高通量药物筛选

摘要： 目的利用在大肠杆菌体系中诱导表达的人源NMNAT1蛋白筛选其抑制剂,寻找治疗肿瘤的新药物。方法利用酶切连接体系将人源NMNAT1插入pET21b(+)载体,将重组质粒转化入大肠杆菌BL21(DE3)菌株过表达蛋白,对重组蛋白进行纯化,通过3段式酶联荧光法在2280种天然化合物中筛选具有抑制NMNAT1活性的化合物,并在细胞水平验证其对肿瘤细胞的杀伤效果。结果纯化得到较高纯度和活性的人重组NMNAT1蛋白;筛选出6种高效的NMNAT1抑制剂;其中一种抑制剂fraxetin能降低乳腺癌细胞NAD+含量,促进细胞凋亡,与敲低NMNAT1后转录组测序(RNA-seq)分析得出的细胞凋亡通路增强一致。结论Fraxetin是NMNAT1强效抑制剂,能够促进乳腺癌细胞凋亡。

摘要： 目的:为了解决传统微孔板中线虫毒理实验的试剂消耗量大、人工操作烦琐等问题,搭建半自动化微流控实验平台,进行秀丽隐杆线虫(Caenorhabditis elegans,简称线虫)药物毒性试验.方法:设计并使用MEMS技术制作了一种类桥式微流控芯片,并基于该芯片搭建了一个半自动化微流控平台.以一种有机磷农药久效磷(MCP)作为工具药物,考察平台对于毒性评价研究的可行性.结果:该芯片可将有限条的线虫限制于微流控芯片腔室内而不影响其正常生长运动,由于对腔室的高度做了限制,减少了线虫在Z轴方向上重叠的情况,便于后续的观察和图像处理.基于芯片的微流控平台可以半自动换液以维持药物浓度稳定,并半自动化地保存视频信息.经测试,此微流控平台可实现线虫进样和片上长期培养,结果与传统微孔板培养体系无差异;芯片内毒性测试结果显示MCP对线虫具有明显的生长发育毒性和神经毒性,与经典线虫毒性实验的结果基本一致,表明其可用于药物和线虫相互作用研究.结论:该研制平台的优势在于能实现定时半自动化换液,试剂消耗量与传统微孔板试验相比减少约50％,且便于图像分析线虫生理信息,后期可应用于药物高通量筛选和大量复杂环境化学物的复合暴露毒性测试.

摘要： 目的 对人β位点裂解酶-1(BACE1)基因核心启动子进行克隆,构建携带BACEI基因启动子的荧光素酶报告载体,筛选稳定表达细胞株并分析其转录活性.方法 提取人胚肾HEK293细胞基因组DNA,以其为模板,PCR扩增BACE1核心启动子(-691～+67)并克隆至荧光素酶报告载体pGL4.21中,构建BACE1基因启动子荧光素酶报告载体pGL4.21-BACE1,将其转染HEK293细胞(无启动子的pGL4.21载体作阴性对照),利用嘌呤霉素筛选稳定表达株后检测其转录活性.结果 成功扩增到758 bp的BACE1核心启动子,pGL4.21-BACE1载体经双酶切鉴定正确;HEK293细胞被该载体转染后经嘌呤霉素筛选得到6株稳定表达BACE1启动子的细胞株,其转录活性分别是对照组(HEK293/pGL4.21)的(134.7±22.3)、(634.0±13.9)、(437.6±6.1)、(805.5±5.5)、(492.8±59.1)、(1 021.1±46.6)倍(P=0.001).结论 成功构建了人BACE1基因启动子荧光素酶报告载体.

摘要： 目的 构建携带adam10基因启动子的荧光素酶报告载体,筛选稳定表达细胞系并分析其活性.方法 提取人神经母细胞瘤细胞(SH-SY5Y细胞)基因组DNA,以其为模板,PCR扩增adam10基因启动子并克隆至荧光素酶报告载体pGL4.17中,构建adam10基因启动子荧光素酶报告载体pGL4.17-adam10,将其转染SH-SY5Y细胞(无启动子的pGL4.17载体作阴性对照,带有CMV启动子的pGL4.51载体作阳性对照),经G418进行稳定表达株的筛选,用1μmol/L维甲酸处理细胞4d后检测其荧光活性.结果 成功扩增到438 bp的adam10基因启动子,pGL4.17-adam10经PCR和双酶切鉴定均正确.SH-SY5Y细胞被该载体转染后经G418筛选得到稳定表达adam10基因启动子的细胞株,经检测具有较强的转录活性;1μmol/L雏甲酸能诱导adam10基因启动子高效表达.结论 成功构建了人adam10基因启动子荧光素酶报告载体,adam10基因启动子在SH-SY5Y细胞中能稳定表达,为深入研究adam10基因的表达调控、多态性分析及其高通量药物筛选提供基础.%Objective To construct the luciferase report vector carrying a disintegrin and metalloprotease 10(adam10) gene promoter,to screen its stable expression cell line and to analyze its activity.Methods The genome DNA of human neuroblastoma SH-SY5Y cells was extracted as the template.The adam10 gene promoter was amplified by PCR and was cloned into luciferase reporter vector pGL4.17.The adam10 gene promoter luciferase reporter vector pGL4.17-adam10 was constructed and transfected in to SH-SY5Y cells(pGL4.17 vector without promotoer as the negative control and pGL4.17 vector with CMV promoter as the positive control).Then the stable expression cell line was screened by G418 and its fluorescence activity was detect after treating with 1 tμmol/L retinoic acid(RA) for 4 d.Results About 438 bp adam10 gene promoter was successfully amplified by PCR.The pGL4.17-adam10 vector was correct by pCR and double enzyme digestion identification.The cell line stably expressing adam10 gene promoter was obtained after transfecting SH-SY5Y cells by this vector and screening by G418,which had stronger transcriptional activity by detection;1 μmol/L RA could induce high efficiency expression of adam10 gene promoter.Conclusion Human adam10 gene promoter luciferase vector is successfully constructed.adam10 gene promoter can be stably expressed in SH-SY5Y cells,which provides a basis for deeply studying adam10 gene expression regulation,polymorphism analysis and high-throughput drug screening.

摘要： 为了有效筛选潜在的抗肝纤维化药物,本实验室建立了基于COL1A1启动子的高通量筛选细胞模型.该细胞模型在TGF-β1的刺激下,激活COLlA1启动子及荧光素酶报告基因的表达,而该激活作用可以被候选化合物抑制.作者首先构建COL1A1启动子和荧光素酶报告载体pGL4.17的重组质粒.采用双荧光素酶报告基因检测系统对该启动子的活性进行检测,发现重组质粒比对照组荧光素酶活性高15.98倍.该质粒转染到人肝星状细胞株LX2中,用无限稀释法得到单克隆细胞株,并利用活体成像仪筛选出稳定表达COL1A1启动子的单克隆细胞株LX2-COL.经TGF-β1诱导后检测该单克隆细胞株LX2-COL对候选化合物(S1～S7)的反应性,其中S7对启动子活性抑制作用最强.Real-time RT-PCR和Western blotting验证了经该细胞模型筛选得到的化合物S7能够抑制Ⅰ型胶原mRNA和蛋白水平的表达.结果表明,该细胞模型的建立能够实现对潜在的抗肝纤维化化合物的高通量筛选.

摘要： With the continuous development of modern chemistry, biology and pharmacy, researches on TCM modernization has witnessed a wide range of application of related modern technology, especially in researches of TCM monomer efficacy and pharmacokinetics. This can provide basis to internationalization of traditional Chinese medicine. The current research focus is how to obtain targeted TCM monomer. This article expounded the screening methods for TCM monomer at home and abroad, the principles of screening, the limitation and meanings.%随着现代化学、生物学及药学等领域日新月异的进步，相关现代技术在中药现代化的研究中得到了广泛的应用，特别是对中药单体的药效和药代研究的进展，为中药走向国际提供了基础。如何获得目的中药单体成为目前研发的热点和焦点。本文就目前国内外有关中药单体的筛选方法、不同筛选类型原理、局限性及意义进行了阐述。

摘要： 流感病毒的PAN蛋白高度保守,并且具有核酸内切酶活性,是抗流感药物研发的潜在靶点.通过高通量药物筛选体系,从372种化合物中筛选出3种对流感病毒H5N1的PAN蛋白抑制作用较好的化合物.将这3种化合物分别与PAN蛋白进行分子对接模拟,结果显示它们均可以与PAN蛋白活性位点的二价金属离子和氨基酸残基相互作用,从而为抗流感病毒药物的发现提供了先导化合物.

摘要： 蛋白片段互补分析技术是近年发展起来的一种分析蛋白质-蛋白质相互作用的新方法.典型的蛋白片段互补分析技术已经成功地利用二氢叶酸还原酶,β-内酰胺酶,绿色荧光蛋白以及荧光素酶片段互补进行胞内蛋白分子相互作用研究.这一技术不仅可以动态、定位分析细胞内蛋白质分子相互作用、绘制细胞内信号传导、蛋白质生物化学网络,还可以应用到蛋白质文库、cDNA文库和高通量药物筛选等.综述了蛋白片段互补分析技术的原理、方法及其应用.

摘要： Chinese herbal formula is valuable properly of tradilional Chinese medicine, multi-com-ponenl and multi-target are the advantages and features. However, due to the complex ingredienls of Chinese herbal formula, mechanism of aclion is unclear and the dose-effect relationships lack the scientific data to support, all these seriously hampers the process of modernizalion and inlernalionalizalion of Iraditional Chinese medicine. Aclive ingredient group of Chinese herbal formula means all the pharmacologically aclive in-gredient closely relaled to the clinical therapeulic purposes. With the concept of the aclive ingredient group of tradilional Chinese medicine proposed, this field has become an increasing concern. The article reviewed the basic principles and research in recenl years, mainly introducing the application of the compound group analysis, fingerprint analysis, drug melabolism and pharmacokinelics and high-throughput screening technology in the study of active ingredient group. This not only helps to provide ideas and technical reference for the de-velopment of new drugs by promoling the inheritance and development of the national drug , while also con-tribute lo the modernization of Chinese medicine and process to the world.%中药复方是中医学中的宝贵财富,多成分、多靶点是其优势和特色所在.但由于中药复方成分复杂,作用机理不清,量-效关系缺乏科学的数据支持,严重阻碍了中医药的现代化和国际化进程.中药复方有效成分组是指中药复方中与该复方临床治疗目的 密切相关的所有药理活性成分.随着有效成分组概念的提出,中药复方的有效成分组研究日益受到人们的关注.本文对中药复方有效成分组的基本原理和近几年开展的相关研究方法进行了综述,主要介绍了化合物群分析法,指纹图谱分析,药代动力学,高通量药物筛选等技术在中药复方有效成分组研究中的应用,这不仅有助于推动民族药物的继承和发展,为新药开发提供思路和技术上的参考,同时也有助于促进中医药现代化并最终走向世界.

摘要： 传统民族药物大复方药味多、成分复杂,药效物质基础难以阐释.为了解决民族药物大复方的研究难题,本课题组利用高通量制备技术建立全组分样品库,利用二苯基三硝基苯肼自由基清除、原代神经元缺糖缺氧/复供损伤保护等高通量药物筛选模型确定了白脉散抗脑卒中有效成分组(BMECG),进而利用MCAO/R模型对BMECG的活性行了研究,旨在为创新药物开发提供关键资料.最后探讨了快速制备技术和高通量药物筛选技术对于大复方有效成分组研究的意义.本文的研究思路有助于推动民族大复方现代化,有助于促进具有自主知识产权创新药物的出现.%Traditional large compound prescription of ethnodrug has been charactered with multiple and complex components and the efficacious substance basis of drugs difficult to be cleared. In order to solve difficulty in ethnic precriptions research and provide pivotal materials for the development of innovative drugs, our team has taken advantage of high-throughput technology on the rapid preparation of compound prescriptions and built the multi-component library, as well as use the high-throughput screening model, including free radical scavenging and the protective effects on neuronal injury induced by OGD/R, to confirm the active ingredient groups of Baimaisan prescription, which is described as BMECG. Finally, we will evaluate the great significance of rapid preparation and high-throughput screening technology in researching active ingredient groups of ethnic-medicine compound prescriptions. Our research methods, in this paper, conduce to promote the modernization of compound prescriptions and lead to the emergence of innovative medicines with self-dominated intellectual property right

摘要： 高通量药物筛选(HTS)自20世纪后期出现以来,经过十余年的实践和研究,技术取得长足进步,使国际新药研究的模式发生了巨大改变,已经成为国际主要制药公司新药发现的主要技术手段.随着高通量药物筛选技术的不断发展和广泛应用,出现了大量针对药物发现的新技术、新方法、新策略以及与高通量药物筛选相关的仪器设备、试剂材料等.这些新技术方法材料以及仪器设备的出现,极大促进了高通量药物筛选的发展和新药发现的进程.同时,高通量药物筛选技术的广泛应用,也出现了许多新的问题,人们开始冷静地对待高通量筛选技术存在的问题,寻找解决的方法和方案,促进高通量药物筛选工作的发展.本文对研究进展做简单综述.

摘要： 本文根据应用新技术新方法的初步实践和在中药研究工作中的尝试,简要介绍中药现代化研究的相关问题以及高通量药物筛选技术在中药现代化研究中的应用特点及前景.

摘要： 小分子微阵列,具有高通量、高灵敏度和高特异性等突出优点,在高通量药物筛选中具有广泛的应用前景.能够将尽可能多种类的小分子高效率地固定在基片表面的小分子微阵列,是获得高质量筛选结果的前提与基础.采用苯基异氰酸酯修饰的玻璃基片点印小分子微阵列并对其在45oC条件下进行后处理的新型表面处理方法不但能够固定具有亲核基团的小分子,并且对中等活性和弱活性的亲核基团具有较高的固定效率.制备了包含3375种生物活性分子的小分子微阵列,该微阵列的自体荧光结果以及链霉亲和素的筛选结果表明,新型的制备方法能够高效率地固定任意具有亲核基团的多种类别的小分子,这将为高通量药物筛选提供高效率的、高质量的筛选平台.

摘要： 神经退行性疾病的致病机制已经部分理解但还不是全部，在这种情况下一般的高通量模型和常规的化学药开发方式有着非常大的局限性，导致迄今没有能够开发出治疗性药物;而直接使用动物模型进行筛选的药物开发方式有极高的可行性，可能会取得重大突破。

摘要： 新药研发是一项周期长、投资大、高风险的研究项目，目前已逐渐走上了靶标发现、先导物筛选(活性、ADME/T)及优化并行的良性循环轨道。由于组合化学库的出现，分子生物学、细胞生物学等与生物医药相关的学科及现代分析手段的迅速发展，出现了高通量药物筛选(HTS)体系。当前HTS已经被广泛应用于候选化合物生物活性的筛选。而如何提高化合物合成筛选的命中率与新药研发的成功率已成为最大关注的课题。现就ADME in silico预测在新药研发中的应用进行探讨。

摘要： 本发明公开了一种电动转盘系统，该电动转盘系统包括带有驱动电机的底座和设置在底座上的转盘，所述转盘上分布有多个板状卡槽。本发明还提供一种微藻高通量筛选装置和一种微藻的高通量筛选方法，该方法包括，将生长至对数期的微藻接种于微孔板的培养基中，然后将接种微藻的该微孔板固定于上述的电动转盘系统的板状卡槽中，并在转动条件下进行光照培养，测量培养后微孔板中每孔的吸光度，将吸光度换算成对应的微藻细胞干重浓度，以此选择所需的微藻。本发明的方法的筛选结果与利用摇瓶在相同培养条件下的筛选结果一致，而本发明的方法有效地减少了藻种筛选所需的设备和人力投入，同时缩短了藻种筛选工作所需的时间。

摘要： 本发明公开了SEQ？ID？NO.1～3任意一项所示的多肽。本发明还公开了以c-Cbl蛋白环状功能域为靶点的潜在药物的高通量筛选系统和筛选方法，筛选系统以包括荧光标记多肽和c-Cbl环状功能域蛋白，二者的摩尔比为1～2:5～30，所述多肽的氨基酸序列如SEQ？ID？NO.1～3任意一项所示。c-Cbl蛋白环状功能域参与了机体能量平衡的调控，是潜在的治疗代谢性相关疾病的药物靶点，本发明方法可以准确、高效地筛选以c-Cbl蛋白环状功能域为靶点的潜在药物，为进一步筛选代谢性相关疾病的药物打下良好的基础，具有良好的工业应用前景。

摘要： 本发明公开了一种构建抗肥胖药物靶点UCP1的基因工程细胞株的方法，同时公开了抗肥胖药物高通量筛选模型的建立及应用。主要涉及利用CRISPR/Cas9系统，设计两条独特的sgRNA，在细胞的UCP1基因N端ATG之后敲入luciferase‑T2A‑tdTomato‑WPRE‑pA，特别是将luciferase和tdTomato敲入永生化棕色脂肪细胞UCP1的基因位点，形成首株在UCP1启动子区域插入luciferase和tdTomato的稳转棕色脂肪细胞株，并将其应用于抗肥胖药物的高通量筛选、抗肥胖药物的评价、机体抗肥胖活性物质的评价以及UCP1检测试剂盒的开发。UCP1是特异性表达于棕色脂肪组织的解偶联蛋白，抵抗肥胖的新靶点，该稳转基因工程细胞株的构建对于应用报告基因和高内涵方法，灵敏、准确、高效地对化合物库进行高通量筛选，获得促进产热、降低体重的抗肥胖药物意义重大。

摘要： 本发明公开了一种电动转盘系统，该电动转盘系统包括带有驱动电机的底座和设置在底座上的转盘，所述转盘上分布有多个板状卡槽。本发明还提供一种微藻高通量筛选装置和一种微藻的高通量筛选方法，该方法包括，将生长至对数期的微藻接种于微孔板的培养基中，然后将接种微藻的该微孔板固定于上述的电动转盘系统的板状卡槽中，并在转动条件下进行光照培养，测量培养后微孔板中每孔的吸光度，将吸光度换算成对应的微藻细胞干重浓度，以此选择所需的微藻。本发明的方法的筛选结果与利用摇瓶在相同培养条件下的筛选结果一致，而本发明的方法有效地减少了藻种筛选所需的设备和人力投入，同时缩短了藻种筛选工作所需的时间。

摘要： 本发明公开了一种基于细胞内蛋白激酶C激活状态筛选药物的方法及高通量筛选装置，该方法包括以下步骤：首先将细胞置于药物筛选芯片上，使细胞直接贴于药物筛选芯片表面后，置于药物筛选装置中，调整偏振光的入射角度为发生表面等离子共振时的角度，此时检测单元中反射光强度为最低；将待筛选药物依次加入上述生物芯片表面，进行检测单元中反射光的强度变化情况的检测，若待筛选药物中存在Gq蛋白偶联受体﹑部分酪氨酸激酶受体或蛋白激酶C等的激动剂，则细胞区域反射进入检测单元的反射光的强度增强。本发明实验准确率更高，先导化合物无需标记，细胞也无需荧光等染色试剂处理，具有操作简便、过程简单、检测时间短、检测成本低等优势。

摘要： 本发明公开了SEQ ID NO.1～3任意一项所示的多肽。本发明还公开了以c-Cbl蛋白环状功能域为靶点的潜在药物的高通量筛选系统和筛选方法，筛选系统以包括荧光标记多肽和c-Cbl环状功能域蛋白，二者的摩尔比为1～2:5～30，所述多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.1～3任意一项所示。c-Cbl蛋白环状功能域参与了机体能量平衡的调控，是潜在的治疗代谢性相关疾病的药物靶点，本发明方法可以准确、高效地筛选以c-Cbl蛋白环状功能域为靶点的潜在药物，为进一步筛选代谢性相关疾病的药物打下良好的基础，具有良好的工业应用前景。

摘要： 本发明公开了一种构建抗肥胖药物靶点UCP1的基因工程细胞株的方法，同时公开了抗肥胖药物高通量筛选模型的建立及应用。主要涉及利用CRISPR/Cas9系统，设计两条独特的sgRNA，在细胞的UCP1基因N端ATG之后敲入luciferase‑T2A‑tdTomato‑WPRE‑pA，特别是将luciferase和tdTomato敲入永生化棕色脂肪细胞UCP1的基因位点，形成首株在UCP1启动子区域插入luciferase和tdTomato的稳转棕色脂肪细胞株，并将其应用于抗肥胖药物的高通量筛选、抗肥胖药物的评价、机体抗肥胖活性物质的评价以及UCP1检测试剂盒的开发。UCP1是特异性表达于棕色脂肪组织的解偶联蛋白，抵抗肥胖的新靶点，该稳转基因工程细胞株的构建对于应用报告基因和高内涵方法，灵敏、准确、高效地对化合物库进行高通量筛选，获得促进产热、降低体重的抗肥胖药物意义重大。

摘要： 本发明涉及一种高通量药物筛选用荧光载体及其制备方法，高通量药物筛选的定量处理系统及筛选质量的智能化判别系统。所述荧光载体材料既具有光学透明性，又具有弱的疏水性表面，适宜作为高通量药物筛选的靶点载体。其制备方法采用一步合成，简单易行。本发明中的对筛选质量的智能化判定系统，应用了化学热力学、动力学及统计学等理论，充分考虑了药物与靶标相互作用的几种形式及靶分子存在的几种状态，具有系统性，更具有实用性。

摘要： 本发明公开了一种基于头颈鳞癌原代细胞的高通量药物筛选方法及抗头颈鳞癌药物，涉及生物医药技术领域。本发明提供的抗头颈鳞癌药物筛选方法，以患者来源的头颈鳞癌原代细胞及多个商品化头颈鳞癌细胞系为载体，高通量筛选已知针对其他适应症的药物，通过测定细胞增殖活性、传统指标(IC50、Emax和AUC)以及生长速率抑制指标(GR50、GRmax和GR

摘要： 本发明公开了一种基于荧光素酶的GPR151孤儿受体配基高通量药物筛选细胞模型及应用，首先将编码SRE荧光素酶的质粒稳定转染到HEK293细胞；再将编码有标签的GPR151和GPR176的质粒分别转染该HEK293细胞，利用抗生素稳定筛选4周得到稳定表达株；本发明可用于对受体的配基筛选，甄别和核实，也可用于其它受体的激动剂和抑制剂的高通量筛选。本发明采用NanoBiT技术，不受于偶联G蛋白类型的限制，具有标签小、灵敏、快捷、可逆和适于高通量筛选等优势。