整合酶

摘要： 细菌整合子具有独特的结构,能够捕获和表达外源基因,通过转座子和质粒可以在细菌间水平传播。多重耐药细菌的出现是临床抗感染治疗面临的巨大挑战,而耐药细菌多携带整合子。因此,整合子的早期检测对尽早判断细菌耐药非常重要。目前,检测细菌整合子的方法主要是基于整合子的整合酶及其基因盒。文章对基于聚合酶链反应(PCR)的各种检测方法和环介导等温扩增(LAMP)、宏基因组测序(mNGS)、基因芯片等细菌整合子检测方法,以及各种检测方法的原理和特点进行介绍,并比较每种方法的优缺点,帮助临床实验室选择更适合的检测方法,及时了解细菌携带整合子的情况,尽早确定细菌耐药特点,为临床诊治提供参考。

摘要： 获得性免疫缺陷综合征(AIDS),即艾滋病,是人类免疫缺陷病毒(HIV)所引起的一种无法治愈的致命性传染病,目前其临床治疗常采用抗病毒药物.卡博特韦(CAB)是一种通过抑制HIV整合酶链转移从而阻止其复制的药物,其独特的药学特性适合开发为长效注射剂.临床试验表明,由CAB和利匹韦林(RPV)组成的双药方案抗HIV效果不输于常规口服抗病毒药物,且单用长效CAB用于AIDS暴露前预防(PrEP)的效果也很理想.以每8周注射1次长效CAB的给药方式用于PrEP,其预防男男或女性性行为HIV感染方面均比每日口服替诺福韦和恩曲他滨的合剂更加有效.美国食品药品管理局已授予CAB长效注射剂用于HIV PrEP的"突破性疗法"称号.本文对CAB的基本信息、作用机制及临床试验等情况作一概述.

摘要： 近期,国际知名遗传学期刊《PLoS Genetics》在线发表了浙江大学农业与生物技术学院陈学新教授团队的最新研究成果,揭示了多分DNA病毒基因组整合到寄主基因组中的新机制,研究结果深化了对DNA病毒感染寄主的机制认识,同时为害虫控制新技术的研发提供了新的理论依据。多DNA病毒(PDV)是一类寄生蜂携带的DNA病毒,是寄生蜂寄生鳞翅目害虫时的寄生因子,调控鳞翅目寄主的生理和发育,从而保障幼蜂在寄主体内成功发育。

摘要： [背景]整合子在细菌耐药性的获得及传播中占据重要地位,对于整合反应检测方法的改良及反应机制的研究,可以加深我们对细菌耐药性产生和播散的理解,为遏制耐药菌株的产生和播散提供新的途径.[目的]在细菌染色体上构建第1类整合子反应模型,用于评价整合酶介导的基因盒位点特异性重组.[方法]采用PCR分别扩增含氯霉素耐药基因cat的CM片段、含基因盒aadA5的LacA5片段、含整合子重组位点attI1及强可变区启动子的PcS片段和插入位点两侧的同源臂,重叠延伸聚合酶链反应连接上述5个片段制备整合子模型插入片段,通过同源重组将构建好的整合子模型片段插入大肠埃希菌JM109染色体中.转入高表达第1类整合酶的质粒pHSint,在链霉素平板上筛选发生整合的菌株,并用聚合酶链反应和测序验证.[结果J构建的整合子模型片段经测序与预期一致,整合子模型片段成功插入大肠埃希菌JM109染色体中.转入高表达整合酶的质粒pHSint后,在链霉素平板上成功筛选出基因盒aadA5发生整合的菌株,经聚合酶链反应扩增并测序与预期一致.[结论]在大肠埃希菌染色体上成功构建第1类整合酶介导基因盒位点特异性重组反应模型,为进一步揭示整合子捕获耐药性基因盒的反应机制奠定基础.

摘要： 目的分析临床分离的非鮑曼不动杆菌的临床分布特征及药敏情况;检测其金属β-内酰胺酶和整合酶基因。方法用K-B法对安徽省2家教学医院病房及门诊收集的各种标本分离出的非鲍曼不动杆菌进行药物敏感试验,按CLSI 2016版判断结果。用聚合酶链式反应(PCR)对其进行扩增金属β-内酰胺酶基因及Ⅰ-Ⅲ类整合子的整合酶基因,分析结果。结果44株非鲍曼不动杆菌(洛菲不动杆菌29株、琼氏不动杆菌9株、醋酸钙不动杆菌3株、溶血不动杆菌2株及不动杆菌基因型13TU 1株),来源于心内科、呼吸内科等临床科室,分离于痰液、尿液、分泌物及其他标本。其中3株为多药耐药菌株(2株洛菲不动杆菌及1株溶血不动杆菌),17株仅对β-内酰胺类抗生素耐药,余24株为完全敏感菌株。金属β-内酰胺酶SIM-1阳性率为20.45%(7株洛菲不动杆菌、2株琼氏不动杆菌);VIM-2阳性率为9.09%(2株洛菲不动杆菌、1株溶血不动杆菌及1株琼氏不动杆菌);IMP-4、NDM-1均未检测出。IntI-1阳性率为11.36%(3株洛菲不动杆菌、1株溶血不动杆菌及1株琼氏不动杆菌);IntI-2阳性率为13.64%(3株洛菲不动杆菌、1株溶血不动杆菌及2株琼氏不动杆菌);IntI-3未检测出。结论非鲍曼不动杆菌的耐药率相对较低,但已经发现多药耐药菌株;其耐药机制可能与金属β-内酰胺酶及整合酶有关。

摘要： 尽管已有31种上市的单靶点抗HIV药物和高效抗逆转录病毒疗法用于AIDS的临床治疗,但寻找安全高效的新型抗HIV药物仍是全世界面临的一项严峻挑战.单组分多靶点药物具有降低耐药的可能性、简化给药剂量及提高患者服药顺从性等优点,现已成为抗HIV药物研发领域的热点.HIV整合酶(IN)和核糖核酸酶H(RNase H)均为病毒复制过程中的关键酶,是药物开发的重要靶标.近年来,通过合理药物设计和筛选途径,发现了多种结构类型的HIV IN和RNase H(IN/RNase H)双靶点抑制剂.本文主要对化学合成类HIV IN/RNase H双靶点抑制剂的研究进展进行介绍,以望对多靶点抗HIV药物的研发有所启示.

摘要： 通过微量稀释法药敏试验及四环素类耐药基因的扩增对18株不同源多杀性巴氏杆菌进行耐药性分析.并采用PCR及其产物测序检测上述菌株中一类整合酶携带率.结果表明,18株不同源的多杀性巴氏杆菌对氯霉素的耐药率为83.33％,对四环素、强力霉素与庆大霉素的耐药率为50％～61.11％,对氧氟沙星、卡那霉素、恩诺沙星与氟苯尼考的耐药率为27.78％～38.89％.18株菌株均未检测到tetA耐药基因,22.22％的多杀性巴氏杆菌携带tetB耐药基因,5.56％的多杀性巴氏杆菌携带tetO耐药基因,tetK与tetQ两种耐药基因的携带率均为27.28％,而对于tetG的携带率为100％,Ⅰ型整合酶携带率为22.22％.本研究为进一步研究多杀性巴氏杆菌耐药机制及跨物种传播奠定了基础.

摘要： 近年来,单组分多靶点抗Ⅰ型人类免疫缺陷病毒（human immunodeficiency virus type 1,HIV-1）药物的研发成为热点,已发现的多靶点抑制剂以针对HIV-1逆转录酶（reverse transcriptase,RT）和整合酶（integrase,IN）的双靶点抑制剂居多,特别是作用于非核苷类逆转录酶抑制剂（non-nucleoside reverse transcriptase inhibitor,NNRTI）作用位点和IN活性位点的双靶点抑制剂[简写为：RT（NNRTI）/IN]种类繁多,现将对其中化学合成的HIV-1 RT（NNRTI）/IN双靶点抑制剂研究进展进行综述。

摘要： [目的]从天然产物中筛选人类免疫缺陷病毒(HIV)非核苷类逆转录酶抑制剂(NNRTI)和整合酶链转移抑制剂(INSTI)作用位点的双靶点抑制剂[RT(NNRTI)/IN]。[方法]运用分子模拟技术和计算机辅助药物设计(CADD)方法,构建HIV RT(NNRTI)/IN双靶点抑制剂分子相似性搜索模型、NNRTI和RT以及INSTI和IN对接模型,采用两种策略对中药化学数据库(TCMD)进行筛选。[结果]共命中与RT和IN对接得分均大于6的化合物35个,包括黄酮类、生物碱类、苷类、多酚类等,黄酮类化合物(15个)占到了42.86%。[结论]黄酮类化合物是开发潜在HIV RT(NNRTI)/IN双靶点抑制剂的主要来源,上述研究为天然产物来源的HIV双靶点药物发现提供了新线索。

摘要： 为探讨与ALV整合酶相互作用的宿主蛋白及其分子机理，本文通过酵母双杂的方法筛选并验证了与ALV整合酶相互作用的宿主蛋白，同时对其功能进行初步研究。另外，通过研究进一步发现ALV整合酶可以发生泛素化，而且这种泛素化是不依赖赖氨酸介导的。

摘要： HIV-1整合酶(IN)通过依赖金属离子的两步反应将病毒DNA整合入宿主细胞中.结合于HIV-1上的金属离子个数的变化直接影响整合酶与抑制剂之间的结合.用同源模建方法搭建了每条单链核心区具有两个Mg2+的(2Mg-IN-Core)和具有一个Mg2+的HIV-1 IN二聚体核心区模型(1Mg-IN-Core).通过分子对接分别得到它们与硫氮硫扎平类化合物能量较低的复合物结构,并对对接结果进行了比较.研究发现:当整合酶中结合的Mg2+个数改变时,它与抑制剂的结合模式也会发生很大的变化;抑制剂能够特异且稳定地与2Mg-IN-Core模型的活性位点结合;同时与ASP64和GLU152螯合的那个Mg2+离子对于硫氮硫扎平抑制剂与整合酶上的结合有很大的影响.对2Mg-IN-Core模型与抑制剂的复合物平均结构进行了2000 ps的分子动力学模拟.分析发现同时与ASP64及ASP116螯合的Mg2+与IN蛋白形成了四个稳定的螯合键;同时与ASP64及GLU152螫合的Mg2+可与IN结合,也可与抑制剂形成稳定的配位键,这个Mg2+对IN与硫氮硫扎平抑制剂之间的结合有较大影响.

摘要： 艾滋病(AIDS)的全球流行给人类带来极大恐慌。已上市的药物使引起AIDS的人类免疫缺陷病毒（HIV）出现了耐药突变，导致HIV对药物的敏感度下降，使AIDS治疗失败。HIV的耐药性是全球AIDS治疗中面临的一大难题。整合酶（IN）是HIV将自身cDNA整合到宿主DNA上的关键酶，目前无针对它的药物上市，是抗AIDS药物设计中的全新靶标。本研究以IN核心区晶体结构(1QS4)及野生型IN作对照，选取5-1360存在下产生的HIV耐药突变株1 [T66I，E138K，Q146K]和2[T66I，L74M，A128T，E138K，Q146K，S153A，K160D，V165I，V201I]进行耐药性机理研究。

摘要： 近年来艾滋病迅速在全球范围内蔓延，艾滋病毒不断地对已经研发出的抗HIV药物产生了耐药性，而且目前大部分药物都具有较大的副作用，因此急需寻找新的抗HIV药物。中草药由于成本低廉，资源丰富，含有大量的药用成分，是一个庞大的天然产物库，从中草药中筛选具有抗阳HIV活性的高效低毒药物已成为开发新药的一种重要途径。槲皮素类化合物是研究较多并且具有较强抗HIV活性的黄酮中的一类化合物，它主要作用于HIV复制所需的三个关键酶——蛋白酶、逆转录酶、整合酶，从而抑制HIV在体内的复制。

摘要： 背景：1981年美国疾控中心首次报道了艾滋病,二十多年来其在全球迅速蔓延,对人类造成了极大的危害.当前,艾滋病的治疗以高效抗逆转录病毒疗法(HAART)为主,但其价格昂贵,毒副作用强,病毒耐药性不断发生,停药后易反跳,且不能彻底清除病毒,在相当程度上限制了其的应用.天然产物由于其其结构的多样性、较低的毒副作用以及广泛的来源等特点,越来越为国内外许多研究者所重视.目的对具有抗HIV-1活性的天然产物及其成分进行总结,并对有效成分的作用靶点进行综述,希望为今后的研究工作和临床应用提供参考.方法:通过PubMed,medline,google及其它网络电子资源查询相关文件,并对具体章节进行综述总结. 结果：目前发现具有抗HIV作用的天然产物中,抗HIV-1逆转录酶的活性成分居多,有效成分包含生物碱、黄酮类、香豆素、萜类、糖类、鞣质及酚酸类、蛋白质、和木质素类等.而作用于整合酶和蛋白酶的有效成分相对较少,整合酶抑制剂的有效成分以肽类、黄酮类、生物碱类及鞣质酚酸类为主,蛋白酶抑制剂的有效成分以萜类、木质素类、酚酸及醌类等为主. 结论：天然产物中含有多种抗HIV的活性成分,可作用于HIV复制的各个环节,本文仅对抑制病毒复制三个关键酶(RT、IN、PR)的部分天然产物及其有效成分进行了综述,希望从中找出作用于HIV复制周期相关靶点的药物,从而为治疗艾滋病做出更大贡献.

摘要： 本实验室以病毒生命周期中的新靶点整合酶和在病毒进入过程中发挥重要作用的病毒膜蛋白进行了一系列抗病毒药物分子设计的基础及应用研究。

摘要： 在近二十年来，遗传学家通过巧妙地处理小鼠基因组来探索研究基因功能及各个基因在正常发育和疾病发生中的作用。精确地操纵基因开始于对来自发育胚泡内部的胚胎干细胞(ES)的处理。这其中涉及到一种叫同源重组技术，可对ES细胞内源性基因组靶基因进行修改，或是引入一新的基因。该技术具有多种作用，可通过剔除靶基因核心序列起到基因敲除作用(knock-out)，也可对靶基因引入突变碱基，或是对目标区域引入完全不同的一段序列(knock-in)。这种技术被许多实验室应用构建基因缺陷鼠。而这些小鼠模型为研究某些基因在发育、肿瘤发生和其他一些疾病提供了大量数据和信息。但是在研究过程中，该技术显示出其局限性。由于某些基因对存活密切相关，被敲除后，胚胎不能正常发育，存活，因此不能研究该基因在某些组织中的作用。例如，某些基因参与凋亡，细胞周期调控和重要组织的发育，在胚胎干细胞阶段被敲除后，胚胎由于缺乏相应基因产物而不能发育，存活。rn Cre/loxP系统最早在噬菌体PI中被发现。Cre是由噬菌体PI编码的一个分子量为38 kDa的整合酶，可识别一段由34个核普酸构成的称为loxP的序列。Cre/loxP系统的重要特征是它可以在哺乳细胞中行使作用。当对靶基因采用该技术时，它可提供一极为有效的遗传学工具，构建可控性基因敲除模型。该系统有两部分构成，首先通过同源重组技术构建loxP修饰小鼠，靶基因核心区域两侧各加入一段loxP序列，而且所引入loxP序列不影响靶基因功能，即就是该小鼠纯合子仍具有正常的表型，这一点很关键。第二部分须构建含特定启动子的Cre转基因鼠。将LoxP和Cre小鼠杂交，筛选出同时含有LoxP和Cre转基因的子代小鼠，当特定启动子引导下Cre表达时，该整合酶识别并结合至LoxP两侧反转互补的碱基对序列，切除被F1oxP修饰的靶基因，形成无效或空的基因位点.rn 本文主要研究了对Cre表达的调控对靶基因进行特定时间和特定部位的敲除机制。

摘要： 人类通过不断发现新的抗菌药物来对付细菌耐药问题的日益广泛性和复杂性,但是随之而来的却是新的耐药菌株的产生,这已成为临床的诊断和治疗中的极大困扰.监测细菌的耐药性,研究细菌的耐药机理,也在国内外如火如荼的进行.在探讨细菌耐药机制的研究中,用基因突变和耐药质粒介导细菌的耐药性似乎不够确切,而细菌对外源耐药基因的捕获来解释细菌的耐药性、甚至多重耐药性正得到研究者们的广泛注意.并取得了很大的进展.1991年,由Hall等定义的整合子,其作为一种基因可移动元件,可以通过整合酶的作用,捕获外来的耐药基因,同时在整合酶基因上游的启动子的作用下得到表达,使细菌具有耐药性.本文就近年国外相关文献及我们对印度霍乱弧菌整合子分析的基础上,对整合子介导细菌耐药特性的研究进展作以论述。

摘要： 本发明公开了一种多功能融合酶XAET和多功能融合酶定点整合真核特异表达载体及其构建方法，该多功能融合酶可以表达木聚糖酶，植酸酶，双葡聚糖酶和双纤维素酶活性，将其用于后期制备相应的转基因动物，该动物将自身分泌这些酶，起到消化饲料中木聚糖、植酸、葡聚糖，纤维素等抗营养因子，达到提高饲料利用率，减少污染排放的功效。同时，解决刚性肽介导两个以上融合蛋白共表达时相互干扰问题；解决2A连接肽多基因共表达效率低，基因位置确定困难问题，及多基因共表达中2A多肽残基对上游酶蛋白干扰的问题，达到增强多基因高效共表达效率的目的。此外，还可以解决单个来源的纤维素酶基因表达和水解纤维素效果差的问题。

摘要： 本发明公开了一种多功能融合酶XAET和多功能融合酶定点整合真核特异表达载体及其构建方法，该多功能融合酶可以表达木聚糖酶，植酸酶，双葡聚糖酶和双纤维素酶活性，将其用于后期制备相应的转基因动物，该动物将自身分泌这些酶，起到消化饲料中木聚糖、植酸、葡聚糖，纤维素等抗营养因子，达到提高饲料利用率，减少污染排放的功效。同时，解决刚性肽介导两个以上融合蛋白共表达时相互干扰问题；解决2A连接肽多基因共表达效率低，基因位置确定困难问题，及多基因共表达中2A多肽残基对上游酶蛋白干扰的问题，达到增强多基因高效共表达效率的目的。此外，还可以解决单个来源的纤维素酶基因表达和水解纤维素效果差的问题。

摘要： 本发明公开了一种针对整合酶核心区去整合反应的HIV-1整合酶抑制剂体外筛选方法，经过整合酶核心区蛋白的制备、去整合DNA底物的制备、待测化合物样品的制备、待测化合物样品的筛选。本发明较之于现有方法，摒弃了放射性同位素，无环境污染；不需要包被和封闭微孔板等耗时耗力的工作；不需要对产物进行变性和后续标记检测；能够实现高通量和对反应实时检测。达到了简化步骤、缩短时间、降低成本等目的。现有方法中放射自显影方法需10小时以上，固相和液相ELISA也需要3小时左右，而本发明方法所需时间短至1小时以内，同时大大降低了筛选成本。

摘要： 一种HIV-1整合酶表达菌株及整合酶抑制剂体外筛选模型。本模型首先利用基因工程技术构建HIV-1整合酶可溶性表达质粒和带有整合酶最适底物LTR序列的质粒，将构建好的重组质粒pET28a-IN转化进入商品化大肠杆菌BL21中得到整合酶表达菌株；然后大规模培养，分离纯化整合酶，作用于底物质粒，加入样品测定活性。此检测模型克服了已有ELISA检测法成本高，本底高，影响因素多等缺点，可在体外大量而快速的对各种天然或化学合成的整合酶抑制剂进行初步筛选，是一种快速，灵敏，干扰因素少，成本低的HIV-1整合酶抑制剂体外筛选模型。

摘要： 本发明属生物技术和基因工程技术领域，具体涉及一种基于Phi BT1整合酶及Phi C31整合酶的基因克隆质粒(pBCFX+和pBCFX-)及其应用。该质粒使用含有Phi BT1整合酶及PhiC整合酶对应attP位点串连序列的中间插入LacZ表达框架作为质粒载体(pBCFX+和pBCFX-)置换克隆位点，采用插入失活作蓝白筛选。基于该质粒的克隆方法主要包括使用Phi BT1整合酶及Phi C31整合酶混合物作为定点整合催化酶，插入DNA片段依据目的要求可以通过PCR等技术在两侧附加对应的attB序列，从而决定插入片段方向性。该克隆系可以方便操作含有特别内切酶位点的插入DNA，在大片段基因操作方面有独到优因为该体系不需要限制性酶，磷酸酶和连接酶操作，可以简化重组DNA操作方法。基因工程中有广泛应用前景。

摘要： 本发明公开了一种针对整合酶核心区去整合反应的HIV-1整合酶抑制剂体外筛选方法，经过整合酶核心区蛋白的制备、去整合DNA底物的制备、待测化合物样品的制备、待测化合物样品的筛选。本发明较之于现有方法，摒弃了放射性同位素，无环境污染；不需要包被和封闭微孔板等耗时耗力的工作；不需要对产物进行变性和后续标记检测；能够实现高通量和对反应实时检测。达到了简化步骤、缩短时间、降低成本等目的。现有方法中放射自显影方法需10小时以上，固相和液相ELISA也需要3小时左右，而本发明方法所需时间短至1小时以内，同时大大降低了筛选成本。

摘要： 一种HIV－1整合酶表达菌株及整合酶抑制剂体外筛选模型。本模型首先利用基因工程技术构建HIV－1整合酶可溶性表达质粒和带有整合酶最适底物LTR序列的质粒，将构建好的重组质粒pET28a－IN转化进入商品化大肠杆菌BL21中得到整合酶表达菌株；然后大规模培养，分离纯化整合酶，作用于底物质粒，加入样品测定活性。此检测模型克服了已有ELISA检测法成本高，本底高，影响因素多等缺点，可在体外大量而快速的对各种天然或化学合成的整合酶抑制剂进行初步筛选，是一种快速，灵敏，干扰因素少，成本低的HIV－1整合酶抑制剂体外筛选模型。

摘要： 本发明属生物技术和基因工程技术领域，具体涉及一种基于Phi BT1整合酶及Phi C31整合酶的基因克隆质粒(pBCFX+和pBCFX－)及其应用。该质粒使用含有Phi BT1整合酶及PhiC31整合酶对应attP位点串连序列的中间插入LacZ表达框架作为质粒载体(pBCFX+和pBCFX－)置换克隆位点，采用插入失活作蓝白筛选。基于该质粒的克隆方法主要包括使用PhiBT1整合酶及Phi C31整合酶混合物作为定点整合催化酶，插入DNA片段依据目的要求可以通过PCR等技术在两侧附加对应的attB序列，从而决定插入片段方向性。该克隆体系可以方便操作含有特别内切酶位点的插入DNA，在大片段基因操作方面有独到优势，因为该体系不需要限制性酶，磷酸酶和连接酶操作，可以简化重组DNA操作方法。在基因工程中有广泛应用前景。

摘要： 本发明公开了一种耐药性大肠杆菌整合酶整合载体pUC19-attI-400-attC的构建方法，构建了含有attI和attC重组位点且在attI和attC位点之间间隔440bpDNA序列的重组载体，载体精小，只有3270bp，可以同时进行切割attI和attC位点，也可以单独切开attC位点，载体本身还含有10多种多克隆位点，便于使用者选用适合的限制性内切酶来研究整合酶的作用位点，它带有氨苄抗性，便于筛选，可用于体外检测细菌耐药性整合酶整合活性的载体模型，也可以用来探索其他细菌整合子的整合机制。

摘要： 本发明涉及包含逆转录病毒样－DNA的转基因靶向整合入真核基因组的方法，所述的基因组被核酸内切酶切割而在切割位点引入所述的转基因，其中所述的核酸内切酶对高丰度的rDNA基因座中的位点是特异的，并且与介导转基因引入的整合酶融合。所述的融合蛋白可能是新的。