RA与WNT信号通路联合调节神经元前体细胞分化的体外研究

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神经干细胞(neural stem cells,NSCs)是一种具有自我更新，自我增殖和分化成多种中枢神经系统细胞潜力的未分化的细胞，经过神经元前体细胞(neural progenitor cells,NPCs)和胶质前体细胞阶段，最终分化为神经元、星型胶质细胞和少突胶质细胞。体外培养NPCs时，表皮生长因子(epidermal growth factor,EGF)和碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor,bFGF)具有促进增殖的作用，并最终使NPCs增殖形成具有分化潜能的神经球；若撤去促进增殖的因素时，神经球将会分化成神经元、星型胶质细胞或少突胶质细胞；因此对于 NPCs研究的重点就在如何控制 NPCs向预定的细胞方向分化，并达到对疾病治疗的目的。在神经球的培养中，许多细胞内源性的和外源性的因素均可调节 NPCs的增殖、迁移和分化；NPC培养技术为神经系统疾病的研究提供了一个较为理想和可行的细胞培养模型；通过对胚胎、胎儿或者成年机体获得的 NSCs予以适当诱导，然后进行移植治疗，对于损伤或疾病所导致的大脑和脊髓的神经元变性或许会得到逆转。
　　维甲酸(retinoic acid,RA)是一个由维生素A转化而来的亲脂性的小分子化合物，在胚胎形成，发生发展过程中起着重要的作用。研究发现体外培养的小鼠胚胎干细胞，在给予 RA刺激时会促进干细胞增殖；对于发育中的中枢神经系统，RA促进干细胞向着胶质细胞前体细胞方向的分化以及少突胶质-GABA能神经元方向的分化。Wnt信号通路是器官发育过程中高度保守的信号通路。不论是在胚胎的神经发生，还是在成年神经系统的干细胞，Wnt信号均具有调节NPCs分化和增殖的作用；对于神经变性性和神经退行性疾病，Wnt信号同样扮演着十分重要的角色；通过对体外培养的胚胎干细胞进行Wnt配体刺激，结果发现Wnt除了能促进干细胞增殖和自我更新，促进神经球的形成和增长之外，还具有促进其向GABA能神经元及胶质细胞方向的分化的潜能。在发育中，RA和Wnt信号通常作为腹、背两极的形态发生信号，协调调节着组织的生长和肝细胞的分化，因此，在神经干细胞中，二者有可能协调发挥作用，调节神经干细胞的增殖分化。
　　但有关RA和Wnt信号相互影响及其相互之间在神经干细胞的增殖与分化中相互作用机制的研究目前尚未见报道。基于此，本实验拟在体外培养胚胎神经干细胞的基础上，研究两者共同干预NSCs时，会对NSCs的自我更新和增殖产生什么样的影响？
　　第一部分、RA和Wnt信号对神经干细胞增殖分化的影响
　　1.方法：
　　培养离体胚胎神经干细胞；在神经干细胞的诱导分化下，进行RA处理、Wnt3a处理以及两者联合；采用 BrdU示踪方法检测神经干细胞增殖能力的变化；采用免疫细胞化学染色和Western Blot技术观察少突胶质-GABA能神经元共同前体细胞标记蛋白DLX2，少突胶质前体细胞标记蛋白NG2，GABA能神经元标记蛋白GAD67，神经元特异性标记蛋白TUJ1，以及星型胶质细胞标记蛋白GFAP表达的变化。
　　2.结果：
　　RA和Wnt3a单独处理时，均可显著增加BrdU阳性的神经干细胞、GABA能神经元的GAD67阳性的细胞的数目以及TUJ1阳性的神经元细胞（P<0.05）；Wnt3a可增加少突胶质-GABA能神经元的共同前体细胞即Dlx2阳性和少突胶质前体细胞即NG2阳性的细胞和细胞数量（P<0.05），然而RA抑制Dlx2和NG2的表达（P<0.05）。RA和Wnt3a联合使用时，抑制神经干细胞增殖，降低Dlx2,NG2，GAD67以及TUJ1神经细胞标记物的表达。在神经干细胞向星形胶质细胞方向的分化时，RA和Wnt3a均不同程度地抑制神经干细胞向星形胶质细胞方向的分化（P<0.05），而两者联合使用时GFAP阳性的星型胶质细胞数目则有回到了对照组的水平。
　　3.结论：
　　RA和Wnt3a均可促进神经干细胞增殖和向少突胶-GABA能神经元方向的分化的作用，同时抑制其向星形胶质细胞方向的分化；RA和Wnt3a联合使用时，神经干细胞增殖、分化能力又恢复到了对照组的水平，提示RA和Wnt信号之间可能存在相互拮抗的特性。
　　第二部分、RA和Wnt信号之间的相互作用及β-catenin对RA/Wnt相互拮抗作用的挽救
　　1.方法：
　　培养离体胚胎神经干细胞，采用过表达β-catenin的慢病毒感染神经干细胞，然后进行神经干细胞的诱导分化，如实验第一部分方法所述采用BrdU增殖实验检测神经干细胞自我增殖能力的变化，采用免疫细胞化学染色检测DLX2，NG2,GAD67以及GFAP的变化,采用Western Blot技术检测RA信号通路和Wnt信号通路中相关蛋白的表达。
　　2.结果：
　　RA可上调Wnt/β-catenin信号通路神经干细胞中的关键分子β-catenin，以及Wnt信号的靶基因Axin2和Cyclin D1的表达；Wnt3a在RA信号通路中则可上调RA降解过程中的关键酶cyp26B1和下调RA信号的胞内关键分子Raldh3的表达。RA和Wnt3a共同刺激抑制β-catenin的表达。与RA/Wnt3a联合刺激相比，β-catenin过表达刺激可明显增加少突胶质细胞-GABA能神经元的共同前体细胞即Dlx2阳性的细胞，少突胶质前体细胞即NG2阳性的细胞和GABA能神经元的GAD67阳性的细胞的数目以及TUJ1阳性的神经元细胞（P<0.05）和BrdU标记的神经干细胞（P<0.05）；而对于神经干细胞向星形胶质细胞方向的分化出现一定程度的下降，提示β-catenin过表达可挽救RA与Wnt信号在神经干细胞中的相互拮抗效应。
　　3.结论：
　　RA和Wnt3a之间互相拮抗的机制可能通过胞内β-catenin的作用实现，进而抑制神经干细胞向少突胶质-GABA能神经元方向的分化，而促进其向星型胶质细胞方向的分化。由于Wnt3a抑制RA信号通路中Raldh3的合并促进cyp26B1的表达，Raldh3和cyp26B1在R与和Wnt3a的相互拮抗中的作用有待进一步研究。

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作者
田士来;
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作者单位

第四军医大学;

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授予单位第四军医大学;
学科临床医学
授予学位硕士
导师姓名屈延;
年度 2015
页码
总页数
原文格式 PDF
正文语种中文
中图分类周围神经;细胞器移植;
关键词
神经干细胞; 神经元前体细胞分化; 维甲酸; 表皮生长因子; 少突胶质细胞; 细胞增殖;
入库时间 2022-08-17 11:08:18

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