pcDNA3.1(+)

摘要： 目的研究使用脂质体转染时目的基因大小对转染效率影响。方法将大小差异显著的目的基因连接到同一载体,脂质体转染法分别将上述两种目的基因转染至FRT细胞,转染完成24 h后,应用倒置荧光显微镜和流式细胞仪分析转染效率,检测目的基因的大小对转染效率的影响。结果转染效率均随着脂质体用量增加而上升,无论脂质体浓度如何选择,两种真核表达载体的转染效率均有显著性差异,且目的基因越大,转染效率越低。结论目的基因与转染效率成反比。

摘要： 目的 构建pcDNA3.1(+)-NPM1真核表达质粒,体外转染人膀胱移行细胞癌pumc-91细胞并观察其表达情况.方法 设计引物,采用PCR扩增核仁磷蛋白1(Nucleophosmin,npm1)基因编码序列;运用基因重组方法对其进行双酶切,插入pcDNA3.1(+)载体,经菌液PCR、测序对重组质粒进行鉴定.将成功构建的质粒经脂质体介导转染至pumc-91细胞,Western blot验证蛋白表达情况.结果 经菌液PCR、测序鉴定表明成功构建pcDNA3.1(+)-NPM1质粒,将成功构建的质粒转染至pumc-91细胞,Western blot证实转染pcDNA3.1(+)-NPM1表达质粒的pumc-91细胞npm1蛋白过表达.结论 成功构建pcDNA3.1(+)-NPM1重组质粒,为进一步研究NPM1蛋白的功能奠定基础.%Objective To construct the Eukaryotic expression plasmids pcDNA3.1 (+)-NPM1,then transfect human bladder cancer pumc-91 cells in vitro,and observe its proteinexpression condition.Methods Nucleophosmin (Npm1)primers were designed,and the gene was amplified by using PCR.The produced Npm1 gene was double enzyme digested and then was inserted into pcDNA3.1 (+) vectorby using the gene recombination technology.Recombined plasmid was identified with bacterial PCR and following sequencing.The successful construction of pcDNA3.1 (+)-NPMlwas transfected into pumc-91 cells.Western blot was used to confirm its over-expression.Results The results of bacterial PCR and sequencing revealed that the recombinant plasmid pcDNA3.1 (+)-NPM1 were successfully constructed.After transfecting pumc-91 cells with pcDNA3.1 (+)-NPM1,western blot results showed the upregulated npm1 protein levels.Conclusion The Eukaryotic expression plasmids pcDNA3.1 (+)-NPM1 was constructed and expressed in pumc-91cells with promising successfully rate,which developesthe good foundation for future research on biological function of NPM1 protein.

摘要： 目的 探讨Hint2基因过表达质粒的构建及其对肝癌细胞BEL-7402迁移的影响.方法 根据Hint2基因设计引物,扩增Hint2基因全长并以pcDNA3.1(+)为载体构建Hint2过表达质粒.转染BEL-7402细胞提取mRNA和总蛋白,分别使用Real-time PCR和Western blot检测转染细胞Hint2 mRNA和蛋白质表达的变化,应用免疫荧光染色法对细胞中Hint2蛋白与细胞线粒体进行共定位.使用划痕愈合实验检测Hint2过表达后对肝癌细胞BEL-7402迁移能力的影响.结果 转染Hint2过表达质粒细胞的Hint2 mRNA和蛋白表达显著上调,免疫荧光染色表明过表达的Hint2蛋白定位于线粒体.划痕愈合实验表明Hint2过表达质粒使肝癌细胞BEL-7402迁移速率显著降低.结论 Hint2过表达质粒能够上调BEL-7402细胞中Hint2 mRNA和蛋白质的表达水平,表达的蛋白定位于细胞线粒体并抑制肝癌细胞的迁移.

摘要： Objective To construct and identifythe eukaryotic expression plasmids containing wild -type FAPαand its mutants .Methods The wFAPαsequence and tFAPαsequence obtained by RT -PCR amplification using a high fidelity gene expression profiling strategy mediated by Pfu proofreading polymerases , were cloned into the eukaryotic ex-pression vector pcDNA3.1(+).The mFAPαwas obtained by overlap PCR using the pcDNA -wFAPαas template and cloned into the same vector .Results The construction of pcDNA-wFAPα, pcDNA-tFAPαand pcDNA-mFAPαwas confirmed by enzyme digestion and DNA sequencing .Conclusion The eukaryotic expression plasmids have been con-structed successfully , which lays important foundation for the future research on the molecular mechanism of FAP αin oral squamous cell carcinoma carcinogenesis .%目的：构建并鉴定人成纤维细胞激活蛋白（ FAPα）真核表达质粒pcDNA－wFAPα（野生型FAPα）、pcDNA－tFAPα（胞外段FAPα）和pcDNA－mFAPα（缺失624～704位氨基酸的突变型FAPα）。方法以口腔癌组织总RNA为模板，采用RT－PCR方法扩增wFAPαcDNA基因片段，连接至真核表达质粒pcDNA3．1（＋）获得重组pcDNA－wFAPα质粒。以重组 pcDNA －wFAPα为模板，扩增 tFAPα基因片段；用 overlap PCR 技术，获得mFAPα基因；分别连接至pcDNA3．1（＋）获得重组pcDNA－tFAPα和pcDNA－mFAPα质粒。结果酶切鉴定和测序验证皆显示pcDNA－wFAPα、pcDNA－tFAPα和pcDNA－mFAPα为正确重组质粒。结论成功构建人野生型FAPα（ wFAPα）、胞外段FAPα（ tFAPα）和突变型FAPα（ mFAPα）真核表达质粒，为进一步研究FAPα在口腔鳞癌发病过程中的分子机制奠定基础。

摘要： 基因表达载体的构建是进一步研究相应基因功能的基础。该文详细地介绍了人5-脂氧合酶基因真核细胞表达载体的设计理念和构建方法，并通过转染、western blotting等方法鉴定了该载体在HEK293T细胞中的表达。%Ideas and constructing methods of human 5-Lipoxygenase eukaryotic expression vectors sre presented and the expression of 5-Lipoxygenase in HEK293T cells by transfection and western blotting analysis is identified.

摘要： ABSTRACT:OBJECTIVE To construct eukaryon expression vector for pcDNA 3.1-Annexin A2.METHODS Total RNA was extracted from nasopharyngeal carcinoma CNE-2 cells.The target gene Annexin A2 was amplified By RT-PCR.After KpnⅠand XbaⅠdouble digestion ,Annexin A2 was connected to eukaryotic Expression Vector pcD-NA3.1(+) by T4 DNA ligase and to construct the prokaryotic Expression plasmid pcDNA 3.1-Annexin A2,which was transformed into DH5α.The positive recombinants were identified by double digestion with restriction endonucle-ase KpnⅠ and XbaⅠ,PCR amplification and DNA sequencing.RESULTS A 1020bp fragment of the same size was obtained after recombinant plasmid pcDNA 3.1-Annexin A2 by PCR amplification and KpnⅠand XbaⅠdouble digestion.The sequencing results consisted with the genebank.CONCLUSION The eukaryotic expression plasmid for pcDNA3.1-Annexin A2 was successfully constructed.%目的：构建含Annexin A2目的基因的重组表达质粒。方法从鼻咽癌CNE-2细胞提取总RNA，RT-PCR扩增目的基因片段，经KpnⅠ和XbaⅠ双酶切后与pcDNA3.1（＋）真核表达载体连接，构建真核表达载体pcDNA3.1-Annexin A2，转化DH5α，筛选阳性重组子，抽质粒进行 KpnⅠ and XbaⅠ双酶切、PCR和测序鉴定。结果重组质粒经PCR和酶切后都获得与RT-PCR大小相同的产物，长度约为1020bP，测序结果与基因库一致。结论成功构建重组真核表达质粒pcDNA3.1-Annexin A2。

摘要： 目的:观察FKHRL1三倍突变体(FKHRL1-TM)对球囊损伤后培养的血管平滑肌细胞(VSMCs)增殖的影响.方法:以VSMCs总RNA为模板,RT-PCR法扩增FKHRL1基因全长编码序列,克隆入载体pcDNA3.1后,通过基因定点突变试剂盒对FKHRL1基因三个位点进行点突变,获得重组质粒pcDNA3.1-FKHRL1-TM,然后将该重组质粒转染VSMCs细胞,RT-PCR法检测FKHRL1-TM基因在该细胞中的表达变化,并通过MTT、流式实验,检测其对VSMCs增殖的影响.结果:成功构建了重组质粒pcDNA3.1-FKHRL1-TM.重组质粒转染组FKHRL1基因表达量明显多于未转染组.MTT、流式实验结果表明,表达的FKHRL1可抑制平滑肌细胞的增殖(P＜0.05).结论:FKHRL1转录囚子在平滑肌细胞中表达增加和转录活性增强后,可以抑制平滑肌细胞的过度增殖.

摘要： 目的：构建microRNA的表达载体，再转染生物体细胞观察该microRNA的转录或表达情况，以获知它的作用机理及对生物体的影响。方法：以microRNA-21（简化为miR-21）为例说明构建表达载体的方法。根据microRNA的成熟序列以及附近约200多碱基共约470个碱基序列，设计PCR引物，PCR扩增，PCR产物和pcDNA3.1（＋）质粒双酶切后，用T4连接酶进行连接反应，并转化入感受态细胞，筛选后对重组质粒进行双酶切、琼脂糖凝胶电泳鉴定及测序分析，并将其转染 Hela细胞，经 RT-PCR实验检测其表达情况。结果：pcDNA3.1（＋）/miR-21过表达载体转染细胞后使得miR-21在细胞中过表达。结论：成功构建了miR-21的真核表达载体，为进一步研究miR-21功能及作用机制奠定实验基础。%This article introduces how to construct miRNA-21 overexpression vector and transfect it into cell ( Hela). Then the level of expression of miR-21 was observed. The miR-21 precursor is amplified by PCR method ,then the recombinant vector pcDNA3.1 (+ ) and miR-21 are constructed. After screening and identifying the recombinant ,it is transfected into cancer cells (Hela).The miR-21 expressing level is detected by RT-PCR.The result shows that the level of the miR-21 expression increases significantly in the cells that are transfected the recombinant. The miR-21 overexpression vector is successfully constructed ,and a foundation for studying the function of miR-21 is established .

摘要： 目的:构建并鉴定真核表达质粒PcDNA3.1-CSRP2-HA.方法:据GeneBank 中人CSRP2 CDS序列设计并合成引物,提取A549细胞总RNA,并将其逆转录成cDNA作为模板,进行PCR扩增,获得CSRP2目的基因后,再与PcDNA3.1-HA载体进行连接重组,构建PcDNA3.1-CSRP2-HA真核表达质粒,经限制性内切酶消化、PCR及DNA序列测序分析等方法鉴定后,瞬时转染入A549细胞,Western blot法检验CRP2蛋白表达.结果:成功构建PcDNA3.1-CSRP2-HA真核表达质粒,Western-blot结果显示PcDNA3.1-CSRP2-HA能够在A549细胞中表达.结论:PcDNA3.1-CSRP2-HA真核表达质粒构建并鉴定成功,为后续研究CRP2在炎症诱发氧化损伤机制中的转录调控作用奠定了基础.

摘要： FYJNa过表达载体pcDNA3.1‑FYJNa在显著增强A549/DDP细胞ABCC1基因表达中的应用，属于基因工程技术领域，其特征在于，FYJNa过表达载体pcDNA3.1‑FYJNa在显著增强A549/DDP细胞ABCC1基因表达中的应用的FYJNa基因核苷酸序列如Seq ID No:1所示。利用对A549/DDP细胞进行总RNA提取后反转录为cDNA，找到CREB1基因的CDS区及对应的mRNA序列，设计引物，加上HindⅢ和EcoRⅠ酶切位点，扩增CREB1基因CDS区；然后进行中性突变，酶切载体，连接目的片段与载体，重组表达载体，亚克隆完成后进行点突变，分别检测FYJNa和ABCC1基因mRNA和蛋白的表达水平，结果显示过表达FYJNa可上调ABCC1的mRNA和蛋白水平的表达。

摘要： 本发明公开了Caspase‑3重组单链抗体的构建及功能验证的方法：包括以下步骤(1)构建pcDNA3.3c‑Caspase‑3‑Gala重组质粒；(2)构建pcDNA3.3c‑Caspase‑3‑Gala减毒鼠伤寒沙门氏菌VNP20009重组菌株；(3)Caspase‑3重组质粒通过减毒鼠伤寒沙门氏菌VNP20009胞内侵袭的特性,侵入细胞后实现蛋白Caspase‑3的真核表达，验证这种蛋白对细胞的杀伤作用。本发明中采用减毒鼠伤寒沙门氏菌VNP20009的胞内侵袭的特性实现人源毒素蛋白的表达，同时大量研究表明减毒鼠伤寒沙门氏菌VNP20009能够特异性聚集在实体肿瘤中，可以实现特异性杀伤肿瘤细胞的目的，为肿瘤治疗研究提供实验依据。

摘要： PcDNA3.1(+)-Fbw7重组质粒及其构建方法与应用，涉及一种重组质粒。所述构建方法：1)将PSG5-Myc-Fbw7质粒谱图信息与PcDNA3.1(+)质粒谱图信息比较，确定双酶切位点EcoR Ⅰ和NotⅠ；2)双酶切PSG5-Myc-Fbw7质粒；3)双酶切PcDNA3.1(+)质粒载体；4)通过琼脂糖凝胶电泳鉴定双酶切效率，将质粒载体PcDNA3.1(+)和目的基因Fbw7全长进行连接；5)将重组质粒转化感受态细菌，筛选阳性克隆，并进行测序鉴定，抽提PcDNA3.1(+)-Fbw7重组质粒。所述PcDNA3.1(+)-Fbw7重组质粒可用于制备治疗人胆管癌肿瘤药物。

摘要： 本发明涉及一种金黄色葡萄球菌DNA疫苗pcDNA3.1(+)-Minigene及其制备方法。本发明构建的DNA疫苗pcDNA3.1(+)-Minigene，通过免疫小鼠实验显示，该DNA疫苗能刺激小鼠机体产生明显和持久的特异性淋巴细胞增殖反应以及一定水平的体液免疫，与相应的pcDNA3.1接种的阴性对照组比较，差异具有显著性(P＜0.05)。同时从攻毒实验的结果来看，pcDNA3.1(+)-Minigene质粒能诱导小鼠产生了抗金葡菌感染的抗体，对免疫小鼠起到了免疫保护的作用。

摘要： 本发明公开了pcDNA4/Myc‑NCAM质粒在制备关节炎药物中的应用及该质粒的制备方法。根据GenBank中NCAM基因的mRNA序列(NM_001081445.1)，并利用DNAMAN 8.0软件设计引物，从大鼠cDNA文库中扩增NCAM基因，将扩增出来的片段连接到pcDNA4/Myc真核表达载体上，转化感受态TOP10，氨苄霉素抗性LB琼脂板筛选单克隆菌落，摇菌并提取质粒，进行质粒酶切验证及电泳分析。

摘要： PcDNA3.1(+)-Fbw7重组质粒及其构建方法与应用，涉及一种重组质粒。所述构建方法：1)将PSG5-Myc-Fbw7质粒谱图信息与PcDNA3.1(+)质粒谱图信息比较，确定双酶切位点EcoR Ⅰ和NotⅠ；2)双酶切PSG5-Myc-Fbw7质粒；3)双酶切PcDNA3.1(+)质粒载体；4)通过琼脂糖凝胶电泳鉴定双酶切效率，将质粒载体PcDNA3.1(+)和目的基因Fbw7全长进行连接；5)将重组质粒转化感受态细菌，筛选阳性克隆，并进行测序鉴定，抽提PcDNA3.1(+)-Fbw7重组质粒。所述PcDNA3.1(+)-Fbw7重组质粒可用于制备治疗人胆管癌肿瘤药物。

摘要： 本发明公开了一种人的Smac基因真核表达载体pcDNA3.1-Smac的构建方法，它采用逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)技术，从人体正常睾丸组织中扩增到Smac全长基因片段，通过BamHI、HindIII双酶切Smac基因片段，琼脂糖凝胶电泳后回收酶切过的目的基因，制备空质粒pcDNA3.1转化并扩增质粒，提取质粒后运用BamHI、HindIII双酶切空质粒pcDNA3.1，电泳并回收酶切产物，与酶切后的目的基因Smac连接，构建重组真核表达载体pcDNA3.1-Smac。通过本方法得到的表达载体测序成功后，转染至肺癌A549细胞，验证Smac基因在转染后肺癌A549细胞中的表达，为进一步研究Smac基因对肺癌细胞的促凋亡作用奠定基础。

摘要： 本发明涉及生物新技术领域，特别是一种链球菌DNA疫苗构建，制备以及其免疫效果检测。将停乳链球菌的GapC基因插入到载体pcDNA3.1中构建DNA疫苗pcDNA3.1－GapC，并制备基因工程重组菌pcDNA3.1－GapC/DH5α。高密度培养上述基因工程重组菌，并大规模制备上述DNA疫苗。所构建的DNA疫苗免疫小鼠后，能诱导机体产生针对GapC的抗体和细胞免疫反应。

摘要： 本发明公开了一种hMCP－hRANTES－pcDNA3.1重组质粒的构建与表达方法：(1)以正常人外周血淋巴细胞总RNA为模板合成cDNA第一链，通过聚合酶链反应扩增hRANTES基因和hMCP－1基因，产物用纯化试剂盒回收；(2)通过酶切、连接分别构建重组hRANTES－pcDNA3.1、hMCP－pcDNA3.1和hMCP－hRANTES－pcDNA3.1融合表达质粒；(3)将重组质粒转化感受态细菌，筛选阳性克隆，抽提hRANTES－pcDNA3.1、hMCP－pcDNA3.1和hMCP－hRANTES－pcDNA3.1重组质粒DNA；(4)重组质粒共转染CHO细胞，有限稀释法筛选高效表达hRANTES、hMCP及hMCP－hRANTES的阳性细胞克隆；(5)纯化RANTES、MCP及MCP－RANTES融合蛋白。

摘要： 本发明涉及一种壳聚糖纳米粒－pcDNA