摘要:大肠癌是一种涉及许多相关基因的多因素多阶段的恶性肿瘤,但目前认为肿瘤的生物学特征不仅取决于核内遗传物质,而且与核外的线粒体DNA(Mitochondrial DNA,mtDNA)的改变也可能有非常重要的关系.因为,与核基因组相比,mtDNA缺乏组蛋白保护,而且缺乏有效的损伤修复系统,因此mtDNA极易受到致癌物的攻击,是致癌物作用的靶点.目前已在多种实体肿瘤细胞中发现mtDNA突变和不稳定性等变化,并在肿瘤病人的白细胞中也检测到这种突变,但其在肿瘤发生和发展过程中具体的生物学意义尚不清楚. 实验表明染色体外存在抑癌因素,维持细胞的肿瘤特性需要线粒体DNA(mitochondria DNA,mtDNA)的参与[1].大肠肿瘤的mtDNA改变,国内外少有文献报告,且意见不一,不尽相同.Savre-Train[2]等在结肠癌细胞系Caco-2中检测到2583bp大片段的缺失,缺失为1%,而未检测到碱基突变及线粒体基因组不稳定.Heerdt[3]等研究中,在结肠癌细胞mtDNA的D-loop区存在基因组的多态性,而未发现有mtDNA的突变及mtGI(genetic instability).而Habano[4-6]在对45对结肠癌和正常组织的mtDNA的研究中,发现有7/45(16%)存在突变,包括3例编码ND1和ND5的移码突变,2例错义突变,15Kbp的缺失,而没有大片段的缺失,并且进一步研究发现其中22例mtDNA的D-loop区存在(CA)n不稳定及多聚C不稳定.这些研究阐明了在大肠癌细胞中存在mtDNA的改变,但未涉及到mtDNA在大肠癌发生和演变中的作用机制,也未涉及到mtDNA与大肠癌发生有关的癌基因和抑癌基因的内在关系.人类的线粒体基因组是环状、双链DNA,由于mtDNA全长也仅仅16 Kb多,而且序列早已完全清楚,只要通过设计适当的引物分别进行PCR和测序即可获得该细胞mtDNA的序列,因此为研究提供了方便.mtDNA分编码区和非编码区,即D-环区.D-环区包括重链的复制起点等重要序列,成为研究热点.本课题组通过PCR及测序等技术分析了人大肠癌细胞株中细胞线粒体DNA变异,包括突变、缺失、DNA不稳定性等,发现通过SW480,LoVo,HT29细胞株的mtDNA D-环区基因序列测序,检测出分别有10,9,8位突变点.而且检测到不同癌细胞株中检测到相同的突变位点,如LoVo细胞与SW480细胞均有16224位,T-C,16311位,T-C.SW480细胞与HT29细胞均有114位,C-T,498位,C-T,16234位,C-T.因此,为了进一步研究mtDNA突变与肿瘤发生发展的内在联系,本文将通过实验发现大肠癌细胞及其组织中的mtDNA突变的各种特征与规律,并进一步研究mtDNA的突变在大肠癌发生及发展中的生物学意义,以探讨mtDNA突变在大肠癌发病机制中的地位及作用,并有望为将来早期诊断大肠癌提供有效的新的标志物,以能早期发现大肠癌,进一步将大肠癌细胞突变的mtDNA转染小鼠成纤维细胞(NIH3T3)及人大肠侧向发育性肿瘤细胞(LST),观察转染细胞的线粒体DNA改变的特点和mtDNA片段在转染细胞核内的整合情况,并观察转染细胞生物学行为的改变。