摘要：目的:运用双定点基因突变的方法重组HIF-1α,转染干细胞并抑制其凋亡,提高治疗缺血性心肌病的效果,并进一步探讨其机理。rn 方法:健康梅山猪的骨髓MSCs分离纯化后,流式细胞仪检测细胞周期。构建低氧诱导因子-1α(hypoxia inducible factor-1,HIF-1α)真核表达载体pcDNA3.1+-HIF-1α的突变体pcDNA3.1+-GCA-HIF-1α-GCC,并用慢病毒包装。对转染细胞进行表达分析。以慢病毒包装系统(pPACKH1-Lentivector PackagingKit)介导的GCA-HI-1α-GCC基因转染猪MSCs,检测转GCA-HIF-1α-GCC基因的骨髓干细胞和原代细胞、转慢病毒空载体细胞的凋亡情况。将健康梅山猪(24只)随机分成4组(空白组、DMEM组、MSCs组和转基因组),应用明胶海绵栓塞冠状动脉左前降支(LAD)建立心梗模型。8周后评估心功能。各组注射液经心导管注射到LAD栓塞处远端。分别于注射后1周、2周、4周、6周和8周,行评估心功能和活体内干细胞标记情况,检测血浆BNP、VEGF在梗死后和移植前后的变化;组织学观察各组移植细胞的情况,测算心梗面积,以及检测过氧化酶体增殖物激活型受体α(peroxisomeproliferatoractivated receptor α,PPARα)、原位杂交检测AKT蛋白表达。rn 结果:转染MSCs 48小时后,可检测到强荧光出现。Western blot免疫印迹技术表明HIF-1α蛋白表达产物的分子量与已知分子量相符。转GCA-HIF-1α-GCC基因的MSC的凋亡率明显降低。Western blot表明转基因的MSCs,HO-1蛋白表达增高而Bax表达降低。移植前,梗死心脏的左室舒张末径(EDWT)增加,每搏量(SV)明显下降,血流动力学LVDP、±dp/dt-max下降明显。移植后,C、D组的心功能较移植前有改善(P<0.05);与A、B两组和移植前相比,梗死区的收缩功能和血流灌注均有所改善(P<0.05),移植组的心梗面积缩小(P<0.05);D组更为明显(与C组比较,P<0.05)。与A、B和C组相比,D组PPARα、AKT蛋白表达明显增加(P<0.05)。D组的增加比C组显著。与A、B两组相比,C、D组梗死区的毛细血管密度明显增加(P<0.05),D组的增加比C组显著,同样比较,BNP降低明显(P<0.05),D组的降低比C组显著。C、D组VEGF的水平在梗死后有所增加,在细胞移植后一周出现高峰,后逐渐下降。rn 结论:使用携带目的基因GCA-HIF-1α-GCC的慢病毒系统转染猪的骨髓干细胞可使其稳定表达HIF-1α。转GCA-HIF-1α-GCC的MSCs在体外较MSCs更能耐受缺氧和乏营养所诱发的凋亡,其原因与HIF-1α稳定表达促使干细胞分泌HO-1抑制Bax有关。MSCs能在宿主心肌组织中存活,通过防止梗死区变薄、抑制收缩功能异常而改善左室功能。GCA-HIF-1α-GCC转染MSCs可以使移植的干细胞更能耐受移植早期的缺氧和乏营养的微环境,减少细胞的凋亡,增加参与心肌修复的干细胞的绝对数量,从而可更加显著改善心脏功能,PPAR、AKT在其中起非常重要的作用。应用GCA-HIF-1α-GCC基因和MSCs自体移植是治疗缺血性心肌病的一种有效的方法。
