辣椒红中十二种拟除虫菊酯类农残的检测方法

技术领域

本发明涉及一种食品添加剂中农残的检测方法，尤其是一种辣椒红中十二种拟除虫菊酯类农残的检测方法。

背景技术

辣椒红是以红辣椒果实为原料,萃取而制得的深红色油状液体色素，是一种具有营养强化功效的天然着色剂，其主要成分为类胡萝卜素。由于天然色素食用安全性高，且具有生理活性，辣椒红越来越受到人们的青睐。

辣椒是辣椒红生产的原料，为保障和促进辣椒的正常生长，农户会施用杀虫、杀菌、杀灭有害动物（或杂草）的各类农药，致使辣椒中普遍存在农药残留。这些农药残留在辣椒的提取加工过程中不断浓缩富集，导致辣椒红等提取物产品存在安全隐患。

辣椒及辣椒提取物中的主要残留农药之一是拟除虫菊酯类农药。拟除虫菊酯类农药具有高效、广谱、相对低毒和生物降解等特性，较之有机氯、有机磷类农药具有更高的杀虫效力，而且用量少，对人毒害小，所以在全球范围内广泛应用。但经研究表明，拟除虫菊酯类农药有蓄积毒性，长期低剂量接触也会引起慢性疾病。因此，各国越来越重视对该类农药在农副产品中残留的监控。为了保证食品添加剂辣椒红的食用安全，提高我国食品安全监管水平，保障公民身体健康，促进辣椒红产业的发展，研究一种准确、快速、灵敏的辣椒红中拟除虫菊酯类农残的检测方法对于监测和检验辣椒红的安全生产具有十分重要的意义。

目前，有关拟除虫菊酯类农药残留的检测方法已有许多，包括高效液相色谱－质谱法、气相色谱－质谱法、气相色谱法和气相色谱－串联质谱法等。其中对烟草、茶叶、水果和蔬菜等食品中拟除虫菊酯类农药残留的研究报道较多，而对于食品添加剂辣椒红中拟除虫菊酯类农药残留检测的研究尚未见报道。因为辣椒红中含有大量的色素，基质复杂，所以直接使用上述食品中拟除虫菊酯类的检测方法，基质干扰很大，无法实现有效检测。因此，针对辣椒红特性，专门开发适用于辣椒红中多种拟除虫菊酯类农残检测的方法非常关键。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种快速、准确的辣椒红中十二种拟除虫菊酯类农残的检测方法。

为解决上述技术问题，本发明所采取的技术方案是：辣椒红用萃取溶剂进行超声萃取，然后将萃取液分离得到上层清液；所述的上层清液采用凝胶渗透色谱净化，收集目标洗脱液浓缩至干，再用有机溶剂定容，得到样品溶液；所述的样品溶液采用气相色谱－串联质谱在选择离子监测模式下进行测定，外标法定量。

本发明所述的萃取溶剂为体积比50:50的环己烷和乙酸乙酯混合溶剂；所述的有机溶剂为二氯甲烷、环己烷、异丙醚、正己烷或丙酮。所述凝胶渗透色谱净化的流动相为体积比为50:50的环己烷和乙酸乙酯混合溶剂；所述流动相的流速为5.0mL/min，收集时间为9.0～13.0min。

本发明所述气相色谱条件为：色谱柱为弱极性石英毛细管柱，进样口温度250～300℃，传输线温度250～300℃，进样量为1.0～5.0μL，载气流速为0.5～1.2mL/min。所述弱极性石英毛细管柱选用HP-5 MS石英毛细管柱、HP-17 MS石英毛细管柱或者HP-5 DS石英毛细管柱；规格为长度30m，内径0.25mm，膜厚0.25μm。

本发明所述气相色谱的程序升温条件为：初始温度80℃，保持1min；以20℃/min速率升温至200℃，保持10min；再以20℃/min速率升温至260℃，保持15min。

本发明所述质谱检测条件为：离子源温度为230℃，溶剂延迟时间为3.0～11.0min。

本发明所述选择离子监测模式为：联苯菊酯监测离子为181^*,166,165；甲氰菊酯监测离子为265^*,208,181；高效氟氯氰菊酯监测离子为208^*,197,181；氟丙菊酯监测离子为289^*,247,208,181；氯菊酯监测离子为184^*,183,165,163；氟氯氰菊酯监测离子为226^*,206,199,163；氯氰菊酯监测离子为208^*,181,165,163；氟硅菊酯监测离子为286^*,258,179；氰戊菊酯监测离子为225^*,181,167,152,125；S-氰戊菊酯监测离子为225^*,181,167,152,125；氟胺氰菊酯监测离子为281^*,250,181；溴氰菊酯监测离子为281^*,253,209,181。

本发明所述超声萃取时间为10～30min，次数为1～3次；所述萃取液采用高速冷冻离心机进行离心分离；高速冷冻离心机转速为4000～10000r/min，离心时间为5～10min；所述目标洗脱液采用旋转蒸发仪或自动氮吹仪进行浓缩。

本发明所述辣椒红用量为0.5～1.5g，所述萃取溶剂的用量为10～25mL，所述有机溶剂的定容体积为1.0～5.0mL。

采用上述技术方案所产生的有益效果在于：凝胶渗透色谱（GPC）是一种根据溶质分子大小进行分离的色谱技术，能够去除样品中大量的油脂及色素，具有快速高效、节省溶剂、易自动化等优点。气相色谱-串联质谱选择离子监测模式检测技术，准确度高。本发明采用GPC净化技术对辣椒红样品进行处理，结合气相色谱-串联质谱选择离子监测模式检测技术，建立了一种适用于辣椒红中十二种拟除虫菊酯类农残检测的方法。

本发明采用GPC技术处理辣椒红，去除了绝大部分大分子色素类物质，极大地降低了样品基质对十二种拟除虫菊酯类农残测定的干扰，检测方法准确性高，对辣椒红适用性强；本发明采用GPC技术结合气相色谱-串联质谱选择离子监测模式检测，方法灵敏度高，整个流程自动化程度高，简便，快速，易于实现大批量样品检测；本发明GPC净化处理过程中产生的废液可以回收处理，重复使用，降低了检测成本，减少了环境污染。

附图说明

下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步详细的说明。

图1是本发明十二种拟除虫菊酯类农药化合物标准物质的气相色谱-质谱选择离子(SIM)监测色谱图。

具体实施方式

本辣椒红中十二种拟除虫菊酯类农残的检测方法采用下述设备和试验条件：Agilent 7890A GC系统，色谱柱选择HP-5 MS石英毛细管柱、HP-17 MS石英毛细管柱和HP-5 DS石英毛细管柱；Agilent 7000 GC/MS/MS三重四级杆质谱检测；Lab Tech Cleanup800凝胶渗透色谱仪，配300mm×25mm BIO-Beads S-X3填料的净化柱；所用试剂均为色谱纯；气相色谱程序升温条件为：初始温度80℃，保持1min；以20℃/min速率升温至200℃，保持10min；再以20℃/min速率升温至260℃，保持15min；质谱检测，监测模式为选择离子监测模式。计算机系统记录色谱图，以峰面积作为信号响应值，对十二种拟除虫菊酯类农残进行定性定量分析。其中，联苯菊酯监测离子为181^*,166,165；甲氰菊酯监测离子为265^*,208,181；高效氟氯氰菊酯监测离子为208^*,197,181；氟丙菊酯监测离子为289^*,247,208,181；氯菊酯监测离子为184^*,183,165,163；氟氯氰菊酯监测离子为226^*,206,199,163；氯氰菊酯监测离子为208^*,181,165,163；氟硅菊酯监测离子为286^*,258,179；氰戊菊酯监测离子为225^*,181,167,152,125；S-氰戊菊酯监测离子为225^*,181,167,152,125；氟胺氰菊酯监测离子为281^*,250,181；溴氰菊酯监测离子为281^*,253,209,181。

实施例1：本辣椒红中十二种拟除虫菊酯类农残的检测方法具体实施步骤如下所述：

（1）标准曲线：分别精密量取十二种拟除虫菊酯类农残标准储备液适量，用Fisher色谱纯正己烷逐级稀释成质量浓度分别为0.01、0.05、0.1、0.2、0.5、1.0mg/L的系列标准溶液，按上述试验条件进样测定，分别以十二种拟除虫菊酯类农残的峰面积Y对其质量浓度X作图。

（2）样品提取：准确称取1.0g（精确至0.0001g）                                                =200辣椒红样品于25mL容量瓶中，加入12.5mL体积比为50:50的环己烷-乙酸乙酯混合溶剂，超声15min，次数2次，冷却至室温，加入体积比为50:50的环己烷-乙酸乙酯混合溶剂定容。萃取液转移至离心管中，5℃下以8000r/min的转速离心5min，取上层清液用0.45μm滤膜过滤，滤液转移至GPC上样瓶中。

（3）GPC净化处理：GPC检测波长为254nm，流动相为体积比50:50的环己烷-乙酸乙酯混合溶剂，流速为5.0mL/min。上样2.0mL进GPC净化处理，收集9.0～13.0min的流出液，使用旋转蒸发仪于40℃浓缩至干，用丙酮超声溶解定容至5.0mL，溶液用0.22μm滤膜过滤后进样测定。

（4）气相色谱-串联质谱检测：选取HP-5 MS石英毛细管柱，程序升温，进样口温度260℃，传输线温度260℃，载气流速为1.2mL/min，进样量2.0μL，选择离子监测模式，离子源温度为230℃，溶剂延迟11.0min。气相色谱-串联质谱检测十二种拟除虫菊酯类农残的色谱图如图1所示，图1中十二种拟除虫菊酯类农药化合物的出峰顺序依次为：联苯菊酯、甲氰菊酯、高效氟氯氰菊酯、氟丙菊酯、氯菊酯、氟氯氰菊酯、氯氰菊酯、氟硅菊酯、氰戊菊酯、S-氰戊菊酯、氟胺氰菊酯、溴氰菊酯。

（5）平行测定：采用外标法定量，对=200辣椒红样品做3个平行样，试验编号为A、B、C，分别计算十二种拟除虫菊酯类农残的平行性相对标准偏差，分析结果见表1；对其中一个样品重复测定五次，分别计算十二种拟除虫菊酯类农残的精密度，分析结果见表2。

（6）加标回收率：将步骤（1）中的标准溶液加入到已知拟除虫菊酯类农残含量的=200辣椒红中，按照上述步骤进行实验，对该样品连续做10次平行测定，取平均值，计算加标回收率，实验结果见表3。

综上所述，本方法完全适用于=200辣椒红中十二种拟除虫菊酯类农残的检测。

实施例2：本辣椒红中十二种拟除虫菊酯类农残的检测方法具体实施步骤如下所述：

（1）标准曲线：与实施例1相同。

（2）样品提取：准确称取0.5g（精确至0.0001g）的=50辣椒红样品于10mL容量瓶中，加入10mL体积比为50:50的环己烷-乙酸乙酯混合溶剂，超声10min，冷却至室温，加入体积比为50:50的环己烷-乙酸乙酯混合溶剂定容。萃取液转移至离心管中，5℃下以4000r/min的转速离心5min，取上层清液用0.45μm滤膜过滤，滤液转移至GPC上样瓶中。

（3）GPC净化处理：GPC检测波长为254nm，流动相为体积比50:50的环己烷-乙酸乙酯混合溶剂，流速为5.0mL/min。上样2.0mL进GPC净化处理，收集9.0～13.0min的流出液，使用旋转蒸发仪于40℃浓缩至干，用异丙醚超声溶解定容至2.0mL，溶液用0.22μm滤膜过滤后进样测定。

（4）气相色谱-串联质谱检测：选取HP-17 MS石英毛细管柱，程序升温，进样口温度250℃，传输线温度250℃，载气流速为1.0mL/min，进样量1.0μL，选择离子监测模式，离子源温度为230℃，溶剂延迟8.0min。

（5）平行测定：采用外标法定量，对=50辣椒红样品做3个平行样，试验编号为A、B、C，分别计算十二种拟除虫菊酯类农残的平行性相对标准偏差，得联苯菊酯1.1%、甲氰菊酯2.6%、高效氟氯氰菊酯1.7%、氟丙菊酯5.7%、氯菊酯4.2%、氟氯氰菊酯3.9%、氯氰菊酯5.2%、氟硅菊酯7.9%、氰戊菊酯3.4%、S-氰戊菊酯1.2%、氟胺氰菊酯5.0%、溴氰菊酯4.6%。对其中一个样品重复测定五次，分别计算十二种拟除虫菊酯类农残的精密度，得联苯菊酯1.3%、甲氰菊酯2.1%、高效氟氯氰菊酯1.9%、氟丙菊酯5.1%、氯菊酯2.3%、氟氯氰菊酯4.4%、氯氰菊酯5.4%、氟硅菊酯1.8%、氰戊菊酯8.3%、S-氰戊菊酯2.8%、氟胺氰菊酯6.0%和溴氰菊酯6.2%。

（6）加标回收率：将步骤（1）中的标准溶液加入到已知十二种拟除虫菊酯类农残含量的=50辣椒红中，按照上述步骤进行实验，对该样品连续做10次平行测定，取平均值，计算加标回收率，得联苯菊酯85～105%、甲氰菊酯80～96%、高效氟氯氰菊酯90～110%、氟丙菊酯80～100%、氯菊酯89～106%、氟氯氰菊酯92～110%、氯氰菊酯79～103%、氟硅菊酯94～106%、氰戊菊酯83～110%、S-氰戊菊酯80～105%、氟胺氰菊酯86～110%和溴氰菊酯85～95%。

综上，本方法适用于=50辣椒红中十二种拟除虫菊酯类农残的检测。

实施例3：本辣椒红中十二种拟除虫菊酯类农残的检测方法具体实施步骤如下所述：

（1）标准曲线：与实施例1相同。

（2）样品提取：准确称取1.5g（精确至0.0001g）的=50辣椒红样品于25mL容量瓶中，加入25mL体积比为50:50的环己烷-乙酸乙酯混合溶剂，超声30min，次数3次，冷却至室温，加入体积比为50:50的环己烷-乙酸乙酯混合溶剂定容。萃取液转移至离心管中，5℃下以10000r/min的转速离心10min，取上层清液用0.45μm滤膜过滤，滤液转移至GPC上样瓶中。

（3）GPC净化处理：GPC检测波长为254nm，流动相为体积比50:50的环己烷-乙酸乙酯混合溶剂，流速为5.0mL/min。上样2.0mL进GPC净化处理，收集9.0～13.0min的流出液，使用旋转蒸发仪于40℃浓缩至干，用正己烷超声溶解定容至1.0mL，溶液用0.22μm滤膜过滤后进样测定。

（4）气相色谱-串联质谱检测：选取HP-5 DS石英毛细管柱，程序升温，进样口温度300℃，传输线温度300℃，载气流速为0.5mL/min，进样量5.0μL，选择离子监测模式，离子源温度为230℃，溶剂延迟3.0min。

（5）平行测定：采用外标法定量，对=50辣椒红样品做3个平行样，试验编号为A、B、C，分别计算十二种拟除虫菊酯类农残的平行性相对标准偏差，得联苯菊酯1.1%、甲氰菊酯2.3%、高效氟氯氰菊酯1.2%、氟丙菊酯5.8%、氯菊酯4.6%、氟氯氰菊酯3.0%、氯氰菊酯6.0%、氟硅菊酯6.2%、氰戊菊酯3.2%、S-氰戊菊酯1.3%、氟胺氰菊酯5.7%和溴氰菊酯1.0%。对其中一个样品重复测定五次，分别计算十二种菊酯类农残的精密度，得联苯菊酯1.5%、甲氰菊酯2.8%、高效氟氯氰菊酯1.2%、氟丙菊酯5.7%、氯菊酯2.4%、氟氯氰菊酯4.8%、氯氰菊酯5.1%、氟硅菊酯1.2%、氰戊菊酯8.5%、S-氰戊菊酯2.1%、氟胺氰菊酯2.6%和溴氰菊酯6.6%。

（6）加标回收率：将步骤（1）中的标准溶液加入到已知十二种拟除虫菊酯类农残含量的=50辣椒红中，按照上述步骤进行实验，对该样品连续做10次平行测定，取平均值，计算加标回收率，得联苯菊酯82～106%、甲氰菊酯80～101%、高效氟氯氰菊酯87～105%、氟丙菊酯80～106%、氯菊酯85～110%、氟氯氰菊酯84～110%、氯氰菊酯86～105%、氟硅菊酯92～107%、氰戊菊酯81～111%、S-氰戊菊酯85～102%、氟胺氰菊酯91～112%和溴氰菊酯90～105%。

本检测方法中用于定容的二氯甲烷、环己烷、异丙醚、正己烷和丙酮均可以溶解十二种拟除虫菊酯类农药，因此上述溶剂均可用于定容以得到样品溶液，且不影响气相色谱－串联质谱在选择离子监测模式下的测定。