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第三届全国核酸疫苗学术研讨会

第三届全国核酸疫苗学术研讨会

  • 召开年：2008
  • 召开地：武汉
  • 出版时间： 2008-06-14

主办单位：中国科学院武汉病毒研究所

会议文集：第三届全国核酸疫苗学术研讨会论文集

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  • 摘要：@@ 疫苗预防接种被认为是彻底消灭传染病最经济有效的措施。但在艾滋病疫苗研究领域，虽然自1987年以来，全球六大洲28个国家共有近63个艾滋病侯选疫苗进行了156项临床试验，但目前仍无有效的疫苗问世。从而，HIV疫苗的研究策略仍在不断地改进和完善。rn 近年来，随着艾滋病病毒免疫生物学和免疫病理学的飞速进展，保护性免疫的概念也发生了深刻变化，研究表明：HLA—I类分子介导的细胞免疫，特别是由抗原特异性CTL所介导的细胞毒作用，在控制HIV感染的过程中起核心作用，是清除细胞内感染病毒的关键。有效的保护性免疫源于一组表位的合理组合与搭配，基于多表位组合的重组疫苗有望打破宿主对HIV抗原的免疫耐受。在预防性和治疗性疫苗诱导产生有效的细胞免疫应答方面，基于多CTL表位的疫苗可以在疫苗设计中进行嵌合，达到诱生针对多CTL表位、特异而广泛的免疫应答的目标。
  • 摘要：本研究采用分泌型真核表达载体VR1020(以pUC18为骨架，具有CMVIE基因的启动子、增强子、内含子A序列、TPA信号肽序列和BGH转录终止序列及poly(A)信号，卡那霉素抗性)和真核表达载体pVA×1(通过FDA认证，卡那霉素抗性)构建禽传染性支气管炎病毒(IBV)肾型SAIBk分离株的S1、M和N基因的真核表达质粒。rn 根据禽传染性支气管炎病毒(IBV)本课题组分离株SAIBK的全基因组序列(D0288927)和vR1020及pvA×1的多克隆位点设计合成用于扩增S1、M和N基因的六对引物，加上相应的酶切位点。其中，N基因上的第375bp处有一BglⅡ酶切位点，为方便载体VRl020(多克隆位点为：BamHI和Bg/Ⅱ)的克隆，设计并合成一对定点突变引物。
  • 摘要：本研究以本课题组构建的携带禽传染性支气管炎病毒S1、M、N基因真核表达质粒(pVA×1-S1、pVA×1-M、pVA×1-N、VR1020-S1、VR1020-M、VR 1020-N)的大肠杆菌工程菌为研究对象，对其发酵工艺进行了研究。采用单因子分析和正交设计，摇瓶发酵对各重组大肠杆菌基因工程菌的培养基条件进行了研究，包括碳源、氮源和无机盐离子的筛选，并在5L发酵罐中扩大培养优化其接种量、培养温度、初始pH及溶氧等培养条件。对发酵液用热激法和碱裂解法两种不同的提取方法进行粗提比较，对碱裂解法进行优化，对裂解时间和裂解反应液的比例进行研究，再用聚乙二醇和硅藻土两种方法进行纯化比较。本研究确定优化了培养基的成份，为12g/L胰蛋白胨，4g/L酵母提取物，10g/L葡萄糖，6ml/L甘油，3g/L NaCl，8g/L Na2HPO4，3g/LKH2PO4。优化了上罐发酵培养条件，为接种量5％、温度42℃、pH7.2、D050％。建立了以碱裂解法粗提，硅藻土法纯化的质粒DNA提纯工艺。该工艺可去除大部分RNA、基因组DNA和蛋白质等杂质，提取的质粒DNA纯度可达到1.88，超螺旋比例达到98.4％，符合世界卫生组织关于质粒产品的质量要求。与传统纯化方法比较，生产成本降低了20-40％。本研究降低了基因工程菌发酵和质粒提取的生产成本，为DNA疫苗的大规模生产提供了理论和实验依据。
  • 摘要：自基因疫苗问世以来，科学家们已对预防和治疗人类及动物疾病的基因疫苗进行了大量的研究，主要集中在微生物感染性疾病、寄生虫病、肿瘤、遗传病和其他多种疾病，较少地涉及到动物繁殖领域。卵泡抑制素基因疫苗和生长抑素基因疫苗的开发丰富了基因免疫技术在动物繁殖领域的应用。
  • 摘要：@@ 犬传染性肝炎病毒，又称犬腺病毒(简称：CAV)，属于腺病毒科哺乳动物腺病毒属成员，是哺乳动物腺病毒属中致病性最强、形态结构研究得较清楚的一种动物病毒。CAV分为两种抗原相关型，即犬腺病毒I型(CAV-1)和犬腺病毒Ⅱ型(CAV-2)。其中CAV-1称犬传染性肝炎病毒(CIHV)，主要引起犬传染性肝炎和熊、狐脑炎。本研究分析了I型犬腺病毒抗原基因，确定具有中和抗原决定簇的Loop1和Loop2基因为犬传染性肝炎核酸疫苗候选基因。设计、合成抗原基因Loop，构建了犬传染性肝炎核酸疫苗，真核表达质粒pVA×1-CpG Loop和原核表达质粒pET28a—Loop。脂质体转染，证实pVA×1-CpG—Loop质粒能在体外表达Loop基因。采用肌肉注射，电转，以及肌肉、皮下和鼻粘膜联合的不同的免疫途径、不同的免疫剂量和不同的免疫策略，都能使小鼠产生特异性IgG抗体和中和抗体，以联合免疫抗体水平最高。淋巴细胞增殖、T淋巴细胞亚群分类和干扰素γ的测定，表明pVA×1-CpG—Loop DNA疫苗在诱导体液免疫产生的同时，也诱导细胞免疫的产生。
  • 摘要：针对草原兔尾鼠透明带3(ZP3)DNA不育疫苗的研究已经取得了很大的进展，但在实际应用中还有许多问题有待进一步解决。寻找理想的免疫佐剂、发送载体以及更合适的免疫途径，增强ZP3抗原的免疫原性，才能解决草原兔尾鼠DNA不育疫苗的实际应用。本研究旨在探索提高草原兔尾鼠透明带3(ZP3)DNA不育疫苗粘膜免疫反应的有效方法。用壳聚糖包裹pcDNA3-Lp3制备成pcDNA3-Lzp3壳聚糖纳米微粒，并通过点眼、滴鼻、口服等不同粘膜免疫途径免疫小鼠，对照组免疫为不包裹壳聚糖的DNA疫苗，每7天加强免疫一次，每只小鼠免疫100μg质粒/次，14 d后，间接ELISA法检测小鼠血清中抗LZP3 IgG抗体，结果显示，滴鼻免疫组和口服免疫组诱导的特异性抗LZP3的IgG水平均高于对照组;但滴鼻免疫组与口服免疫组相比较，滴鼻免疫组的lgG水平更高，说明滴鼻免疫途径比口服免疫途径更能有效地刺激了小鼠机体的粘膜免疫应答。rn 这可能是因为滴鼻免疫途径使DNA疫苗经鼻粘膜丰富的毛细血管吸收后直接进入体循环，免受胃肠道中酶的破坏，提高DNA疫苗摄人量。为增强草原兔尾鼠透明带3(ZP3)DNA不育疫苗的粘膜免疫效果，研究选取了IL-15(白细胞介素15)作为草原兔尾鼠ZP3 DNA疫苗的分子佐剂。IL-15是一种多功能细胞因子，可活化中性粒细胞、巨噬细胞、T细胞和B细胞，刺激B1细胞增殖，促进细胞因子的分泌和抗体生成，对免疫反应的起始具有重要作用。许多实验证明IL-15作为分子佐剂能够增强粘膜免疫活性。通过滴鼻免疫途径，用proVAX-IL-15和卵透明带不孕疫苗pcDNA3-Lzp3共免疫6～8周龄雌性小鼠，同时以pcDNA3-Lzp3和pcDNA3为对照组。7 d免疫一次，每次每只小鼠免疫200gg质粒，免疫两次后，ELISA检测血清中特异性抗LZP3的IgG抗体水平，结果显示proVAX-IL-15和pcDNA3-Lzp3共免疫组的IgG抗体水平显著高于对照组，说明IL-15分子佐剂通过滴鼻粘膜免疫途径显著提高草原兔尾鼠透明带3(ZP3)DNA疫苗的免疫效果，增强了ZP3的免疫原性，IL-15是一种极具潜力的粘膜免疫佐剂。本研究的结果有助于DNA粘膜不育疫苗的开发，为草原兔尾鼠透明带3(ZP3)DNA不育疫苗的应用奠定基础。
  • 摘要：目的：构建新型的以减毒伤寒杆菌(SL7207)为载体的抗结核DNA疫苗，以期获得一种安全高效的结核疫苗。rn 方法：本实验以Ag85B、ESAT6为目的基因，构建了原核(pGEX-KG-Ag85B)以及真核(pVA×1-Ag85B,pVA×1-Ag85B-ESAT6)表达质粒，并将真核表达质粒最终转入减毒伤寒杆菌(SL7207)中，获得以减毒伤寒杆菌(SL7207)为载体的新型结核疫苗SL7207(pVA×1-Ag85B)以及SL7207(pvA×1-Ag85B—ESAT6)，并将其应用于动物水平的实验研究。我们将构建正确的减毒伤寒载体疫苗、真核表达质粒、阳性对照BCG、阴性空载体对照以及空白对照生理盐水分别免疫实验小鼠，每隔两周免疫一次，共免疫三次，分别在每次免疫后两周取小鼠尾静脉血，末次免疫后两周处死小鼠进行体液免疫及细胞免疫学检测。采用ELISA法检测每次免疫后两周小鼠尾静脉血清中特异性抗体的效价及末次免疫后两周小鼠血清抗体亚型的效价;颗粒酶释放实验及ELISPOT法检测小鼠脾细胞细胞因子的分泌;末次免疫后两周在A3实验室进行小鼠H37Rv攻毒实验，观察小鼠的生存时间，攻毒后70天处死小鼠做脾肺的菌落计数，脾肺的病理切片观察等。rn 结果：未攻毒小鼠，血清中抗体随着免疫次数的增加而明显升高且减毒伤寒载体疫苗组明显高于空载体对照组，能产生针对结核杆菌的特异性抗体;减毒伤寒载体疫苗组小鼠的肠道sIgA水平最高，进一步提高机体的免疫力;细胞免疫检测中，ELISPOT结果显示载体疫苗组分泌IFN-的细胞数量明显高于对照组。而ILA不明显，呈现出以Th1型免疫反应为主的免疫应答;颗粒酶释放实验显示实验组的CD8+T淋巴细胞针对结核杆菌的特异性免疫应答增强;结核杆菌H37Rv攻读实验中，减毒伤寒杆菌载体疫苗组的小鼠生存时间明显长于对照组，菌落计数及病理切片也可以看出疫苗组病理损害较对照组轻。rn 结论：以减毒伤寒杆菌为载体构建的结核DNA疫苗，可以明显增强免疫小鼠的体液免疫以及细胞免疫应答，能提高感染小鼠的生存率并减轻病理损害，对结核杆菌感染具有高效的预防作用。
  • 摘要：自1992年证实表达DNA质粒进入体内后可以激活动物机体产生专一性地免疫反应以来，在全世界范围内迅速掀起了一股DNA疫苗研究热。在近十年时间里，科学工作者在鼠、鸡、猪、牛、猫、猴、黑猩猩和人等动物中进行了广泛深入的抗病毒、抗细菌、抗寄生虫、抗肿瘤及免疫不育的DNA疫苗研究。由于DNA疫苗能诱导机体产生体液免疫和细胞免疫，并兼有减毒活疫苗的有效性和亚单位疫苗的安全性，而且制作简单、经济、易于储存运输等优点已在免疫学领域引起一场重大的革命，并因此而提出是疫苗领域的第三次革命。
  • 摘要：CpG motif是一些以非甲基化的胞嘧啶、鸟嘌呤二核苷酸(CpG)为模体的寡聚脱氧核苷酸(oligo-deoxynucleotides，ODN)的免疫刺激序列，是经研究证实的一种新型疫苗佐剂。为克服人工合成的CpG ODN容易降解、成本高的缺陷，将其克隆到质粒载体上以便于规模化发酵培养和生产，改进和提高疫苗免疫效果，但以其重组质粒(CpG DNA)作为佐剂接种动物机体后，能否产生转基因生物安全隐患，需对其在动物体内的组织分布、基因组整合以及排出体外后对环境微生物的影响进行系统评价。rn 本研究自2005年开始按照农业部对转基因生物安全评价的有关规定以及中间试验、环境释放试验和生产性试验批复的具体要求，对CpG DNA重组质粒作为口蹄疫灭活疫苗的免疫佐剂的安全性问题进行了系统研究和评价。rn 各阶段试验证实：CpG DNA重组质粒大剂量接种免疫实验动物小鼠(1000μg/只，常规剂量的10倍)和靶动物猪(1000μg/头，常规剂量的5倍)后，没有出现可见的毒副作用。在CpG DNA重组质粒接种试验猪24h后，其主要存在于接种部位的肌肉组织中;接种后3～10d，重组质粒随血液循环进入并主要分布在脾脏、肺脏、肾脏等多种器官组织中;在接种后15d，实验猪的所有组织中均已检测不到重组质粒，说明重组质粒已全部代谢或排出体外。在CpG DNA重组质粒接种猪的各组织细胞的基因组DNA中均未PCR扩增出CpG基序序列，表明CpG DNA重组质粒整合到动物机体基因组上的可能性极小。CpG DNA重组质粒接种靶动物后，其分泌物和排泄物中也未检测到重组质粒的存在，说明质粒进入体内后经过一段时间后大部分会被代谢降解，不会以原型的重组质粒DNA排泄到体外。在接种动物环境样品中，所有样品没有检测到CpG DNA重组质粒所携带的CpG和Lac启动子基因序列，但部分样品扩增到了Amp抗性基因，但与环境微生物所携带Amp抗性基因序列的同源性较高，阳性样品率与对照样品相似，说明接种动物环境现场采集样品扩增出的抗性基因可能与动物接种重组质粒没有直接关系，不会转化环境微生物而影响其遗传特性。rn 结论：CpG DNA重组质粒作为猪口蹄疫灭活疫苗的佐剂，不会对动物和环境造成潜在危害，具有较高的转基因生物安全性。
  • 摘要：口蹄疫是一种急性烈性传染病，可引起畜牧业较大的损失，疫苗是防止这一疾病的有效的一种方式，但现有的灭活疫苗的保护效果还未能达到100％，而且本身灭活疫苗还可能由于灭活不彻底而存在带毒的危险。口蹄疫病毒传播的主要途径是通过呼吸道传播，所以诱导黏膜反应是防御病毒传染的有效方式。口蹄疫DNA疫苗可以诱导一定的黏膜反应，但其免疫应答非常微弱，所以用各种办法来增强其免疫效果。
  • 摘要：多表位核酸疫苗能被多种遗传背景的MHC分子识别、结合，从而得到高效的递呈;在细胞免疫方面具有独特的优势;可以有效应对病原微生物的变异和免疫反应中的诸多不利因素，多表位核酸疫苗可能成为疫苗研究的突破口，为了探讨多表位核酸疫苗防治禽传染性支气管炎病(IB)的可能性，本研究以本实验室鸡传染性支气管炎SAIBK株全基因组序列为材料，采用Lasergene软件对IBV结构蛋白进行二级结构分析，抗原表位分析采用Kyte-Doolittle法分析氨基酸序列亲水性、Emini法预测特定区域位于蛋白质表面的可能性、Jameson-Wolf法预测各结构蛋白的抗原指数，综合分预测结果，有针对性的选择能获得最佳免疫保护目的表位：采用Sl糖基化B细胞表位保守序列E1和能有效产生保护性抗体滴S2 N端保守B细胞表位E2;以及能诱导CTL效应N核蛋白C端120残基，表位之间连接采用“AAY”氨基酸序列以提高表位被切割的效率，并通过Lasergene软件分析确保各表位之间独立和完整，将设计好多表位基因序列由上海旭冠生物合成，经过酶切定向克隆pVA×1核酸疫苗载体。并将多表位基因克隆至原核表达载体pGEX4T-1，经过IPTG诱导、超声破碎细胞、GST谷胱甘肽凝胶纯化上清成功获得了多表位纯化蛋白，将多表位纯化蛋白包被ELISA板，用IBV阳性多价血清检测其免疫原性，试验结果初步表明多表位纯化蛋白具有免疫原性，能和多价血清发生交叉反应。综合以上结果，我们初步构建了禽传染性支气管炎病毒多表位核酸疫苗，为研制高效、安全的IBV多表位核酸疫苗提供理论依据和基础材料。
  • 摘要：减毒沙门氏菌是粘膜免疫的理想载体，是目前最常用的减毒活疫苗载体之一。本实验以美国亚利桑那州立大学生物中心的Roy CurtissⅢ教授馈赠的大肠杆菌E·coliX6212为中间宿主菌，减毒鼠伤寒沙门氏菌(Salmonellatyphimurium)X4550为终末宿主菌。采用四川大学生命科学学院动物疾病防控生物工程研究中心实验室保存的禽传染性支气管炎病毒SAIBK株为材料。用RT-PCR方法扩增禽传染性支气管炎病毒抗原基因S1，M，N;双酶切后定向克隆至真核质粒表达载体pv.AXl(符合2005年美国FDA对用于传染性疾病防控的DN。A疫苗载体的规定(G,uidance for Industry Considerations for PlasmidDNA Vaccines for Infectious DiseaseIndications，2005))，先转化中间宿主大肠杆菌E·coliX6212，获得阳性重组质粒pvAX-S1，pvAX-M，pVAX-N，再分别将其转化至终末宿主菌减毒鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella tyohimurium)X4550。通过对重组质粒双酶切和测序均正确。鉴定结果表明，成功构建了携带禽传染性支气管炎病毒pVA×1-S1，：pVA×1-M，pVA×1-N真核表达质粒的减毒沙门氏菌活载体疫苗。该活载体疫苗既有真核质粒表达载体pVAXl高效免疫效应优点，又有减毒沙门氏菌疫苗载体有效的定植作用，可以刺激宿主黏膜、体液及细胞免疫。有较好的双重免疫效果。
  • 摘要：@@结核病和布鲁氏病是严重危害人类健康和畜牧业发展的人畜共患传染病。疫苗是控制结核病和布鲁氏病的有效方法。目前，BCG是预防结核病的唯一疫苗，但其免疫效力不稳定，且对成年人无保护;;S19疫苗是在牛布鲁氏病中使用的疫苗，但血清学反应强，且安全性受到质疑，有感染人的可能。因此，高效的新型疫苗对于控制结核病和布鲁氏病蔓延至关重要。
  • 摘要：@@ 乙肝是危害我国人民健康的严重疾病，目前公认的抗HBV药物如干扰素和核苷类似物只能抑制而不能清除病毒，且有效率仅为40％左右，长期用药容易诱发病毒变异，停药后病情易反跳。新近研究证明，机体清除HBV的关键是建立健全的特异性免疫功能，其中特异性细胞免疫在抗HBV感染中起着核心作用。rn 在此基础上诞生了多种HBV治疗性疫苗，目前国内已批准临床试验的疫苗有：rn (1)抗原抗体复合物疫苗;(2)乙肝病毒表面抗原蛋白疫苗;(3)乙肝病毒核心抗原表位多肽疫苗;(4)HBV DNA疫苗。前三种疫苗已在临床验证多年，但仍没见到公认性结论报告。而HBV DNA疫苗由于能表达天然构像的抗原，可诱导全面的免疫应答，是近年研究的热点。韩国DONG-A药厂(06年)和法国巴斯德研究所(04年)分别对HBV DNA疫苗进行单独应用和与抗病毒药联合应用的临床试验研究，结果表明，治疗性HBV DNA疫苗不但可以显著降低乙肝抗病毒药治疗后的复发率，而且可以打破HBV免疫耐受，直接清除病毒，是慢乙肝治疗的新希望。
  • 摘要：目的：基因疫苗因可同时诱导特异性细胞免疫和体液免疫，已成为抗感染疫苗设计的良好候选。在前期构建的pcDNA3-VP1基因疫苗以及Chitosan-DNA(pVP1)疫苗滴鼻免疫在小鼠体内诱导特异性体液和细胞免疫预防柯萨奇病毒心肌炎基础上，为进一步提高疫苗效果，引入淋巴细胞趋化因子(Lymphotactin，Ltn)作为基因佐剂。本研究试图比较Ltn与靶抗原VP1构建于同一真核表达载体(共表达)或分别表达于不同载体而后共同免疫(共免疫)的效果。rn 方法：分别构建了pcDNA3-VP1和pcDNA3-VP1-Ltn、pcDNA3-VP1-linker-Ltn、pcDNA3-VP1-IRES-Ltn三种共表达质粒，加上pcDNA3-VP1+pcDNA3-Ltn共免疫，并以这5组质粒分别与chitosan形成chitosan-DNA复合物，间隔10天4次滴鼻免疫小鼠，比较了诱导的特异性免疫应答和预防病毒性心肌炎效果。rn 结果：以不同方式构建于pLtn和p-VP1-Ltn、p—VP1-linker-Ltn、p-VP1-IRES-Ltn 3种共表达质粒中的Lptn均可在体外有效表达，并发挥其趋化活性，其中p-VP1-IRES—Ltn质粒表达的Ltn趋化活性最高。rn 免疫BALB/c小鼠特异性免疫显示：Ltn佐剂以任何方式与靶抗原VPl共构建表达均可增强特异性抗体的诱导，其中Chitosan-p-VP1-IRES-Ltn疫苗能诱导最高水平的血清IgG，而Chitosan-pVP1与Chitosan-pLtn共免疫能产生最高水平的肠道粘膜SIgA，其诱导的分泌IFN的脾脏或肠系膜淋巴结T细胞免疫亦显著高于其他各组。Ltn以任何方式与靶抗原VP1共构建均可增强T细胞免疫，但Ltn与VP1共同构建时，之间插人linker或IRES序列并不能显著增强其T细胞免疫佐剂效果。Chitosan-pLtn效果显著优于pLtn佐剂效果。病毒性心肌炎预防效果亦证实上述结论。rn 结论：佐剂递送载体和与靶抗原的构建方式可显著性影响其佐剂效果，其机制可能与其有效表达和趋化功能发挥相关。Chitosan-Ltn佐剂质粒与ehitosan-靶抗原质粒共同免疫可显著增强基因免疫诱导的特异性粘膜SIgA和T细胞免疫。
  • 摘要：@@ 丙型肝炎病毒(hepatitis C vims，HCV)主要通过输血传播，它是导致全世界慢性肝脏疾病的主要原因。丙型肝炎已成为全球性的公共卫生问题，严重影响了社会和经济的发展。目前全世界还没有有效的抗HCV疫苗。DNA疫苗作为一种新型疫苗已引起人们广泛的注意，它可诱导机体产生体液和细胞免疫应答，并已在其它许多感染性疾病与肿瘤的防治研究中取得较好进展。
  • 摘要：新型结核疫苗的研制极为迫切。前期研究以结核抗原HSP65作为载体，嵌入来自结核Ag85A、Ag85B、CFP-10和ESAT-6蛋白的优势T细胞表位，构建了新型结核疫苗-pECANS，并证实经肌注免疫能够有效诱生结核特异性全身免疫应答。本研究目的是根据结核杆菌通过呼吸道粘膜感染的特点，综合pECANS疫苗诱生T细胞免疫的优势，在已建立的粘膜递送系统chitosan-DNA的基础上，构建新型结核粘膜基因疫苗chitosan-pECANS，旨在诱生全身及肺粘膜局部结核特异性免疫应答。

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