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高效毛细管电泳分析乳铁蛋白的方法研究

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1引言

1.1乳铁蛋白的特性

1.2乳铁蛋白的来源

1.3乳铁蛋白的功能

1.3.1抑菌活性

1.3.2调节机体免疫系统功能

1.3.3刺激和强化铁吸收

1.3.4促进双歧杆菌生长,调整肠道菌群

1.3.5抗氧化功能

1.4乳铁蛋白的应用

1.4.1乳铁蛋白在婴幼儿配方奶粉中的应用

1.4.2乳铁蛋白在其它方面的应用

1.5乳铁蛋白检测方法

1.6研究的意义和目标

2高效毛细管电泳在酸性分离体系下测定乳铁蛋白

2.1试验部分

2.1.1仪器与试剂

2.1.2缓冲溶液的配制

2.1.3乳铁蛋白标准储备液的配制

2.1.4样品处理

2.1.5电泳条件

2.2结果与讨论

2.2.1分离缓冲液的选择

2.2.2分离缓冲溶液pH值对分离的影响

2.2.3分离缓冲溶液体系对分离的影响

2.2.4分离缓冲液浓度对分离的影响

2.2.5高分子添加剂的选择

2.2.6添加剂PEO 300 000浓度的选择

2.2.7样品介质的优化

2.2.8分离电压的影响

2.2.9进样时间的选择

2.3标准曲线、线性范围、检出限、精密度

2.3.1标准曲线、线性范围和检出限

2.3.2仪器精密度

2.4实际样品测定

2.5结论

3高效毛细管电泳在碱性分离体系下测定原料中乳铁蛋白

3.1试验部分

3.1.1仪器和试剂

3.1.2缓冲溶液的配制

3.1.3乳铁蛋白标准储备液的配制

3.1.4样品预处理

3.1.5电泳条件

3.2结果与讨论

3.2.1缓冲液浓度对分离的影响

3.2.2添加剂种类的选择

3.2.3添加剂SDS浓度的选择

3.2.4添加剂HEC浓度的选择

3.2.5样品提取介质的选择

3.2.6进样时间的选择

3.2.7分离电压的选择

3.3标准曲线、线性范围、检出限、精密度

3.3.1标准曲线、线性范围和检出限

3.3.2仪器精密度

3.4实际样品测定

3.4.1乳铁蛋白原料的测定

3.4.2奶粉样品的测定

3.5结论

4高效毛细管电泳在碱性体系下测定乳制品中乳铁蛋白

4.1试验部分

4.1.1仪器和试剂

4.1.2缓冲溶液的配制

4.1.3标准储备液的配制

4.1.4样品预处理

4.1.5电泳条件

4.2结果与讨论

4.2.1缓冲液pH对分离的影响

4.2.2缓冲液浓度对分离的影响

4.2.3添加剂SDS浓度的选择

4.2.4添加剂HEC浓度的选择

4.2.5样品提取介质的选择

4.3标准曲线、线性范围、精密度、检出限及回收率

4.3.1标准曲线、线性范围和检出限

4.3.3仪器精密度

4.3.3方法精密度

4.3.4加标回收率

4.4实际样品测定

4.4.1奶粉样品中Lf的定性和定量结果

4.4.2乳清中微量蛋白的分析

4.5不确定度分析

4.5.1不确定度的来源

4.5.2测量不确定度的评定

4.5.3扩展不确定度U及测量结果的报告

4.5.4澳优能力多小婴儿免疫强化配方奶粉中乳铁蛋白的检测结果

4.5.5 Excel在不确定度评定中的应用

4.6 结论

5高效液相色谱法测定果酱中的纳他霉素

5.1试验部分

5.1.1仪器和试剂

5.1.2色谱条件

5.1.3标准溶液的配制

5.1.4标准曲线的绘制

5.1.5样品制备

5.2结果与讨论

5.2.1检测波长的选择

5.2.2色谱分离条件的优化

5.2.3提取溶剂的选择

5.2.4标准曲线及检出限

5.2.5回收率的测定

5.3结论

结论

参考文献

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发表论文

作者简历

致谢

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摘要

本论文分别利用高效毛细管电泳技术及高效液相色谱技术对乳制品中低含量乳铁蛋白、果酱中痕量纳他霉素的测定方法进行了研究,本论文分如下4个部分: (1)建立了高效毛细管电泳在酸性分离体系下测定高含量乳铁蛋白的新方法。以37cm×100μm i.d毛细管为分离柱,35mmol/L磷酸和14g/L聚氧化乙烯300000(PEO)(1mo/L CsOH调pH 2.50)为分离缓冲液,0.05 mol/L磷酸二氢钠(1mol/L磷酸调pH 2.20)为样品缓冲液,检测波长为214nm。在50~300mg/L范围内,乳铁蛋白质量浓度与峰面积呈良好线性关系,线性相关系数为0.9986,检出限和定量限分别为10mg/L和50mg/L。由于提取后的样品必须用水稀释10倍后才能进样,因此,该法仅适合于乳铁蛋白片剂及原料等样品中高含量乳铁蛋白的测定。 (2)建立了高效毛细管电泳在碱性分离体系下测定高含量乳铁蛋白的新方法。以77cm×100μm i.d.毛细管为分离柱,以0.1mol/L硼酸,0.01mol/L十二烷基硫酸钠(SDS)和8g/L羟乙基纤维素(HEC)(1mol/L CsOH调pH8.80)为分离缓冲液,以15mmol/L硼酸和20mmol/LSDS为样品提取介质(0.25mol/L LiOH调pH8.60),分离电压30kV,检测波长214nm。在10~1000mg/L范围内,乳铁蛋白质量浓度与峰面积呈良好线性关系,线性相关系数为0.9993,检出限和定量限分别为3mg/L和10mg/L。由于在目前的分离条件下,不能实现低含量乳铁蛋白与乳制品中主要的乳清蛋白的分离,因而该法仅适于乳铁蛋白片剂及原料等基体简单的样品中乳铁蛋白的测定。 (3)建立了高效毛细管电泳在碱性分离体系下测定低含量乳铁蛋白的新方法。以57cm×50μm i.d.毛细管为分离柱,0.3mol/L硼酸,20mmol/LSDS和8g/L HEC为分离缓冲液(pH=8.80),以0.05mol/L醋酸为样品提取介质,离心后取上清液直接进样测定。分离温度25℃,分离电压20kV,在214nm处对含有乳铁蛋白的乳制品进行检测。在50~800mg/L范围内,乳铁蛋白质量浓度与峰面积呈良好线性关系,检出限和定量限分别为15mg/L和50mg/L。本方法进一步拓宽了碱性体系下高效毛细管电泳测定乳铁蛋白的适用范围。适于婴儿配方奶粉、保健食品中低含量乳铁蛋白的测定。 (4)建立了高效液相色谱测定果酱中残留纳他霉素的新方法。果酱经甲醇-水-冰乙酸(体积比为20:80:10)提取溶剂提取。采用Hypersil ODS2C18(200mm×4.0mm i.d.,5.0μm)色谱柱,甲醇-0.75%磷酸水溶液(体积比为75:25)为流动相,流速为1.00mL/min,紫外检测波长为304nm。在0.5~100mg/kg范围内,纳他霉素在果酱中含量与峰面积呈良好线性关系(r=0.9999),加标回收率为93.14%~98.24%(n=6),相对标准偏差(RSD)为0.72%~1.49%,在番茄酱和草莓酱样品中其检出限分别为0.06mg/kg和0.05mg/kg(S/N=3)。方法简便、准确,可用于果酱中纳他霉素含量的常规测定。

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