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2004年—2008年成都地区奈瑟氏淋球菌耐药及质粒谱的分析研究

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综述 淋病奈瑟氏菌耐药流行病学及机制研究进展

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摘要

目的：淋病是常见的性传播疾病（STD）之一，因普遍存在耐药，传统的抗生素青霉素、四环素早已不再应用于淋病治疗，有资料显示，高水平质粒介导的TRNG（耐四环素淋球菌）和染色体介导的TRNG的比例在上升，而产青霉素酶淋球菌（PPNG）有下降趋势，这可能与近年来青霉素不再作为治疗淋病的一线药物有关。因此，对淋球菌耐药菌株的研究依然是淋球菌耐药流行病学监测的重要指标之一。淋病奈瑟氏菌（NG）产生耐药与染色体介导、质粒介导、多重可传递耐药系统即mtr外排系统、脂肪酸耐药系统即far外排系统和norm外排系统有关。研究发现，质粒介导的耐药占所有耐药菌株的91%左右，可通过电泳使不同分子量大小的质粒因迁移率的不同而显示出不同的条带。用分子生物学技术进行质粒谱分析可以更准确的监测耐药的变化。本文通过2004年-2008年成都地区淋病奈瑟氏菌耐药状况的研究，分析了近五年该地区淋病奈瑟菌耐药的现状及其耐药质粒谱的变化，为淋病耐药监测提供了更翔实的依据，同时为淋病的药物治疗提供了重要参考。 方法：1．收集2004年-2008年共150株奈瑟氏淋球菌，并经细菌形态学、氧化酶和糖发酵实验进一步确证；2．将收集的淋球菌制成108CFU/ml菌悬液，加入裂解液，100℃加热15分钟，10000r/min离心15分钟，取上清液2ul作为PCR扩增模板，在微量离心管中依次加入10×buffer（含Mgcl21．5mmol/l）3ul；10pmol/l特异性正反引物各1ul；10mmol/l dNTP0．25 ul；Taq DNA聚合酶1．5U；模板DNA2ul；加入双蒸水至30ul后加入液体石蜡10 ul后按照反应条件进行PCR扩增，之后在微量离心管中加入0．25%溴酚蓝5ul，混匀静置后取6ul加入2%琼脂糖凝胶水平式电泳槽加样孔中，并在首尾孔加6 ul DNAmarker以作参照，电泳仪电压调节至75V，电泳2小时后关闭电源，取出平板于紫外仪下观察结果并照相，画图记录。对所得数据进行整理，分别将2004-2008年间耐青霉素、耐四环素和耐环丙沙星的淋球菌菌株的平均耐药率与2000-2004年的平均耐药率进行比较，得出三种药物的耐药率变化。将2004-2008年分离的NG菌株的耐药质粒大小及型别进行分析得出2004-2008年NG质粒谱。 结果：1．2004-2008年间PPNG检出情况：2004年-2008年从每年30株NG菌株中检出的耐青霉素菌株分别为：27、3、0、6、18株；每年PPNG耐药率分别为：90．00%、10．00%、0．00%、20．00%、60．00%；PPNG在2004-2008年间的耐药平均率为36．00%。2．PPNG的耐药类型：2004年和2008年PPNG以染色体介导为主，主要为340bp大小的penA基因（耐青霉素结合蛋白2编码序列）；2005年和2007年以质粒介导为主，主要为产物长度为535bp的TEM基因。2004-2008年间PPNG耐药质粒均为亚洲型质粒。3．2004-2008年间TRNG检出情况：2004年-2008年从每年30株NG菌株中检出的TRNG菌株分别为：12、20、13、23、15株。每年TRNG耐药率分别为：40．00%、66．67%、43．33%、76．66%、50．00%；TRNG在2004-2008年间的耐药平均率为55．33%。4．TRNG的耐药类型：以质粒介导为主，为501bp大小的tetM基因（耐四环素核糖体保护蛋白编码序列）。5．2004-2008年间耐环丙沙星菌株（CPNG）检出情况：2004年-2008年从每年30株NG菌株中检出的CPNG菌株分别为：29、21、2、9、25株；每年CPNG耐药率分别为：96．67%、70．00%、10．00%、30．00%、83．33%。；CPNG在2004-2008年间的耐药平均率为58．00%。6．CPNG的耐药类型：均为染色体介导，为380bp大小的gyrA基因（DNA回旋酶A亚单位编码序列）。 结论：1．PPNG近五年（2004年-2008年）耐药平均率（36．00%）较过去五年（2000年-2004年）（94．07%）下降58．07%，经统计学分析，有显著性差异（X2=372．001，P<0．05），提示停用青霉素治疗淋病后，NG对青霉素敏感性有上升趋势。2．TRNG近五年（2004年-2008年）耐药平均率（53．33%）较过去五年（2000年-2004年）（57．57%）下降2．24%，经统计学分析，无显著性差异（X2=0．265，P>0．05）。3．CPNG近五年（2004年-2008年）耐药平均率（58．00%）较过去五年（2000年-2004年）（76．79%）下降18．79%，经统计学分析，有显著性差异（X2=249．197，P<0．05），提示停用环丙沙星治疗淋病后，NG对环丙沙星敏感性有上升趋势。4．2004年和2008年成都地区PPNG耐药以染色体介导为主，为340bp的penA基因介导，2005和2007年PPNG耐药以质粒介导为主，为535bp的TEM基因介导。5．2004-2008年间成都地区TRNG耐药以质粒介导为主，主要为501bp的tetM基因介导。6．2004年-2008年间成都地区CPNG耐药均为染色体介导，主要为380bp的gyrA基因介导。7．2004年-2008年成都地区PPNG流行质粒谱为535bp，TRNG流行质粒谱为501bp+700bp和501bp。8．2004-2008年间PPNG耐药质粒均为亚洲型质粒，未见非洲型和多伦多型。9．本实验证实，CPNG的耐药机制主要为染色体介导，与国内外报道基本一致。

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