逆转录PCR

摘要： 美国科学家在最新一期《自然》杂志撰文称,他们设计出两款基于病毒蛋白的生物传感器,当与新冠病毒的组成成分或靶向该病毒的抗体混合时,传感器就会发光。这一突破有望实现更快、更广泛的新冠病毒检测。目前,大多数医学实验室主要仰仗逆转录PCR(RT-PCR)技术来诊断新冠病毒感染。PCR技术可以放大病毒的遗传物质,使其可被检测出来。

摘要： 目的 探讨新型冠状病毒肺炎(Corona Virus Disease 2019,COVID-19)的CT影像表现及其诊断价值.方法 回顾性分析2020年1—2月就诊于阜阳市第二人民医院113例经CDC实验室核酸确诊的COVID-19 CT检查的病变表现形式、分布特点及病变程度.结果 COVID-19病人的CT检查最主要影像表现:早期两肺外周带(92.9％)多发磨玻璃样影(占84.9％),其内血管增粗(占79.6％);进展期,短期内病灶范围增大,密度增高,部分出现实变(占84.4％),内见充气支气管征;重症期病变短期内进展迅速,病灶弥漫,部分呈"白肺"表现;吸收期,实变密度减低,病变范围缩小,部分可见纤维索条(占86.7％).结论 新型冠状病毒肺炎CT表现具有特异性,不同时期的CT表现,结合病人流行病学史、临床表现、典型影像学征象和病原学检查能够更为精准地诊断.

摘要： 目的 对1个粘多糖贮积症Ⅱ型(mucopolysaccharidosis Ⅱ,MPS Ⅱ)家系的艾杜糖-2-硫酸酯酶(iduronate-2-sulfatase,IDS)基因进行变异分析,探讨其分子遗传学发病机制.方法 应用高通量测序和Sanger测序技术对先证者进行基因变异分析,基因变异确定后,对其母亲、父亲进行致病基因位点确认,确定变异基因的遗传关系;应用逆转录-聚合酶链反应检测变异对mRNA的影响.结果 先证者IDS基因存在IVS1-3T＞G半合子变异,导致变异等位基因产生了两种转录本,一种转录本保留了第1内含子的3'端c.104-216到c.104-1的216个核苷酸,并提前出现终止密码,导致肽链从550个氨基酸截短至38个;另一种转录本缺失了第2外显子5'端c.104-c.212的109个碱基,产生移码变异,IDS肽链由550个氨基酸缩短至92个.先证者为IVS1-3T＞G变异的半合子,而其母亲为IVS1-3T＞G变异的杂合子;其他家系成员及100名正常对照则未见该变异.结论 IDS基因的IVS1-3T＞G变异导致IDS基因表达异常,进而引起IDS蛋白异常,从而成为该粘多糖贮积症Ⅱ型患者的致病原因.

摘要： Objective The mechanism of the regulation of the quorum-sensing system on the class 1 integron was preliminarily explored by studying the expression correlation between the quorum-sensing system lasR gene and the class 1 integron integrase intH gene of Pseudomonas aeruginosa.Methods Fluorescence quantitative RT-PCR was used for detecting the mRNA expression level of the quorum-sensing system signal molecular receptor lasR gene and the class 1 integron integrase intI1 gene in the planktonic bacteria and biofilm bacteria of Pseudomonas aeruginosa.The correlation of the two gene expression was then analyzed.Results In biofilm,the mRNA expression level of Pseudomonas aeruginosa quorum-sensing system lasR and the class 1 integron intI1 gene was greater than that in planktonic bacteria,and both expression levels had a positive correlation (r=0.695,P＜0.05).Conclusion The expression of the lasR and the intI1 gene of Pseudomonas aeruginosa have a positive correlation,which suggests that the intI1 gene expression may be related to the regulation of the functions of quorum-sensing system.%目的 通过研究铜绿假单胞菌Ⅰ类整合子阳性株群体感应系统基因lasR与Ⅰ类整合子整合酶基因intI1表达水平的相关性,初步探讨群体感应系统对Ⅰ类整合子的调控机制.方法 通过荧光定量RT-PCR方法检测铜绿假单胞菌群体QS信号分子受体基因lasR和Ⅰ类整合子整合酶基因intI1在液相菌与生物被膜菌中mRNA的表达水平,分析两基因表达的相关性.结果 铜绿假单胞菌在生物被膜中群体感应系统lasR基因及Ⅰ类整合子intIl基因的mRNA表达水平高于液相菌,两者表达水平呈现正相关性(r=0.695,P＜0.05).结论 铜绿假单胞菌群lasR和intI1基因表达呈正相关,提示intI1基因表达可能与群体感应系统的调控作用有关.

摘要： 目的 扩增丙型肝炎病毒(HCV)高度保守区5'端非编码区(5'-UTR)基因序列,确定HCV的基因型和基因亚型,对河南地区慢性丙型病毒性肝炎患者基因型的分布特点进行调查研究.方法 采集2011年6月至2013年6月144例河南地区慢性丙型病毒性肝炎患者的血清标本,采用RT-PCR方法对HCV 5'-UTR进行扩增、测序,最终通过系统进化树分析确定HCV基因型和亚型.结果 144例患者血清标本中,138例(95.8％)明确基因型,其中基因1型94例(65.3％),明确为1b亚型52例(36.1％);基因2型42例(29.2％),其中明确为2a亚型32例(22.2％);6a型2例(1.39％).结论 河南地区HCV基因型分布主要以1b型为主,其次为2型,6a型少见,无其他基因型分布.

摘要： 目的 通过研究阿奇霉素对铜绿假单胞菌Ⅰ类整合子整合酶基因intI1表达的影响,初步探讨阿奇霉素对Ⅰ类整合子的抑制机制.方法 采用荧光定量RT-PCR方法检测铜绿假单胞菌Ⅰ类整合酶基因intI1在不同阿奇霉素浓度中mRNA的表达水平,分析阿奇霉素对intI1表达的影响.结果 阿奇霉素对铜绿假单胞菌Ⅰ类整合酶基因intI1的表达抑制作用明显,Ⅰ类整合酶基因intI1mRNA随着阿奇霉素浓度的增高表达水平呈明显下降趋势.结论 阿奇霉素对Ⅰ类整合酶基因intI1表达具有明显抑制作用,提示可能与阿奇霉素对铜绿假单胞菌群体感应系统抑制机制间接相关.%Objective The mechanism of azithromycin inhibition on the class 1 integron were preliminarily explored by studying the influence of azithromycin on the class 1 integron integrase intI1 gene expression in Pseudomonas aeruginosa.Methods Using fluorescence quantitative RT-PCR to detect class 1 integrase intI1 gene of Pseudomonas aeruginosa mRNA expression level in different concentrations of azithromycin,analysis of azithromycin influence on the intI1 expression.Results Azithromycin had a significant inhibitory effect on the expression of the class 1 integrase intI1 gene of Pseudomonas aeruginosa,then the class 1 integrase intI1 gene mRNA expression level increased as the concentration of azithromycin was significantly lower than the half lethal dose (2μg/mL).And the growth of PA was significantly suppressed in AZM 4μtg/mL medium.Conclusion Azithromycin has an obvious inhibitory on the expression of the class 1 integrase intI1 gene,which suggests it may be associated with azithromycin inhibition on the quorum-sensing system ofPseudomonas aeruginosa indirectly.

摘要： In order to investigate the molecular biological mechanism involved in germination of soybean young embryos promoted by high temperature( HT) , both young embryos of soybean cultivar"Nipponbare" treated with HT and without HT were employed to screen the differential expression genes with mRNA differential display reverse transcription-polymerase chain reaction (DDRT-PCR). In this study, we reported K6, one of the differential expression genes. K6 was regarded as homologue of Lea5 gene ( soybean cultivar Williams 82 ) , because they shared 99% identical nucleotides. Blastp analysis showes that the putative protein of K6 contains LEA type-3 motifs and is assigned to LEA-3 superfamily. Analysis by CLC Protein workbench 5 software also showes that the putative protein has 113 amino acid residues with relative MW 12. 283 kD and pI 10. 12. The putative protein of K6 has no typical secondary structure element. Results of RT-PCR suggested that expression of K6 gene is constitutive. Expression levels of the gene in soybean young embryos developmental process was relatively constant. Moreover, expressions of the gene were also detected in roots, hypocotyls and leaves.%为了解高温处理促进大豆幼胚萌发成苗的分子生物学机制,采用经典的基因表达差异显示技术,分析大豆品种日本晴高温处理的幼胚与对照组材料的差异表达基因.对其中一个差异表达基因K6进行了测序和比对分析,结果表明该基因序列与大豆Williams 82基因组中的Lea5基因相似度高达99%,可以确定为Lea5基因.Blastp比对分析结果表明大豆Lea5蛋白为LEA-3亚家族成员.利用蛋白质分析软件分析了Lea5基因推测的蛋白质结构的特点,结果表明该蛋白质由113个氨基酸组成,相对分子量为12.283 kD,等电点高达10.12.该蛋白质不形成典型的二级结构.RT-PCR分析表明该基因表达具有组成型特点,在大豆幼胚发育过程中稳定表达,在大豆的根、胚轴和叶片等器官中均有表达.

摘要： 目的 研究干扰素调节因子8(interferon regulatory factor 8,IRF-8)在骨髓增生异常综合征伴原始细胞增多(Myelodysplastic Syndromes with Excess Blasts,MDS-EB)亚型中是否存在表达异常,并分析其与MDS-EB的相关性.方法 收集三组共30例实验标本.其中20例为MDS-EB病例标本,分为MDS-EB1组和MDS-EB2组.10例为健康体检的健康对照组.30例标本均采集自受试者外周静脉血,采集后立即进行外周血总RNA提取,并经逆转录PCR后,以实时荧光定量PCR检测各标本的IRF-8 mRNA表达水平.各组平均表达量以RQ值(x±s)表示.结果 三组样本实时荧光定量PCR的平均RQ值:MDS-EB1组(0.59±0.08),MDS-EB2组(0.26±0.10),健康对照组(1.20±0.26),三组表达水平存在显著差异(P<0.01).MDS-EB组的IRF-8表达水平均显著低于健康对照组(P<0.01),MDS-EB2组内IRF-8表达水平低于MDS-EB1组(P<0.05).结论 IRF-8在MDS-EB中表达水平降低,表明IRF-8在MDS-EB中表达受抑,组间统计结果 提示IRF-8的表达可能与疾病的恶性程度及进展相关.

摘要： 为建立蓝莓组织RNA提取方法，以蓝莓幼果为材料，比较了5种RNA提取方法，建立了改良的十六烷基三甲基溴化铵-乙酸钾（ CTAB-KAc）提取方法，并比较了CTAB-KAc法对蓝莓根、成熟叶、幼茎、花、幼果和成熟果实组织RNA的提取效果．结果表明：CTAB-KAc法提取RNA的过程只需3 h，蓝莓幼果RNA的A260／A280和A260／A230值分别达到2．02和2．46，且无基因组DNA污染，RNA产量达到143．37μg· g－1；用CTAB-KAc法成功提取了蓝莓成熟叶、幼茎、花、幼果和成熟果实组织的RNA，但是根的RNA提取方法还需优化．把上述RNA反转录成cDNA后进行PCR，扩增出预期大小的目的片段，可满足后续分子生物学实验的要求．%Tissues of blueberry were generally rich in polysaccharides, proteins, and polyphenols, resulting in the difficulties of RNA isolation with both high quantity and quality.To optimize the technology of RNA isola-tion from blueberry tissues, five methods for RNA extraction from immature fruit of blueberry were evaluated. The results showed that the most efficient technique for RNA isolation from blueberry fruits was the optimized CTAB-KAc-based method.A subsequent experiment showed that the optimized CTAB-KAc-based technique was also efficient in successful RNA isolation from full-expanded leaf, green stem, flower, immature fruit and mature fruit of blueberry, although protocol for roots still needed to be optimized.The method yielded 143.37μg· g-1 high-quality RNA without DNA contamination within 3 h.The ratios of A260/A280 and A260/A230 of the total RNA from immature fruit of blueberry were 2.02 and 2.46, respectively.Reverse transcription-PCR con-firmed that the isolated RNA was of appropriate quality and integrity for subsequent molecular biology studies.

摘要： 本文对某实验室已经建立的SV40介导的永生化人源性肝细胞系HepLL进行生物学特性及表型鉴定.方法：以正常肝脏组织、肝癌组织作为对照,用免疫组织化学、过碘酸-Schiff糖原染色、逆转录PCR、蛋白质印迹等方法对永生化HepLL细胞进行生物学特征观察.结果：永生化HepLL细胞和正常肝脏组织均表达肝细胞特异性抗原,部分表达增生标记KI67抗原,甲胎蛋白表达阴性,糖原PAS染色正常肝脏组织和永生化肝细胞均阳性,经逆转录PCR和蛋白质印迹检测,HepLL细胞的白蛋白mRNA和细胞色素P4502E1阳性.结论：本实验室建立的以SV40介导的永生化人源性肝细胞系HepLL具有正常肝细胞所特有的类似生物学特性,可作为生物型人工肝支持系统和肝细胞研究的理想细胞源.

摘要： 本文对某实验室已经建立的SV40介导的永生化人源性肝细胞系HepLL进行生物学特性及表型鉴定.方法：以正常肝脏组织、肝癌组织作为对照,用免疫组织化学、过碘酸-Schiff糖原染色、逆转录PCR、蛋白质印迹等方法对永生化HepLL细胞进行生物学特征观察.结果：永生化HepLL细胞和正常肝脏组织均表达肝细胞特异性抗原,部分表达增生标记KI67抗原,甲胎蛋白表达阴性,糖原PAS染色正常肝脏组织和永生化肝细胞均阳性,经逆转录PCR和蛋白质印迹检测,HepLL细胞的白蛋白mRNA和细胞色素P4502E1阳性.结论：本实验室建立的以SV40介导的永生化人源性肝细胞系HepLL具有正常肝细胞所特有的类似生物学特性,可作为生物型人工肝支持系统和肝细胞研究的理想细胞源.

摘要： 本文对某实验室已经建立的SV40介导的永生化人源性肝细胞系HepLL进行生物学特性及表型鉴定.方法：以正常肝脏组织、肝癌组织作为对照,用免疫组织化学、过碘酸-Schiff糖原染色、逆转录PCR、蛋白质印迹等方法对永生化HepLL细胞进行生物学特征观察.结果：永生化HepLL细胞和正常肝脏组织均表达肝细胞特异性抗原,部分表达增生标记KI67抗原,甲胎蛋白表达阴性,糖原PAS染色正常肝脏组织和永生化肝细胞均阳性,经逆转录PCR和蛋白质印迹检测,HepLL细胞的白蛋白mRNA和细胞色素P4502E1阳性.结论：本实验室建立的以SV40介导的永生化人源性肝细胞系HepLL具有正常肝细胞所特有的类似生物学特性,可作为生物型人工肝支持系统和肝细胞研究的理想细胞源.

摘要： 本文对某实验室已经建立的SV40介导的永生化人源性肝细胞系HepLL进行生物学特性及表型鉴定.方法：以正常肝脏组织、肝癌组织作为对照,用免疫组织化学、过碘酸-Schiff糖原染色、逆转录PCR、蛋白质印迹等方法对永生化HepLL细胞进行生物学特征观察.结果：永生化HepLL细胞和正常肝脏组织均表达肝细胞特异性抗原,部分表达增生标记KI67抗原,甲胎蛋白表达阴性,糖原PAS染色正常肝脏组织和永生化肝细胞均阳性,经逆转录PCR和蛋白质印迹检测,HepLL细胞的白蛋白mRNA和细胞色素P4502E1阳性.结论：本实验室建立的以SV40介导的永生化人源性肝细胞系HepLL具有正常肝细胞所特有的类似生物学特性,可作为生物型人工肝支持系统和肝细胞研究的理想细胞源.

摘要： 本文对某实验室已经建立的SV40介导的永生化人源性肝细胞系HepLL进行生物学特性及表型鉴定.方法：以正常肝脏组织、肝癌组织作为对照,用免疫组织化学、过碘酸-Schiff糖原染色、逆转录PCR、蛋白质印迹等方法对永生化HepLL细胞进行生物学特征观察.结果：永生化HepLL细胞和正常肝脏组织均表达肝细胞特异性抗原,部分表达增生标记KI67抗原,甲胎蛋白表达阴性,糖原PAS染色正常肝脏组织和永生化肝细胞均阳性,经逆转录PCR和蛋白质印迹检测,HepLL细胞的白蛋白mRNA和细胞色素P4502E1阳性.结论：本实验室建立的以SV40介导的永生化人源性肝细胞系HepLL具有正常肝细胞所特有的类似生物学特性,可作为生物型人工肝支持系统和肝细胞研究的理想细胞源.

摘要： 核糖核酸(Ribonucleic acid,RNA)是存在于生物细胞以及部分病毒、类病毒中的遗传信息载体,它在调控基因表达中发挥重要的功能,随着人类对DNA和蛋白质功能的深入了解,越来越多的研究者更加关注于生物体RNA水平的变化,采用逆转录PCR(Reverse Transcription PCR,RT-PCR)方法检测基因转录及表达水平的差异,以此寻找疾病相关的确切的分子标志物或靶基因,从而为多种疾病的诊断和治疗提供有力证据.

摘要： 核糖核酸(Ribonucleic acid,RNA)是存在于生物细胞以及部分病毒、类病毒中的遗传信息载体,它在调控基因表达中发挥重要的功能,随着人类对DNA和蛋白质功能的深入了解,越来越多的研究者更加关注于生物体RNA水平的变化,采用逆转录PCR(Reverse Transcription PCR,RT-PCR)方法检测基因转录及表达水平的差异,以此寻找疾病相关的确切的分子标志物或靶基因,从而为多种疾病的诊断和治疗提供有力证据.

摘要： 核糖核酸(Ribonucleic acid,RNA)是存在于生物细胞以及部分病毒、类病毒中的遗传信息载体,它在调控基因表达中发挥重要的功能,随着人类对DNA和蛋白质功能的深入了解,越来越多的研究者更加关注于生物体RNA水平的变化,采用逆转录PCR(Reverse Transcription PCR,RT-PCR)方法检测基因转录及表达水平的差异,以此寻找疾病相关的确切的分子标志物或靶基因,从而为多种疾病的诊断和治疗提供有力证据.

摘要： 核糖核酸(Ribonucleic acid,RNA)是存在于生物细胞以及部分病毒、类病毒中的遗传信息载体,它在调控基因表达中发挥重要的功能,随着人类对DNA和蛋白质功能的深入了解,越来越多的研究者更加关注于生物体RNA水平的变化,采用逆转录PCR(Reverse Transcription PCR,RT-PCR)方法检测基因转录及表达水平的差异,以此寻找疾病相关的确切的分子标志物或靶基因,从而为多种疾病的诊断和治疗提供有力证据.

摘要： 本发明提供一种PCR反应增强剂组合物，其包含T4噬菌体基因32编码蛋白、海藻糖和诺纳德P‑40中任意一种。本发明还提供一种微滴式逆转录数字PCR反应液，其特征在于，其包含PCR反应增强剂组合物，所述PCR反应增强剂组合物包含T4噬菌体基因32编码蛋白、海藻糖和诺纳德P‑40中任一种；优选地，所述PCR反应液包含0.05～1mg/mL T4噬菌体基因32编码蛋白、0.1～2mol/L海藻糖、0.02～1％w/v诺纳德P‑40。本发明还涉及包含所述PCR反应液的试剂盒以及利用所述PCR反应液进行微滴式逆转录数字PCR的方法。利用本发明提供的PCR反应液能提高阳性微滴逆转录PCR扩增效率，减少假阴性的产生，有利于核酸靶分子的精准定量分析。

摘要： 本申请涉及用于增强逆转录酶(RT)活性和/或减少RT被抑制剂(例如福尔马林、单宁酸和/或肝素)抑制的组合物和方法。在一些实施方式中，通过向包含聚合酶的反应混合物中添加谷氨酸钾、组氨酸盐酸盐一水化物、泊洛沙姆188或其任意组合，以减少RT抑制。在其他实施方式中，通过向反应混合物中添加聚乙烯磺酸钠盐(PVSA)来增强RT。本申请还提供了用于目标序列的逆转录及其增强的寡核苷酸引物。这些引物具有高GC含量或低GC含量。还提供了在具有RNA模板和RT的组合物中使用RT抑制减少剂或RT增强剂改进RT产量、RT敏感性或RT对各种化学品的耐受性的方法。

摘要： 本发明提供了一种逆转录酶及逆转录检测试剂，具体地，本发明构建了逆转录酶(M‑MLV)突变库，通过大量筛选，最终筛选出了热稳定性提高且扩增效率较高的逆转录酶突变体，进而提供了包含本发明的逆转录酶突变体的逆转录检测试剂。

摘要： 本发明提供了逆转录酶突变体及逆转录方法，具体地，本发明构建了逆转录酶(M‑MLV)突变库，通过逐步筛选，最终筛选出了热稳定性提高且扩增效率较高的突变体，进而提供了使用该逆转录酶突变体的高效逆转录方法。

摘要： 本发明提供了具有高逆转录效率的耐高温逆转录酶突变体及其应用，具体地，本发明构建了逆转录酶(M‑MLV)突变库，通过逐步筛选，最终筛选出了热稳定性提高且扩增效率较高的突变体(逆转录酶突变体Mu_38)。在高温条件下(58°C)，与野生型相比，本发明的逆转录酶突变体Mu_38的逆转录效率提高了22.47倍。

摘要： 本发明提供了高逆转录效率的逆转录酶突变体，具体地，本发明构建了逆转录酶(M‑MLV)突变库，通过逐步筛选，最终筛选出了热稳定性提高且扩增效率较高的突变体(逆转录酶突变体Mu_26)。在高温条件下(58°C)，与野生型相比，本发明的逆转录酶突变体Mu_26的逆转录效率提高了442.64倍。

摘要： 本发明提供了一种具有高逆转录效率的耐高温逆转录酶突变体及其应用，具体地，本发明构建了逆转录酶(M‑MLV)突变库，通过逐步筛选，最终筛选出了热稳定性提高且扩增效率较高的突变体(逆转录酶突变体Mu_40)。在高温条件下(58°C)，与野生型相比，本发明的逆转录酶突变体Mu_40的逆转录效率提高了46.52倍。

摘要： 本发明提供了泊洛沙姆在提高逆转录酶效率或提高逆转录酶抑制剂耐受性中的应用，以及以泊洛沙姆为核心成分配制的用于逆转录过程中的添加剂混合物。这种添加剂混合物不仅能够提高正常高纯度RNA样本的逆转录产物（约8倍），对复杂来源RNA样本如FFPE RNA或含甲醛、乙醇、盐酸胍、异硫氰酸胍、肝素、鞣酸、甲酰胺和苯酚等逆转录抑制剂的RNA具有更强的耐受和更高的cDNA产量。这种逆转录酶添加物组合可以在RT‑qPCR检测和RNA NGS建库上显著提高复杂来源病理学样本检测的灵敏度和准确性，非常适用于疾病快速诊断领域。

摘要： 本发明公开一种逆转录病毒原病毒序列在逆转录病毒疫苗设计中的应用，针对特定个体或特定人群感染的原病毒序列，设计亚单位疫苗、灭活疫苗、减活疫苗、重组疫苗和核酸疫苗等。能够直接激活人体免疫系统产生特异性抗患者所携带逆转录病毒的抗体，既回避了流行中逆转录病毒病毒株耐药的痼疾，又特异性靶向患者所携带逆转录病毒毒株。由于逆转录病毒感染者所携带的原病毒序列是整合入人体基因组的DNA序列，它相较于其他感染形式中的RNA序列具有高度保守性，故据此应用设计开发的疫苗具有更强的特异性，是克服目前逆转录病毒疫苗研发瓶颈的一个候选者，具有更好的应用前景。

摘要： 本发明涉及一种逆转录方法、逆转录试剂盒及其应用，所述的逆转录试剂盒包含NP‑40裂解液或碱裂解试剂；所述的裂解试剂为NP‑40裂解液，所述的NP‑40裂解液配方为：RNase‑Free H