=-7.166,P=0.002),Vimentin和α-SMA表达升高(t值分别为3.748,3.430;P值分别为0.020,0.027),CM组可缓解HG引起的上述蛋白表达变化(t值分别为3.865,4.657,6.000;P值分别为0.018,0.010,0.004).与对照组相比,HG组上调Wnt/β-catenin通路中β-catenin蛋白的表达(t=3.341,P=0.029),CM组抑制HG诱导的β-catenin蛋白表达上调(t=3.808,P=0.019).结论 hUC-MSC-CM可能通过抑制Wnt/β-catenin信号通路,缓解HG诱导HPMCs的EMT.

摘要： 目的:探讨微小RNA-22-3p(miR-22-3p)对人腹膜间皮细胞核苷酸结合寡聚化结构域样受体蛋白3(NLRP3)表达及功能的影响.方法:将NLRP3基因的3'-非翻译区(3'-UTR)序列及其突变体克隆到双萤光素酶报告基因载体psiCHECK2中,构建野生型及突变型重组双萤光素酶报告质粒,与miR-22-3p mimic和miR-22-3p in?hibitor共转染LPS预处理的人腹膜间皮细胞株HMrSV5,检测萤光素酶活性;HMrSV5细胞随机分为以下6组:miR-22-3p NC+LPS组、miR-22-3p NC+LPS+ATP组、miR-22-3p mimic+LPS组、miR-22-3p mimic+LPS+ATP组、miR-22-3p inhibitor+LPS组和miR-22-3p inhibitor+LPS+ATP组.RT-qPCR和Western blot检测NLRP3 mRNA和蛋白的表达,ELISA检测白细胞介素1β(IL-1β)的表达和caspase-1的活性,Western blot检测caspase-1 p20蛋白的表达.结果:NLRP3-3'-UTR野生型与miR-22-3p mimic共转染HMrSV5细胞后,萤光素酶活性较对照组降低(P<0.05);NLRP3-3'-UTR野生型与miR-22-3p inhibitor共转染HMrSV5细胞后,萤光素酶活性较对照组升高(P<0.05).与miR-22-3p NC+LPS组比较,miR-22-3p mimic+LPS组NLRP3的mRNA和蛋白表达、IL-1β和caspase-1 p20的水平均下降且cas?pase-1活性减弱(P<0.05),而miR-22-3p inhibitor+LPS组NLRP3的mRNA和蛋白表达、IL-1β和caspase-1 p20的水平均上升且caspase-1的活性增强(P<0.05).与miR-22-3p NC+LPS+ATP组比较,miR-22-3p inhibitor+LPS+ATP组NLRP3的mRNA和蛋白表达、IL-1β和caspase-1 p20的水平均上升且caspase-1的活性增强(P<0.05).结论:miR-22-3p可负性调控人腹膜间皮细胞NLRP3的表达及功能.

摘要： 目的:以CRISPR/Cas9基因编辑技术,构建Smad3基因敲除的人腹膜间皮细胞(HPMC),研究Smad3在HPMC增殖和凋亡中的调控机制.方法:利用CRISPR Design软件设计gRNA,比对后合成,构建Smad3 gRNA-PX459质粒,用Lipofectamine 3000转染细胞,嘌呤霉素筛选后用有限稀释法获得单克隆细胞株,提取DNA进行PCR扩增后测序,同时提取总蛋白,采用蛋白免疫印迹(Western blotting)检测蛋白表达情况;CCK8法检测细胞增殖情况,流式细胞术检测细胞凋亡率,West-ern blotting检测凋亡相关蛋白表达.结果:成功构建Smad3稳定敲除的HPMC.Smad3基因敲除后,细胞增殖率无明显变化(P＞0.05),而凋亡率从(7.92±0.26％)上升至(11.70±0.56％),促凋亡相关蛋白Bax表达量从(0.70±0.05)上调至(1.25±0.11)(P＜0.05).结论:Smad3基因在HPMC的凋亡中具有重要的调控作用.

摘要： 反复发生的腹腔感染和腹膜炎是导致腹膜纤维化的重要原因。炎症状态可以激活腹膜间皮细胞(human peritoneal mesothelial cells, HPMCs)过度分泌多种促纤维化细胞生长因子，主要包括转化细胞生长因子-β1 (transforming gowth factor-β1, TGF-β1)和结缔组织生长因子(connective tissue growth factor, CTGF)，二者过度表达可以促进细胞外基质(extracellular matrix, ECM )沉积，继而导致纤维化。本文探讨川芎嗪对肿瘤坏死因子-α(Tumor necrosis factor-α, TNF-α)诱导的HPMCs TGF-β1和CTGF表达的干预作用及其机制。

摘要： 本发明公开一种副猪嗜血杆菌感染猪腹膜间皮细胞模型的构建方法，涉及细胞感染模型技术领域。所述副猪嗜血杆菌感染猪腹膜间皮细胞模型的构建方法包括以下步骤：取副猪嗜血杆菌SH0165型标准菌株进行培养，制得细菌悬液；向猪腹膜间皮细胞中加入所述细菌悬液，感染6～12h后，即得副猪嗜血杆菌感染猪腹膜间皮细胞模型，所述细菌悬液中副猪嗜血杆菌感染所述猪腹膜间皮细胞的感染比为(90～110)：1。本发明旨在构建一种副猪嗜血杆菌SH0165型感染猪腹膜间皮细胞的体外感染模型。

摘要： 本发明公开了一种温石棉诱导的人胸膜间皮细胞恶性转化株及其应用，所述人胸膜间皮细胞恶性转化株分类命名为：人胸膜间皮细胞，株号为：AS‑T，保藏号为：CCTCC NO.C201923。本发明人胸膜间皮细胞恶性转化株由人胸膜间皮细胞(MeT‑5A)经温石棉多阶段多次染毒处理后，发生恶性转化获得，在作为致癌物致癌机制研究的细胞模型等多个方面具有良好的应用前景。

摘要： 本发明公开了一种多壁碳纳米管诱导的人胸膜间皮细胞恶性转化株及其应用，所述人胸膜间皮细胞恶性转化株分类命名为：人胸膜间皮细胞，株号为：MCN‑MeT‑5A，保藏号为：C2018124。本发明人胸膜间皮细胞恶性转化株由人胸膜间皮细胞(MeT‑5A)经MWCNT多阶段多次染毒处理后，发生恶性转化获得，在作为致癌物致癌机制研究的细胞模型等多个方面具有良好的应用前景。

摘要： 本发明公开了一种大鼠腹膜间皮细胞的提取与培养方法，包括以下步骤：（1）配制培养液，所述培养液包括基础培养基、胎牛血清及碳酸氢钠；（2）肠系膜提取：将肠系膜平摊在大鼠肝脏表面，提起肠系膜中间部分，剪下小块肠系膜的中央部分放入缓冲液清洗；将清理后的小块肠系膜移至消化液中进行消化，得原代细胞悬液；（3）细胞接种培养。本发明提取与培养方法不仅可以低成本并稳定地获得性状均一、细胞的获得率高、杂细胞含量少且活性较强的腹膜间皮细胞，而且获得的腹膜间皮细胞在使用显微镜明场观察时可以看到呈现经典的铺路石状，且形态稳定、一致性高，培养稳定，在用于后续的相关研究有利于增加实验的准确性和可重复性。

摘要： 本发明公开一种猪腹膜间皮细胞的培养方法，涉及细胞培养技术领域。所述猪腹膜间皮细胞的培养方法包括以下步骤：将清理后的腹膜平铺于培养皿中进行酶解消化，得原代细胞悬液；将所述原代细胞悬液离心，保留沉淀物，并将所述沉淀物用原代培养液重悬，筛选得原代细胞；其中，所述原代培养液包含15％～20％(v/v)胎牛血清、79％～85％(v/v)DMEM/F‑12基础培养基、0.8％～1.1％(v/v)青链霉素混合液、0.03～0.05％(v/v)EGF以及0.05％～0.12％(v/v)ITS。本发明旨在提供一种适用于猪腹膜间皮细胞的培养方法。

摘要： 本发明公开一种副猪嗜血杆菌感染猪腹膜间皮细胞模型的构建方法，涉及细胞感染模型技术领域。所述副猪嗜血杆菌感染猪腹膜间皮细胞模型的构建方法包括以下步骤：取副猪嗜血杆菌SH0165型标准菌株进行培养，制得细菌悬液；向猪腹膜间皮细胞中加入所述细菌悬液，感染6～12h后，即得副猪嗜血杆菌感染猪腹膜间皮细胞模型，所述细菌悬液中副猪嗜血杆菌感染所述猪腹膜间皮细胞的感染比为(90～110)：1。本发明旨在构建一种副猪嗜血杆菌SH0165型感染猪腹膜间皮细胞的体外感染模型。

摘要： 本发明涉及一种原代腹膜间皮细胞的分离方法及分离所得PMCs。本发明所述方法从腹膜透析置管术后2周内的患者的透析液中分离原代PMCs。所述方法步骤简单、无创且易于重复，所得原代PMCs具有纯度高、贴壁性好、传代次数多、融合性好，能直接反映PD患者PMCs在PDS中的生理变化等优点。

摘要： 本发明公开了一种多壁碳纳米管诱导的人胸膜间皮细胞恶性转化株及其应用，所述人胸膜间皮细胞恶性转化株分类命名为：人胸膜间皮细胞，株号为：MCN‑MeT‑5A，保藏号为：C2018124。本发明人胸膜间皮细胞恶性转化株由人胸膜间皮细胞(MeT‑5A)经MWCNT多阶段多次染毒处理后，发生恶性转化获得，在作为致癌物致癌机制研究的细胞模型等多个方面具有良好的应用前景。

摘要： 本发明公开了一种温石棉诱导的人胸膜间皮细胞恶性转化株及其应用，所述人胸膜间皮细胞恶性转化株分类命名为：人胸膜间皮细胞，株号为：AS‑T，保藏号为：CCTCC NO.C201923。本发明人胸膜间皮细胞恶性转化株由人胸膜间皮细胞(MeT‑5A)经温石棉多阶段多次染毒处理后，发生恶性转化获得，在作为致癌物致癌机制研究的细胞模型等多个方面具有良好的应用前景。

摘要： 本发明公开了基本纯的人卵巢间皮细胞群体，以及分离和培养卵巢间皮细胞的方法。通过小心操作卵巢间皮细胞的微环境，可以得到多次传代，其中卵巢间皮细胞能够成为卵巢表面上皮细胞或颗粒细胞。另外，本文还公开了使用人卵巢间皮细胞的几种方法。