人视网膜色素上皮细胞

摘要： 目的研究京尼平(genipin)具有抑制高糖缺氧导致的人视网膜色素上皮(ARPE-19)细胞氧化应激损伤的作用及机制。方法体外培养ARPE-19细胞,建立氧化应激损伤模型。细胞随机分为4组培养,即对照组、模型组、京尼平组和Nrf2抑制剂组。倒置显微镜下观察各组细胞形态;吖啶橙-溴乙锭(AO/EB)染色法分析细胞凋亡;DCFH-DA法检测细胞内ROS含量;试剂盒检测谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)活性;Western blot法检测细胞核因子E_(2)相关因子2(Nrf2)和血红素氧化酶-1(HO-1)蛋白相对表达量。结果京尼平明显改善高糖缺氧环境的细胞生长状态,减少细胞凋亡率,降低ROS水平,升高GSH-Px活力值。Western blot法检测Nrf2/HO-1通路相关蛋白,模型组与空白组比较,Nrf2和HO-1蛋白表达水平均降低;京尼平组与模型组比较,上调Nrf2和HO-1蛋白表达量,加入Nrf2抑制剂后则明显降低,差异均有统计学意义(P<0.05)。结论对于高糖缺氧导致氧化应激损伤的ARPE-19细胞,京尼平具有抑制作用,其机制与调节Nrf2/HO-1通路有关。

摘要： 锦州医科大学附属第三医院牛亚靖和胡水清发表在《国际眼科杂志》中文刊2018年18卷03期第423-428页的文章《人视网膜色素上皮细胞在缺氧和高糖环境中VEGF 165及VEGF 165b的表达及意义》,由于作者个人原因申请撤稿,经我社审核同意做单篇撤稿处理。对此给读者带来的不便,深表歉意!

摘要： 目的:探讨姜黄素在体外抑制脉络膜新生血管(CNV)生成的作用及机制。方法:氯化钴(CoCl_(2))诱导人视网膜色素上皮(ARPE-19)细胞建立化学性缺氧模型,采用CCK-8法检测姜黄素对CoCl_(2)诱导的ARPE-19细胞活性的影响,采用RT-qPCR和Western blot检测姜黄素对CoCl_(2)诱导的ARPE-19缺氧模型细胞内AKT、HIF-1α和VEGF mRNA及蛋白表达的影响。采用细胞划痕实验、Transwell小室迁移实验、Transwell小室侵袭实验及Matrigel基质胶管腔形成实验,观察在非接触情况下ARPE-19细胞姜黄素的条件培养液对人脐静脉内皮细胞(HUVEC)的增殖、迁移、侵袭和管腔形成的影响。结果:100μmol/L CoCl_(2)可成功建立ARPE-19细胞化学缺氧模型。CoCl_(2)在100μmol/L浓度下促进ARPE-19细胞中AKT、HIF-1α和VEGF mRNA及p-AKT、HIF-1α和VEGF蛋白的表达。姜黄素在浓度为100μmol/L时可减少ARPE-19细胞中AKT、HIF-1α和VEGF mRNA及p-AKT、HIF-1α和VEGF蛋白的表达。ARPE-19细胞姜黄素低(6.25μmol/L)、中(25μmol/L)、高剂量组(100μmol/L)条件培养液可显著抑制HUVEC细胞水平迁移;其中高剂量组条件培养液可显著抑制HUVEC细胞垂直迁移和细胞侵袭。ARPE-19细胞姜黄素中、高剂量组条件培养液可抑制HUVEC细胞管腔形成。结论:姜黄素在100μmol/L对CoCl_(2)诱导ARPE-19细胞缺氧有保护作用。姜黄素可在细胞水平抑制血管的生成。

摘要： 目的探讨壳聚糖脱氧胆酸负载姜黄素纳米微粒的制备方法,观察姜黄素纳米微粒对人视网膜色素上皮细胞周期的影响。方法以脱氧胆酸基接枝的壳聚糖为载体,姜黄素为负载药物合成姜黄素纳米微粒,测定纳米微粒的负载率与载药量。观察纳米微粒的外形结构,测定其体外释放量。检测不同浓度的壳聚糖脱氧胆酸纳米粒作用于人视网膜色素上皮细胞24、48 h光密度(OD)值,同时观察其细胞形态。测定姜黄素纳米微粒及姜黄素对人视网膜色素上皮细胞周期时相变化。结果姜黄素与壳聚糖脱氧胆酸混合制成负载药物的壳聚糖脱氧胆酸纳米微粒为淡黄色,未负载药物的壳聚糖脱氧胆酸纳米微粒呈类球形或球形,平均粒径为30~50 nm,负载姜黄素的壳聚糖脱氧胆酸纳米微粒粒径为70~100 nm;载药量为27.5%,负载率为55.0%。96 h后药物从纳米微粒中的释放达到平衡,药物的累积释放量达31.6%。不同浓度的壳聚糖脱氧胆酸纳米微粒作用于人视网膜色素上皮细胞24、48 h后OD值与对照比较,差异无统计学意义(P>0.05)。各浓度姜黄素纳米微粒与姜黄素分别对体外培养的人视网膜色素上皮细胞作用24 h后,均出现S期细胞百分比下降,G_(0)~G_(1)期细胞百分比上升。结论通过壳聚糖脱氧胆酸包载的姜黄素纳米微粒能持续释放出姜黄素,缓释功能较好。姜黄素纳米微粒可以阻滞人视网膜色素上皮细胞周期于S期。

摘要： 目的:探究抗肿瘤药物紫杉醇(PTX)对人视网膜色素上皮细胞(ARPE-19)增殖、凋亡、周期、形态和视网膜外屏障的潜在毒性作用。方法:体外培养ARPE-19细胞,将细胞分为对照组(正常培养基培养)、加药物组(PTX)。不同浓度PTX(0.005、0.05、0.5、5mg/L)处理ARPE-19细胞12、24、36、48、72h,CCK8法检测不同浓度PTX不同时间点对ARPE-19细胞增殖的影响;流式细胞术检测不同浓度PTX不同时间点对ARPE-19细胞凋亡的影响及周期阻滞作用;免疫荧光观察细胞形态变化;Western blot检测凋亡相关蛋白表达及屏障功能相关蛋白表达;通过测量细胞跨上皮电阻检测药物对细胞屏障的影响。结果:PTX使ARPE-19细胞的增殖能力降低,0.005mg/L PTX处理36h,细胞增殖开始受影响;同时,PTX加速细胞凋亡且与时间、药物浓度呈依赖性,流式检测细胞周期可明显得出细胞被阻滞于G2-M期。0.05mg/L PTX处理24h后,细胞形态发生明显改变,正常细胞呈梭形或不规则形,加药物组中,细胞数相对减少且形态趋于圆形;0.05mg/L PTX破坏视网膜屏障功能,药物处理后细胞跨上皮电阻显著降低且紧密连接蛋白ZO-1、Occludin的表达较对照组显著降低(P<0.05)。Cleaved-caspase-3、Bax的表达量较对照组显著增加,Bcl-2的表达量较对照显著降低(P<0.05)。结论:PTX对ARPE-19细胞的增殖、凋亡,且依赖与时间及浓度;此外,PTX对ARPE-19细胞周期及形态均产生影响。同时PTX可破坏视网膜的屏障功能,提示抗肿瘤药物存在对视网膜潜在的毒性作用。

摘要： 目的:研究维生素E(Vit E)对大剂量蓝光诱导人视网膜色素上皮(hRPE)细胞损伤的影响,为减少蓝光损伤hRPE细胞的预后方案提供思路。方法:用3000±150Lx蓝光建立hRPE细胞损伤模型;利用流式细胞术检测照射时间分别为0、3、6、9、12、24h的6组hRPE细胞凋亡率及活性氧相对量;利用流式细胞术检测照射0h组、照射6h组、照射6h前或后加不同浓度Vit E组(Vit E的浓度分别为10、50、100μmol/L)的hRPE细胞凋亡情况和活性氧相对量,并采用Hoechst 33258试剂染色在荧光显微镜下观察hRPE细胞的荧光强度。结果:与照射0h组相比,照射3、6、9、12、24h组的hRPE细胞活性氧相对量明显增加(均P<0.01),照射6、9、12、24h组的hRPE细胞凋亡率也明显增加(均P<0.01),但照射3h组的hRPE细胞凋亡率无明显增加,差异无统计学意义(P=0.46)。与照射6h组相比,除照射6h前加入10μmol/L的hRPE细胞凋亡率(P=0.66)外,其他加Vit E的实验组hRPE细胞活性氧相对量和凋亡率明显减少、细胞中Hoechst 33258释放蓝色荧光逐渐减弱,且呈浓度依赖(均P<0.01)。与照射0h组相比,加Vit E的6组hRPE细胞活性氧相对量和凋亡率有差异(均P<0.01)。同一浓度的Vit E,除10μmol/L Vit E的hRPE细胞凋亡率在照射前或后加无差异(P=0.08)外,照射后加Vit E组比照射前加Vit E组的hRPE细胞活性氧相对量、凋亡率明显减少(均P<0.01)。结论:hRPE细胞经蓝光照射后出现胞内活性氧相对量增多的现象早于细胞凋亡,清除胞内活性氧是减少大剂量蓝光诱导hRPE细胞损伤的思路。Vit E可保护由大剂量蓝光诱导的RPE细胞损伤,这种效应随Vit E浓度增加而增强,且照射后加入比照射前加入的效果更好。但需要一定剂量的Vit E才能显效,而且无法完全修复损伤。

摘要： 目的研究人参皂苷Rb1对4-羟基壬烯醛(4-HNE)诱导的人视网膜色素上皮细胞(ARPE-19)氧化损伤的保护作用及其机制。方法采用CCK-8法检测人参皂苷Rb1、4-HNE处理浓度。将ARPE-19细胞随机分为对照组、Rb1处理组、4-HNE组和4-HNE+Rb1处理组。采用光学显微镜观察各组细胞形态结构,同时采用荧光显微镜检测细胞内的活性氧自由基(ROS)含量。采用Western印迹检测细胞凋亡相关因子B细胞淋巴瘤(Bcl)-2、Bax蛋白表达水平。结果CCK-8检测的结果显示人参皂苷Rb1浓度为100μmol/L时ARPE-19细胞的增殖率最高,具有较好的保护作用,因此选择100μmol/L人参皂苷Rb1进行后续实验。与4-HNE组比较,50.0μmol/L和100.0μmol/L人参皂苷Rb1组细胞活力明显升高(P<0.05)。与对照组比较,4-HNE组细胞内ROS含量明显增加(P<0.05),Bax蛋白表达量升高,Bcl-2蛋白表达量降低。与4-HNE组比较,4-HNE+Rb1处理组细胞内ROS含量显著减少(P<0.05),Bax蛋白表达量降低,Bcl-2蛋白表达量升高。结论人参皂苷Rb1能改善4-HNE诱导的视网膜色素上皮细胞氧化损伤,其机制可能与人参皂苷Rb1减轻细胞凋亡有关。

摘要： 目的研究多西他赛(docetaxel,DTX)对体外培养的人视网膜色素上皮(human retinal pigment epithelium,hRPE)细胞增殖的抑制和凋亡。方法选择不同浓度(0、10、20、40、80μg/mL)的DTX作用于hRPE细胞一定时间,MTT法检测DTX对hRPE细胞的生长抑制,荧光染色显微镜观察凋亡细胞,流式细胞术检测DTX对hRPE细胞周期的影响。结果DTX对人hRPE细胞有生长抑制作用,随着DTX浓度的增加,对hRPE细胞的增殖抑制作用明显增强(P<0.05),当DTX浓度为80μg/mL作用于hRPE细胞48 h时,细胞增殖抑制达93%。20μg/mL DTX作用的hRPE细胞中细胞核或细胞质内出现致密浓染的颗粒状或条索状荧光的凋亡细胞,随着浓度的增加,凋亡细胞数亦增加。流式细胞仪检测显示,加入DTX的hRPE细胞各周期比例发生改变,G_(0)/G_(1)期、S期细胞比例逐渐减少,G_(2)/M期细胞增加,不同浓度组与阴性对照组比较差异有统计学意义(P<0.01),80μg/mL作用48 h的hRPE细胞明显阻滞于G_(2)/M期。结论多西他赛通过阻滞hRPE细胞G_(2)/M期的进展和诱导hRPE细胞的凋亡而显著抑制hRPE细胞增殖。

摘要： 目的人脐带间充质干细胞(hUMSCs)外泌体在保护人视网膜色素上皮(RPE)细胞抵抗高糖诱导的细胞凋亡中的作用。方法实验研究。超速离心法收集hUMSCs外泌体,通过透射电镜和纳米颗粒追踪分析其形态结构;采用CCK-8和EdU实验检测外泌体处理后的人RPE在高糖条件下的增殖情况;通过蛋白免疫印迹(western blot)检测周期蛋白和凋亡蛋白的变化;运用流式细胞仪检测hUMSCs外泌体在高糖诱导凋亡率中的作用。结果高浓度糖培养环境通过促进线粒体介导的细胞凋亡而抑制了ARPE-19的增殖;来自hUMSCs的外泌体(hUMSC-exo)能促进人RPE细胞的增殖及保护ARPE-19抵抗高糖诱导的细胞凋亡。结论hUMSCs外泌体能够保护人RPE细胞抵抗高糖诱导的细胞凋亡。

摘要： 目的探讨纳豆激酶(NK)对高糖缺氧导致的人视网膜色素上皮细胞(ARPE-19)损伤的保护作用。方法不同浓度的葡萄糖和氯化钴(CoCl_(2))诱导培养ARPE-19细胞24 h后,观察细胞形态变化,采用CCK-8法检测ARPE-19细胞活性。Western blot和RT-qPCR检测紧密连接蛋白-1(ZO-1)、缺氧诱导因子-1α(HIF-1α)、血管内皮生长因子A(VEGFA)、白细胞介素(IL)-1β、IL^(-1)8的表达情况,筛选最佳葡萄糖和CoCl_(2)浓度构建体外高糖缺氧的细胞模型。CCK-8法筛选合适的NK浓度,将ARPE-19细胞分为正常糖组(5.5 mmol•L^(-1)葡萄糖,NC组)、高糖+CoCl_(2)组(25.0 mmol•L^(-1)葡萄糖+200μmol•L^(-1) CoCl_(2),HG+CoCl_(2)组)和NK处理组(1.0μmol•L^(-1) NK+25.0 mmol•L^(-1)葡萄糖+200μmol•L^(-1) CoCl_(2),NK+HG+CoCl_(2)组),采用Western blot和RT-qPCR检测各组ARPE|19细胞中ZO-1、HIF-1α及VEGFA的蛋白和mRNA表达水平。结果CCK-8法检测结果显示,与NC组比较,CoCl_(2)浓度高于200μmol•L^(-1)的干预组中ARPE-19细胞的活性均明显降低(均为P<0.01),且细胞形态发生明显改变。Western blot和RT-qPCR检测结果显示,与NC组比较,200μmol•L^(-1) CoCl_(2)的干预组ARPE-19细胞中HIF-1α和VEGFA的蛋白和mRNA与IL^(-1)β和IL^(-1)8的mRNA的表达水平均明显增加(均为P<0.01),而ZO-1蛋白的表达水平均明显降低(均为P<0.05)。CCK-8法检测结果显示,当NK浓度高于1.0μmol•L^(-1)时,ARPE-19细胞的活性较NC组均明显下降(均为P<0.01)。与HG+CoCl_(2)组比较,NK+HG+CoCl_(2)组ARPE-19细胞中HIF-1α、VEGFA蛋白和mRNA的表达水平均显著降低(均为P<0.001),而ZO-1蛋白的表达水平明显上升(P<0.05)。结论NK可以降低高糖缺氧损伤的ARPE-19细胞中HIF-1α及VEGFA的蛋白和mRNA表达水平,对高糖缺氧引起的细胞损伤具有保护作用。

摘要： 本发明涉及一种诱导人羊膜上皮细胞向视网膜色素上皮细胞分化的方法及其在治疗视网膜退行性疾病中的应用，该方法为向人羊膜上皮细胞中添加含有10‑100mM烟酰胺和1‑10μM曲古抑菌素A的诱导组合物，诱导产生的细胞高表达MITF、PMEL17、RPE65、Bestrophin等视网膜色素上皮细胞的典型基因。将利用该方法诱导产生的细胞注射到RCS大鼠视网膜下腔，通过ERG以及眼底检测发现大鼠眼睛电生理信号明显增强，眼底结构明显改善，眼球切片HE染色显示其视网膜厚度明显增加，经过上述方案诱导分化后的细胞经注射后对大鼠的视力有一定程度的恢复。本发明中的诱导复合物能够用于人羊膜上皮细胞向视网膜色素上皮细胞的分化以及治疗视网膜损伤相关的眼部疾病。

摘要： 本发明涉及一种用于在体外获得人类视网膜祖细胞的方法，该方法包括以下步骤：(i)将人类多能干细胞的贴壁培养物放置于促神经培养基中；以及，(ii)使所述培养物保持在所述促神经培养基中，直至出现色素细胞和/或神经上皮样结构。有利地，可进行额外的步骤，以获得RPE细胞和/或神经视网膜前体。

摘要： 本发明涉及一种体外诱导人胚胎干细胞分化为视网膜色素上皮细胞的方法，属于生物技术领域。本发明诱导分化经过一次传代可获得纯的视网膜色素上皮细胞。与现有技术相比，本发明缩短了人胚胎干细胞向视网膜色素上皮细胞分化的时间。本发明为人胚胎干细胞定向诱导分化为色素上皮细胞提供指导和新的途径。

摘要： 本发明涉及一种诱导人羊膜上皮细胞向视网膜色素上皮细胞分化的方法及其在治疗视网膜退行性疾病中的应用，该方法为向人羊膜上皮细胞中添加含有10‑100mM烟酰胺和1‑10μM曲古抑菌素A的诱导组合物，诱导产生的细胞高表达MITF、PMEL17、RPE65、Bestrophin等视网膜色素上皮细胞的典型基因。将利用该方法诱导产生的细胞注射到RCS大鼠视网膜下腔，通过ERG以及眼底检测发现大鼠眼睛电生理信号明显增强，眼底结构明显改善，眼球切片HE染色显示其视网膜厚度明显增加，经过上述方案诱导分化后的细胞经注射后对大鼠的视力有一定程度的恢复。本发明中的诱导复合物能够用于人羊膜上皮细胞向视网膜色素上皮细胞的分化以及治疗视网膜损伤相关的眼部疾病。

摘要： 本发明涉及一种用于获得人视网膜祖细胞的体外方法，包括以下步骤：(i)将人多能干细胞的贴壁培养物置于干细胞特异性促神经培养基中，所述培养物不含饲养细胞；和(ii)在所述干细胞特异性促神经培养基中维持所述培养物，直至出现色素细胞和/或神经上皮样结构。有利地，可以进行另外的步骤以获得RPE细胞和/或神经视网膜的前体。

摘要： 本发明涉及一种用于在体外获得人类视网膜祖细胞的方法，该方法包括以下步骤：(i)将人类多能干细胞的贴壁培养物放置于促神经培养基中；以及，(ii)使所述培养物保持在所述促神经培养基中，直至出现色素细胞和/或神经上皮样结构。有利地，可进行额外的步骤，以获得RPE细胞和/或神经视网膜前体。

摘要： 本发明公开了视网膜色素上皮细胞与间充质干细胞在制备治疗视网膜退行性疾病的药物中的应用。胎儿来源的视网膜色素上皮细胞与间充质干细胞在制备治疗视网膜退行性疾病的药物中的应用。所述的视网膜退行性疾病优选老年性黄斑变性。本发明将胎儿来源的视网膜色素上皮细胞与间充质干细胞共同移植治疗视网膜退行性疾病模型小鼠，比单纯的fRPE和单纯的MSC移植治疗，对视网膜损伤后修复功能效果更好。并且，共同移植比单纯一种细胞的移植，移植后存活的细胞数更多，光感受器细胞解救效果更强。并且，共同移植显著抑制了退行性疾病模型小鼠的炎症反应，并促进内源性生长因子的分泌。

摘要： 本发明涉及一种体外诱导人胚胎干细胞分化为视网膜色素上皮细胞的方法，属于生物技术领域。本发明诱导分化经过一次传代可获得纯的视网膜色素上皮细胞。与现有技术相比，本发明缩短了人胚胎干细胞向视网膜色素上皮细胞分化的时间。本发明为人胚胎干细胞定向诱导分化为色素上皮细胞提供指导和新的途径。

摘要： 本发明公开了从人视网膜色素上皮细胞中提取多能干细胞的方法，包括以下步骤，首先进行上皮细胞提取，取视网膜上皮，进行分离，获得视网膜上皮组织，通过使用消化酶对上皮组织进行消化，之后通过离心分离沉淀后获得视网膜色素上皮细胞，然后进行细胞培养；本发明专利通过提取活性视网膜色素上皮细胞，通过为时15天的两次诱导分化，采用多能干细胞系因子进行共同培养，使视网膜色素上皮细胞逐渐被诱导分化为多能干细胞，并且无需进行传代培养，采用第一代视网膜色素上皮细胞分化出多能干细胞，在不改变第一代视网膜色素上皮细胞的情况下，分化出的多能干细胞更有利于对视网膜系统的病变进行深入研究。

摘要： 本发明公开了人多能干细胞来源人视网膜色素上皮细胞的制备和扩增培养方法。它包括以下步骤：收集人多能干细胞来源的3D‑RPE球体，机械分离、去除不含色素的非RPE细胞或团块，留取含有色素的RPE细胞片；酶解消化含有色素的RPE细胞片，获得RPE单细胞悬液，由此获得人多能干细胞来源人视网膜色素上皮细胞。本发明方法制备的人RPE细胞的特性与人胚胎来源RPE细胞特性极其类似，具有典型RPE细胞形态特征，并呈现正常生理功能。本发明方法制备的人RPE细胞可传代培养，大量扩增，为视网膜疾病的研究和治疗提供种子细胞，造福失明患者，解决了现有人视网膜色素上皮细胞来源有限，RPE移植供体缺乏的重要缺陷，具有重大意义。