真核表达载体

摘要： 旨在开发防治热带螨过敏症的兽用核酸疫苗,本试验通过对热带无爪螨主要变应原Blo t 5和Blo t 21的基因序列进行密码子优化,构建了热带螨主要变应原融合基因的真核表达载体pVAX1-PADRE-Blo t 5-21-CpG。为验证该真核表达载体的免疫效果,采用皮下注射,以100μg/100μL量的pVAX1-PADRE-Blo t 5-21-CpG核酸免疫BALB/c小鼠(n=6),通过ELISA检测小鼠血清中特异性IgG、IgG1和IgG2a的水平变化;流式细胞术检测小鼠脾淋巴细胞中调节性T细胞的变化。结果显示,真核表达质粒pVAX1-PADRE-Blo t 5-21-CpG免疫小鼠后可诱导特异性IgG和IgG2a水平升高,且IgG2a/IgG1的比值升高,这暗示免疫后小鼠机体发生偏向Th1型的免疫反应。此外,该核酸疫苗可诱导小鼠产生较高水平的CD4+CD25+Foxp3+T细胞,这表明该真核表达质粒免疫小鼠后可能会诱发免疫抑制。

摘要： 为了进一步研究notch3基因在斑马鱼中的功能,构建了斑马鱼notch3真核表达载体并在真核细胞中成功表达。其中斑马鱼notch3基因编码序列(coding sequence,CDS)从NCBI的在线数据库中获得,根据序列克隆其胞内段(notch intracellular domain,NICD),接着利用同源重组技术构建pCMV-N3ICD表达载体。再通过双酶切和测序筛选阳性重组载体,借由脂质体法转染至HEK293T细胞中,最后经细胞免疫荧光技术和蛋白质印迹法验证N3ICD的表达。结果显示,重组质粒经酶切电泳片段及测序比对均与预期结果一致。在蛋白质印迹实验中N3ICD蛋白可正常表达,且大小与预测结果一致。细胞免疫荧光显示重组质粒可以在HEK293T细胞的细胞核中表达。同时,构建的N3ICD真核表达载体能够明显增强NF-κB(nuclear factor-кB)家族中rela和nfκb1启动子的活性。成功构建了pCMV-N3ICD真核表达载体。

摘要： 研究构建一种能高效、稳定表达且易分离纯化人神经生长因子的pcDNA3.1-TM-FactorXa-β-NGF真核表达载体,此载体能在CHO细胞中表达具有高活性的rh-β-NGF。实验利用Trizol溶液从人胎盘中提取总RNA,利用分光光度计测定总RNA浓度后经RT-PCR克隆β-NGF基因,然后添加TM-FactorXa跨膜元件,实验成功构建了pcDNA3.1-TM-FactorXa-β-NGF真核表达载体,用LipofectamineTM 2000把此载体转染CHO细胞进行表达,收集表达酶切液,透析后经DEAE-Sepharose F F和Sephadex G-75层析,经Bradford法蛋白定量后,利用Western-blot和ELISA等方法对目标蛋白进行质量检测,研究结果表明:人β-NGF融合蛋白能高效表达,细胞总蛋白中β-NGF含量进行ELISA检测结果为602μg/mL,对照组<1.15E-03μg/mL。SDS-PAGE电泳结果在13KD有明显的目标蛋白条带。此载体是一种能高效、稳定表达重组人神经生长因子,且易分离纯化的真核表达载体。实验添加TM-FactorXa跨膜元件达到可控酶切,以便更有利于目的蛋白的分离收集纯化,为下一步开展rh-β-NGF活性鉴定奠定基础。

摘要： 本研究旨在探索印记基因NNAT 2个转录本NNAT-α、NNAT-β在猪胎盘滋养层细胞(pTr2)中的功能。实验通过NCBI数据库公布的猪NNAT-α、NNAT-β的CDs序列信息设计引物,并构建了pcDNA3.1-NNAT-α和pcDNA3.1-NNAT-β真核表达载体,经过双酶切、连接转化、测序鉴定后,将表达载体转染至pTr2细胞,48 h后通过酶标仪检测细胞内葡萄糖含量的变化,RT-PCR检测NNAT基因、葡萄糖转运基因(GLUT1、GLUT3)和PI3K-AKT通路基因的表达。结果表明在pTr2细胞中过表达NNAT-α、NNAT-β可显著提高细胞内葡萄糖含量、葡萄糖转运基因(GLUT1、GLUT3)和PI3K-AKT通路基因mRNA的表达量。

摘要： 为研究重组真核表达载体pcDNA3.1(+)-ChIFN-α与鸡新城疫(Newcastle disease,ND)、传染性支气管炎(Infectious bronchitis,IB)二联活疫苗联用最佳肌肉注射剂量及其对鸡免疫功能的影响。通过RT-PCR扩增鸡干扰素-α(IFN-α)基因,双酶切IFN-α基因和pcDNA3.1(+),T4 DNA ligase连接,构建重组真核表达载体pcDNA3.1(+)-ChIFN-α;挑选180只海兰褐公雏鸡随机分为6组,每组3个重复,每个重复10只。A组(生理盐水对照组)、B组(疫苗对照组)、C组[疫苗+100μg pcDNA3.1(+)对照组]、D组[疫苗+50μg pcDNA3.1(+)-ChIFN-α试验组]、E组[疫苗+100μg pcDNA3.1(+)-ChIFN-α试验组]、F组[疫苗+200μg pcDNA3.1(+)-ChIFN-α试验组];4日龄时,D、E、F组分别注射pcDNA3.1(+)-ChIFN-α50、100、200μg/只,C组注射pcDNA3.1(+)100μg/只,A、B组注射生理盐水300μL/只,7日龄时除A组外,其他各组均滴鼻、点眼免疫鸡ND、IB二联活疫苗,于49日龄时,对试验鸡进行肾型IB病毒(Nephropathogenic IB virus,NIBV)攻毒试验。PCR结果表明扩增出鸡IFN-α基因为582 bp,通过测序并与NCBI已发表的ChIFN-α基因(登录号EU367971)进行比对,同源性为100%;双酶切、菌液PCR及测序鉴定结果表明重组真核表达载体pcDNA3.1(+)-ChIFN-α构建成功;动物试验结果表明,不同剂量pcDNA3.1(+)-ChIFN-α均能提高鸡外周血阳性T、B淋巴细胞百分率;提高ND病毒(ND virus,NDV)、NIBV疫苗诱导的抗体水平,并能提高鸡对NIBV强毒株的免疫保护率,且100μg剂量组比疫苗对照组的免疫保护率提高10%。本研究确定重组真核表达载体pcDNA3.1(+)-ChIFN-α最佳注射剂量为100μg/只鸡,其不仅能发挥免疫佐剂作用,还可增强鸡ND、IB二联活疫苗免疫保护效果。

摘要： 【目的】扩增努比亚山羊LIM结构域基因1(LIM domain gene 1,LMCD1)并进行生物信息学分析,构建真核表达载体并检测LMCD1基因的表达情况,为研究努比亚山羊LMCD1基因功能及探究LMCD1基因在山羊骨骼肌肉发育中的作用提供依据。【方法】从努比亚山羊背最长肌组织中提取总RNA,应用RT-PCR方法扩增LMCD1基因CDS区序列,并进行生物信息学分析;将LMCD1基因以同源重组的方式连接pEGFP-N1载体,经酶切、测序鉴定后重组阳性质粒命名为pEGFP-N1-LMCD1;将pEGFP-N1-LMCD1重组质粒转染至山羊骨骼肌卫星细胞,通过实时荧光定量PCR检测努比亚山羊LMCD1基因的表达情况。【结果】努比亚山羊LMCD1基因CDS区序列全长1092 bp,编码363个氨基酸。LMCD1蛋白分子式为C_(1775)H_(2818)N_(508)O_(533)S_(29),分子质量为40.73 ku。努比亚山羊LMCD1基因CDS区序列与山羊相似性最高(99.8%),与斑马鱼相似性最低(55.4%),与其他物种的相似性在87.0%~98.8%之间。LMCD1蛋白无信号肽,不存在跨膜结构域,为亲水性蛋白。通过构建努比亚山羊pEGFP-N1-LMCD1真核表达载体并转染至骨骼肌卫星细胞,过表达LMCD1基因,产生绿色荧光信号。【结论】试验成功扩增LMCD1基因CDS区序列,构建了pEGFP-N1-LMCD1真核表达载体,并分析了生物学功能,为后续开展LMCD1基因在山羊骨骼肌肉发育中的机制研究提供了理论基础。

摘要： 旨在克隆山羊维甲酸相关孤儿受体α(RORα)基因并构建其真核表达载体,然后利用生物信息学工具系统分析RORα的生物学特性,最后对其在山羊生物钟系统中的作用机制进行初步探究。本研究以1只健康的12月龄雄性西农萨能奶山羊为试验动物,提取其肝组织总RNA,经逆转录PCR反转录为cDNA后,利用常规PCR扩增山羊RORα基因的编码区(coding sequence,CDS)片段,使用同源重组法将其与pcDNA3.1-Puro-N-3HA载体相连接;重组载体经PCR、酶切和测序鉴定后,将阳性质粒命名为pcDNA3.1-3HA-gRORα;将pcDNA3.1-Puro-N-3HA和pcDNA3.1-3HA-gRORα质粒分别转染至HEK293T细胞后,通过实时荧光定量PCR(real-time quantitative PCR,qPCR)和蛋白质免疫印迹(western blotting,WB)技术检测山羊RORα的表达;同时利用ExPASy、ProtScale等软件对山羊RORα基因进行系统的生物信息学分析。另外,使用同源重组法分别构建含有山羊生物钟基因BMAL1和NR1D1启动子片段的pGL4.10-BMAL1-Promoter-Luc及pGL4.10-NR1D1-Promoter-Luc的荧光素酶报告质粒,并通过双荧光素酶报告试验探究山羊RORα蛋白调控BMAL1和NR1D1基因启动子转录活性的作用机制。PCR、酶切和测序鉴定结果表明,pcDNA3.1-3HA-gRORα重组质粒构建成功;qPCR和WB结果显示,pcDNA3.1-3HA-gRORα转染组RORα基因的mRNA表达水平和蛋白表达水平均显著高于pcDNA3.1-Puro-N-3HA转染组(P<0.01)。生物信息学分析结果显示,山羊RORα基因CDS区序列与绵羊、牛和猪的相似性较高,分别为97.5%、97.1%和95.2%。山羊的RORα蛋白是一种亲水性蛋白。二级结构由α-螺旋、延伸链、β-转角和无规则卷曲组成,有信号肽的概率较小,无跨膜区;三级结构与小鼠和人的RORα蛋白差异性极小,三者具有高度相似性。此外,PCR、酶切和测序结果表明,pGL4.10-BMAL1-Promoter-Luc和pGL4.10-NR1D1-Promoter-Luc重组质粒构建成功。双荧光素酶报告试验结果表明,山羊RORα蛋白可以显著上调山羊BMAL1和NR1D1基因启动子的转录活性。本研究成功构建了山羊RORα基因的真核表达载体,并证明了RORα蛋白可以正向调控山羊BMAL1和NR1D1基因的启动子活性,这为进一步探究山羊核受体RORα的功能及山羊生物钟的转录调控机制提供了前期基础。

摘要： 目的构建TRAM基因真核表达载体,为研究TRAM的功能提供研究工具。方法首先采用PCR方法扩增人TRAM蛋白相应的编码序列,将扩增的特定片段克隆至pCMV-N-Flag真核表达载体。然后,对重组载体进行DNA测序,确认序列正确后将重组载体转染至HEK-293T细胞,并用Western blot方法检测TRAM蛋白的表达以评价载体是否构建成功。结果菌落PCR电泳可检测到800 bp附近出现目的条带,质粒DNA测序显示载体插入705 bp的核苷酸序列,其序列与TRAM完全一致。Western blot检测到HEK-293T细胞高表达带Flag标签的TRAM蛋白。结论基于PCR扩增、双酶切、酶连接扩增片段和载体成功构建带Flag标签的TRAM真核表达载体。构建的质粒可为进一步研究干扰素的调控和抗病毒免疫治疗提供一种研究工具。

摘要： 目的:通过恢复RAG-1、RAG-2分子的表达挽救功能性淋巴细胞的分化、发育,探讨从基因水平上根治RAG-免疫缺陷病的技术方法,为进一步进行基因治疗打下基础。方法:(1)采用RT-PCR方法克隆人类RAG-1、RAG-2编码基因,同时构建RAG-1、RAG-2真核表达载体;(2)采用转染方法得到转染细胞体,使目的基因在人类细胞得到表达。结果:阳性克隆的测序结果与人类RAG-1、RAG-2基因完全相同,并且分别在获得重组细胞中检测到782 bp的人类RAG-1 mRNA转录产物和378 bp的人类RAG-2 mRNA转录产物,而pcDNA3.1空白对照未检测到任何hRAG-1 mRNA。结论:成功克隆了人类RAG-1、RAG-2基因,并在转染的人类细胞中获得了外源RAG-1、RAG-2的mRNA表达。

摘要： 本研究旨在构建山羊核受体NR1D1基因的真核表达载体,以探究其在山羊生物钟系统中的功能。从山羊卵巢组织提取总RNA,反转录合成cDNA后通过PCR扩增山羊NR1D1基因的编码序列(Coding Sequence,CDS)。将获得的目的片段与酶切线性化的真核表达载体pcDNA3.1-Puro-N-3HA进行同源重组连接,把PCR、酶切和测序鉴定正确的重组质粒命名为pcDNA3.1-3HA-g NR1D1。将pcDNA3.1-Puro-N-3HA质粒和pcDNA3.1-3HA-g NR1D1重组质粒转染至HEK293T细胞,通过实时荧光定量PCR(qPCR)和Western Blotting技术检测重组质粒的过表达效果,同时对NR1D1基因进行生物信息学分析。结果显示:pcDNA3.1-3HA-g NR1D1真核表达载体构建成功,且与转染pcDNA3.1-Puro-N-3HA组相比,pcDNA3.1-3HA-g NR1D1真核表达载体转染组中NR1D1基因在mRNA和蛋白表达水平均显著升高;山羊NR1D1基因CDS区长度为1851bp,共编码616个氨基酸;山羊NR1D1蛋白为不稳定蛋白,不含跨膜结构和信号肽,且该蛋白的三级结构与人和小鼠高度相似。本研究成功构建了山羊NR1D1基因的真核表达载体,在mRNA和蛋白水平验证了其在HEK293T细胞的过表达效果,为进一步研究山羊NR1D1基因的生物学功能提供了前期基础。

摘要： Smad4是Smad蛋白家族中的重要成员,在TGF-β/Smad的细胞信号转到中起着关键作用,为了阐明Smad4基因对水牛卵巢颗粒细胞增殖及胚胎发育的分子机制,本试验采用RT-PCR技术,克隆水牛Smad4基因,并对其核苷酸序列和蛋白质序列进行生物信息学分析,并构建Smad4基因的真核表达载体,并通过脂质体转染法转染体外培养的牛卵巢颗粒细胞.结果表明:克隆得到水牛Smad4基因编码序列,编码区全长为1662bp,编码553个氨基酸.通过BLAST对水牛Smad4基因的核苷酸序列进行同源性比较,结果显示水牛Smad4基因的与牛的同源性为99％,与绵羊、猪、马、人的同源性分别为:98％、96％、96％和95％,系统进化树分析表明Smad4基因在不同物种的进化过程中具有高度的保守型,试验成功构建了水牛Smad4基因的真核表达载体pEGFP-N1-Smad4.本研究成功克隆了水牛Smad4基因,并成功构建了Smad4基因的真核表达载体,为进一步研究Smad4基因在水牛胚胎发育过程中的分子机制奠定了理论基础.

摘要： 目的:rn 构建miR-7-1启动子核心序列的真核表达载体,并初步探讨其意义.rn 方法:rn 根据5'端缺失实验原理,设计引物,PCR法分别扩增含不同长度启动子序列和相同miR-7-1成熟体序列的产物;纯化、经KPNI和XHOI双酶切后将它们分别亚克隆入pGL3.0-Basic真核表达载体,并进行酶切及测序鉴定;将三个构建成功的pGL3.0-miR-7载体(分别命名为p-1189-miR-7,p-1731-miR-7,p-2192-miR-7)体外瞬时转染小鼠乳腺癌4T1细胞;用Real-timePCR检测各组中miR-7成熟体的表达水平;CCK-8法检测细胞生长的变化;最后,利用TRANSFAC数据库预测结合miR-7-1启动子核心序列的潜在转录因子.rn 结果:rn 酶切和测序验证成功构建了p-1189-miR-7、p-1731-miR-7、p-2192-miR-7三个miR-7-1启动子真核表达载体;与表达载体p-1189-miR-7、p-1731-miR-7转染组相比,表达载体p-2192-miR-7瞬时转染4T1细胞后可有效表达miR-7成熟体,并显著抑制4T1细胞的体外生长(P＜0.05),提示miR-7启动子序列-1593位点到-2024位点为核心序列;最后,预测结果显示NK2-同源盒-5(NK2-Homebox-5,NKX2-5)和肝细胞核因子4(hepatocyte nuclear factor 4 homeobox,HNF-4)可能是结合该核心序列的转录因子.rn 结论:rn 成功构建了p-1189-miR-7,p-1731-miR-7,p-2192-miR-7三个miR-7-1启动子真核表达载体,并筛选到miR-7-1启动子的核心序列(-1593位点到-2024位点),为后续深入研究miR-7-1在乳腺癌发生中的作用及机制提供了前期实验基础.

摘要： 目的：构建小鼠PICK1基因的真核表达载体myc-PICK1.方法：从小鼠脑组织中提取总RNA,RT-PCR扩增PICK1序列,所得片段及真核表达载体pRK5-myc用SalⅠ和NotⅠ双酶切,后连入pRK5-myc载体中.重组质粒经SalⅠ和NotⅠ双酶切鉴定后送公司测序.结果：PCR扩增得到预期1.2 kb大小的目的片段,经SalⅠ和NotⅠ双酶切鉴定正确重组质粒送公司测序,结果与预期一致.Myc-PICK1重组质粒转染Hela细胞,进行免疫染色能看到定位于胞浆的蛋白表达.结论：成功构建了myc-PICK1载体,为后续研究奠定了基础.

摘要： 目的：构建小鼠Orai1基因的真核表达载体myc-Orai1(△4aa). 方法：从小鼠脑组织中提取总RNA,RT-PCR扩增Orai1(△4aa)序列,所得片段及真核表达载体pRK5-myc用SalⅠ和NotⅠ双酶切,后连入pRK5-myc载体中.重组质粒经SalⅠ和NotⅠ双酶切鉴定后送公司测序. 结果：PCR扩增得到预期900bp大小的目的片段,经SalⅠ和NotⅠ双酶切鉴定正确重组质粒送公司测序,结果与预期一致. 结论：成功构建myc-Orai1(△4aa)载体,为后续研究提供了条件.通过查阅文献。初步拟定了可能与Orail有相互作用的蛋白如PICK1，推测Orail和PICK1可能共同表达于神经元和肌纤维中。设计不同引物可以扩增出各种所需突变体。测序结果通过比对，与预期相符，说明载体构建成功。可以用于后续验证相互作用及机制的实验。

摘要： miRNA是一类内源性的、长约22个核苷酸的非编码RNA,通过与靶基因mRNA的3'非编码区(untranslated region,UTR)结合,在转录后水平降解靶标mRNA或抑制蛋白质翻译.随着miRNA研究的深入,研究者发现miRNA不仅参与了动物复杂性状表型形成的分子调控过程,而且miRNA基因的多态性可能影响miRNA的表达,导致miRNA功能异常,从而影响miRNA靶基因的表达和功能,进而引起生物表型性状的变异.本课题组发现miR-1749前体存在rs15860000(C＞T)单核苷酸多态位点,但该突变是否影响miR-1749的表达尚未见报道.本研究研究表明miR-1749前体的SNP亦改变其二级结构自由能值，通过构建miR-1749不同基因型的表达载体初步证明miR-1749前体的SNP影响成熟miR-1749的表达，暗示该位点可能影响miR-1749与靶基因的作用。因此本研究构建miR-1749SNP(C＞T)不同纯合基因型的真核表达载体,利用生物信息学软件预测分析miR-1704的靶基因,为进一步研究miR-1749的生物学功能奠定实验基础.

摘要： 本文构建血红素氧合酶-2(HO-2)真核表达载体pEF1 α-HO-2-AcGFP,并观察其在小鼠脑血管内皮细胞中的表达情况.利用PCR技术从C57BL/6小鼠海马组织中扩增出HO-2基因cDNA序列,用双酶切法将HO-2基因cDNA序列克隆到真核表达载体pEF1 α-IRES-AcGFP上,构建HO-2的真核表达载体pEF1 α-HO-2-AcGFP.重组载体pEF1 α-HO-2-AcGFP经EcoR Ⅰ和BamH Ⅰ双酶切和测序鉴定.电转染法转染小鼠脑血管内皮细胞,实时定量PCR、Western blot方法检测HO-2在小鼠脑血管内皮细胞中RNA和蛋白质水平的表达情况.酶切鉴定和测序显示pEF1 α-HO-2-AcGFP载体构建正确;重组载体转染的小鼠脑血管内皮细胞HO-2的RNA和蛋白表达水平显著高于空载体.成功构建了HO-2的真核表达载体pEF1α-HO-2-AcGFP,为进一步研究其机制和功能奠定了基础.

摘要： 目的:构建小鼠甲状旁腺素受体(PTHR)及其突变受体(DSEL)全长结构基因真核表达载体,建立稳定高表达PTHR及DSEL的HEK293细胞系,以应用于甲状旁腺素(PTH)模拟肽活性药物筛选及其信号通路的研究.rn 方法:通过双酶切、胶回收方法 分别纯化目的片段(PTHR、DSEL基因)和质粒pcDNA3.1(+),二者分别由DNA限制性内切酶EcoRI与Notl双酶切,经T4 DNA Ligase连接的方法将PTHR、DSEL基因克隆到质粒表达载体pcDNA3.1(+)中,采用测序方法及DNA限制性内切酶EcoRI与Notl双酶切方法 鉴定重组质粒,脂质体转染法将重组体pcDNA3.1(+)-PTHR、pcDNA3.1(+)-DSEL及空质粒pcDNA3.1(+)分别转染至HEK293细胞,经G418筛选抗性细胞克隆,、RT-PCR及ELISA检测转染细胞PTHR、DSEL的表达情况.rn 结果:重组质粒经基因测序及DNA限制性内切酶EcoRI与Notl双酶切证实质粒表达载体pcDNA3.1(+)-PTHR、pcDNA3.1(+)-DSEL构建正确.重组体经脂质体法转染HEK29348h后,经G418筛选3周得到细胞抗性克隆,ELISA检测到PTHR、DSEL基因在重组质粒表达载体pcDNA3.1(+)-PTHR、pcDNA3.1(+)-DSEL转染的HEK293中成功表达.RT-PCR方法检测到PTHR、DSEL基因在转录水平的表达.ELISA方法检测到重组质粒转染的HEK293中,加入甲状旁腺激素刺激后,PLC、cAMP蛋白表达量远高于空质粒pcDNA3.1(+)转染的HEK293中PLC、cAMP的表达.rn 结论:成功构建了稳定高表达PTHR、DSEL的HEK293细胞,该稳定转染细胞系的建立为进一步研究甲状旁腺素受体下游信号通道的分子机制以及筛选其模拟肽作用的活性奠定了实验基础.

摘要： 目的：观察真核表达载体介导siRNA对小鼠移植心脏的免疫保护作用. 方法：在C57/BL6J→Balb/C组合(主要组织相容性复合体不合,MHC不合),DBA/2→Balb/C组合(次要组织相容性复合体不合,mHC不合)中分别于小鼠心脏移植术后第1天,第4天胸腺注射生理盐水,pRNAT-CTL阴性对照载体和pRNAT-OX40siRNA,观察移植心脏存活情况.术后第7天取移植心脏行病理学检查,取血清检测心肌酶谱,取脾脏行RT-PCR和Western Blot检测OX40mRNA表达和OX40膜蛋白表达. 结果：在C57/BL6J→Balb/C组合中(MHC不合),pRNAT-OX40siRNA组移植心脏生存时间较生理盐水组和阴性对照组无明显延长,移植心脏病理学检查无明显改善.而在DBA/2→Balb/C组合中(mHC不合),pRNAT-OX40siRNA组小鼠移植心脏生存时间较生理盐水组和阴性对照组显著延长,病理改变显著减轻,乳酸脱氢酶(LDH)、谷草转氨酶(AST)、肌钙蛋白(Tn)以及脾脏OX40mRNA表达和OX40膜蛋白表达与空白对照组和阴性对照组相比明显下降. 结论：在DBA/2-Balb/C组合中(mHC不合),单独阻断OX40/OX40L通路对小鼠移植心脏有保护作用.在C57/BL6J→Balb/C的组合中(MHC不合),单独阻断OX40/OX40L通路未发现对移植心脏的保护作用.

摘要： 目的：构建骆驼蓬脂转移蛋白(lipid transfer protein from Peganum harmala,PhLTP)基因真核表达质粒,并探讨其对黑色素瘤B16细胞在体内外的抗肿瘤作用.rn 方法：将PhLTP基因亚克隆至pcDNA3.1上,获得重组质粒pcDNA3.1-PhLTP;用脂质体转染法将重组质粒及空载体外转染B16细胞,MTT检测其对B16细胞生长的影响.建立B16荷瘤小鼠模型,设重组质粒(pcDNA3.1-PhLTP)、空载(pcDNA3.1)、生理盐水和阳性药物(CTX)组,分别处理小鼠后测量各组肿瘤体积并称瘤重,计算抑瘤率.光镜观察鼠脾、肝等组织变化;免疫组织化学法检测各瘤体中PhLTP、血管内皮生长因子(VEGF)及碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)的表达.rn 结果：pcDNA3.1-PhLTP转染B16细胞72 h后,细胞增殖能力明显受到抑制(P ＜ 0.01).注射pcDNA3.1-PhLTP组的小鼠肿瘤生长速度明显减慢,肿瘤体积小于空载和生理盐水组(P ＜ 0.05).显微镜下可见重组质粒组肿瘤细胞有不同程度的点、片状坏死,而肝、肺等无明显病理损伤.重组质粒组肿瘤组织中有PhLTP蛋白的表达,且VEGF和bFGF的阳性表达指数都低于空载和生理盐水组(P ＜ 0.01).rn 结论：成功构建了重组表达质粒pcDNA3.1-PhLTP,体内外实验结果显示其能有效地抑制B16细胞的生长,预示了该重组质粒在治疗黑色素瘤中的潜在应用价值.

摘要： 脆性X综合征(fragile X syndrome,FXS)是一种常见的遗传性智力低下疾病.其致病基因——脆性X智力障碍1基因(fragile X mental retardation 1 gene,FMR1)定位克隆于Xq27.3,长38Kb,由17个外显子和16个内含子组成,编码一个选择性RNA结合蛋白,称为脆性X智力障碍蛋白( fragile X mental retardation protein,FMRP).己有的研究表明，FMR1基因存在复杂的可变剪接表达，且可变剪接参与了FMR1基因功能和活性的调节。对进一步研究可变剪接对FMRP功能的影响打下基础，并对FXS的发病机制的研究提供新的方向。

摘要： 本发明提供一种真核基因表达启动子及其表达载体和应用。所述真核基因表达启动子具有如(I)、(II)或(III)所述的核苷酸序列中的任意一个：(I)编码RPS家族表达启动子的核苷酸序列；(II)如(I)所述的核苷酸序列经修饰、取代或突变至少一个核苷酸获得的核苷酸序列；(III)与(I)所述的核苷酸序列具有≥90％同源性的核苷酸序列。本发明中提供的表达启动子不含潜在起始翻译序列，从根本上消除了非目的翻译起始；同时，所述启动子能够驱动外源基因的表达，利用其构建的表达载体在不同细胞中均能实现目的基因的高效表达，因此，该启动子在临床基因治疗领域具有广泛的应用前景。

摘要： 本发明公开了一种AIDA-I表达元件和CMV真核表达元件共表达载体的构建方法，具体包括

摘要： 本发明涉及生物技术领域，具体地说关于一种可诱生细胞免疫应答的pGL3/CD80-P1A共表达载体和pcDNA3.1/B2M-IL15真核表达载体。本发明所公开一种可诱生细胞免疫应答的pGL3/CD80-P1A共表达载体和pcDNA3.1/B2M-IL15真核表达载体，其优点表现在：本发明有利于克服常规表位DNA疫苗免疫原性低的缺陷，可用于肿瘤及病毒持续性感染等的预防和治疗。

摘要： 本发明提供了一种真核表达载体、真核表达系统、二者的制备方法和应用及GDF11蛋白，涉及分子生物学技术领域，本发明提供的真核表达载体，能够高表达GDF11基因。本发明提供的上述真核表达载体的制备方法，包括将GDF11基因片段插入重组质粒，操作简单，制备得到的真核表达载体具有高表达GDF11基因的效果。本发明提供的真核表达系统，宿主细胞为CHO，能够稳定高效地表达重组蛋白GDF11。本发明提供的上述真核表达系统的制备方法，包括将真核表达载体转染到CHO细胞中，培养并筛选，通过DHFR二氢叶酸还原酶系统进行转染子筛选，能够在保证细胞活率的情况下，通过反馈调节，使GDF11基因扩增，提高蛋白的表达量。

摘要： 本发明公开了一种通用型高效真核表达载体p3I-GFPN及采用该载体构建的抗乳腺炎的转基因载体，本发明构建的抗乳腺炎转基因载体pCMV/CSN2-hLY-hIFA，在乳腺细胞中能高水平表达绿色荧光蛋白，在泌乳期的乳腺细胞中，由于CSN2的启动子发挥了启动作用，使转pCMV/CSN2-hLY-hIFA的乳腺细胞分泌大量的人溶菌酶和人干扰素A，在通过乳汁分离获得目的蛋白的同时又能较好的防治家畜乳腺炎。

摘要： 本发明涉及生物技术领域，具体地说关于一种可诱生细胞免疫应答的pGL3/CD80－P1A共表达载体和pcDNA3.1/B2M－IL15真核表达载体。本发明所公开一种可诱生细胞免疫应答的pGL3/CD80－P1A共表达载体和pcDNA3.1/B2M－IL15真核表达载体，其优点表现在：本发明有利于克服常规表位DNA疫苗免疫原性低的缺陷，可用于肿瘤及病毒持续性感染等的预防和治疗。

摘要： 本发明提供了一种真核表达载体、真核表达系统、二者的制备方法和应用及GDF11蛋白，涉及分子生物学技术领域，本发明提供的真核表达载体，能够高表达GDF11基因。本发明提供的上述真核表达载体的制备方法，包括将GDF11基因片段插入重组质粒，操作简单，制备得到的真核表达载体具有高表达GDF11基因的效果。本发明提供的真核表达系统，宿主细胞为CHO，能够稳定高效地表达重组蛋白GDF11。本发明提供的上述真核表达系统的制备方法，包括将真核表达载体转染到CHO细胞中，培养并筛选，通过DHFR二氢叶酸还原酶系统进行转染子筛选，能够在保证细胞活率的情况下，通过反馈调节，使GDF11基因扩增，提高蛋白的表达量。

摘要： 本发明公开了一种通用型高效真核表达载体p3I－GFPN及采用该载体构建的抗乳腺炎的转基因载体，本发明构建的抗乳腺炎转基因载体pCMV/CSN2－hLY－hIFA，在乳腺细胞中能高水平表达绿色荧光蛋白，在泌乳期的乳腺细胞中，由于CSN2的启动子发挥了启动作用，使转pCMV/CSN2－hLY－hIFA的乳腺细胞分泌大量的人溶菌酶和人干扰素A，在通过乳汁分离获得目的蛋白的同时又能较好的防治家畜乳腺炎。

摘要： 本发明公开了一种牙鲆SOCS3基因及其真核表达载体、表达系统和异源表达方法。所述牙鲆SOCS3基因的核酸序列如SEQIDNO.1所示。扩增所述牙鲆SOCS3基因的上游引物如SEQIDNO.2所示，下游引物如SEQIDNO.3所示。本申请在成功克隆牙鲆SOCS3基因的基础上，进一步构建了牙鲆SOCS3基因的真核表达载体pEGFP‑C1‑PoSOCS3，并将其成功转染HEK293T细胞中，荧光倒置显微镜观察牙鲆SOCS3基因在细胞中的亚细胞定位，为后续的牙鲆SOCS3功能研究提供了基础资料。

摘要： 本发明公开了一种人PAK1蛋白的真核表达载体的构建方法，包括如下步骤：1)以表达PAK1蛋白的基因序列为模板，采用PCR扩增获得PAK1基因片段；2)将得到的PAK1基因片段连接到真核表达载体上得到重组质粒；3)将得到的重组质粒进行转染转化复制，得到人PAK1蛋白的真核表达载体。还公开了利用真核表达系统进行重组人PAK1蛋白表达的方法：还包括步骤4)利用步骤3)获得的人PAK1蛋白的真核表达载体扩增纯化得到的质粒转染进入真核细胞中进行表达。还公开了获得重组人PAK1蛋白的方法：还包括步骤5)将步骤4)得到的阳性克隆进行培养扩大体系，收集培养细胞，离心收集上清，通过色谱柱纯化，即得。