摘要：
[背景]副猪嗜血杆菌(Haemophilusparasuis,HPS)是猪革拉瑟氏病(Glasser's Disease)的病原体,抗生素治疗和疫苗接种对于防控该病效果不明显,建立快速、准确的抗体检测方法尤为重要.[目的]利用表达纯化的HPS转铁结合蛋白A(TbpA)建立检测HPS抗体的间接酶联免疫吸附试验(ELISA)方法.[方法]PCR扩增HPS的tbpA基因并与原核表达载体pET-SUMO连接,通过PCR、双酶切及测序鉴定,将阳性重组质粒转入Escherichia coli Rosetta(DE3),IPTG诱导表达,SDS-PAGE和Western Blot鉴定产物.以纯化的TbpA蛋白作包被抗原,通过各种反应条件优化,建立检测HPS抗体的间接ELISA方法,并进行临床应用与评价.[结果]该方法的最佳条件:包被抗原浓度为5 μg/mL,4°C过夜;5％脱脂奶粉于37°C封闭2 h;血清稀释度为1∶1 600,37°C孵育45 min;酶标二抗稀释度为1∶5 000,37°C作用30 min;显色时间为37°C5 min.该方法可特异性检测HPS抗体,阳性血清稀释至1∶12 800仍可检出,与其他猪病原阳性血清均无交叉反应,批内及批间变异系数均小于10％,与全菌体包被间接ELISA、商品化ELISA试剂盒及Western Blot比较,该方法总符合率分别为90.00％、86.67％和90.00％,其中阳性符合率分别为90.38％、88.46％和92.00％,阴性符合率分别为87.50％、75.00％和80.00％.该方法检测免疫抗体阳性率为80.00％,感染抗体阳性率为19.50％.[结论]基于TbpA蛋白建立的HPS抗体间接ELISA检测方法,具有良好的特异性、敏感性和重复性以及临床应用的可靠性,为HPS的免疫监测和流行病学调查提供了技术手段.
