摘要:
【背景】大豆异黄酮主要包括染料木素和大豆苷元,发挥类雌激素样作用,能够清除自由基,促进细胞增殖。颗粒细胞是卵泡内重要的细胞群体,其生理状态与卵巢功能直接相关。颗粒细胞凋亡常引起卵泡闭锁。牦牛是青藏高原特有物种之一,但其繁殖率低,其具体机制尚不明确。卵巢颗粒细胞是研究雌性动物生殖调控机制的理想细胞模型。【目的】探讨大豆异黄酮对牦牛卵巢颗粒细胞增殖和凋亡的影响,为大豆异黄酮的作用机制研究提供依据。【方法】分离培养牦牛卵巢颗粒细胞,FSHR免疫细胞化学染色鉴定,MTT法测定细胞增殖情况,绘制生长曲线;细胞传代后添加不同浓度染料木素或大豆苷元(0,1000,2000,3000,4000和5000 pg·mL^(-1)),选择染料木素或大豆苷元最佳作用浓度分别处理二代颗粒细胞48 h,收集细胞培养液,ELISA法检测培养液中雌二醇(E2)和孕酮(P4)浓度;同时收集细胞,提取总RNA,实时荧光定量PCR法检测细胞增殖相关基因AKT1和细胞凋亡相关基因Bcl-2、Bax、Bad、Fas、FasL、Caspase-3和p53的表达水平。【结果】牦牛卵巢颗粒细胞呈典型的上皮样细胞生长特性。接种后2 h开始贴壁,12 h出现聚集生长;24 h细胞体积较大,呈长梭形、星形或多边形;48 h细胞呈“铺路石”样单层排布;卵巢颗粒细胞特异标志蛋白FSHR免疫细胞化学染色阳性,表明,分离培养的是卵巢颗粒细胞;MTT法检测细胞增殖情况,牦牛卵巢颗粒细胞呈“S”形曲线生长:培养24 h内生长缓慢,处于潜伏生长期;24—48 h细胞增殖较快,进入指数生长期;48—120 h细胞平稳增殖,处于平顶期;120 h后活细胞密度开始下降,细胞进入退化衰亡期;第二代细胞生长较快,24 h进入指数增殖期,故试验选择第二代颗粒细胞进行。MTT法检测不同浓度染料木素或大豆苷元对细胞增殖的影响,结果,添加3000 pg·mL^(-1)染料木素或大豆苷元作用48 h后,细胞活力均极显著增强(P<0.01);染料木素和大豆苷元均促进颗粒细胞分泌雌二醇,大豆苷元促进效果显著(P<0.05);染料木素显著抑制颗粒细胞分泌孕酮(P<0.05);qRT-PCR结果显示,染料木素和大豆苷元均显著上调颗粒细胞增殖调控相关基因AKT1和凋亡相关基因Bcl-2、Bax、p53和Fas的表达(P<0.01),显著下调凋亡相关基因Bad和FasL的表达(P<0.01),并显著上调Bcl-2/Bax比值(P<0.01)抑制细胞凋亡。此外,染料木素抑制Caspase-3表达(P<0.01)而大豆苷元促进Caspase-3表达(P<0.01)。【结论】分离培养了牦牛卵巢颗粒细胞,为牦牛雌性生殖调控机制研究提供了有效的细胞模型。试验结果表明,染料木素和大豆苷元抑制牦牛颗粒细胞分泌孕酮,促进细胞增殖,且主要通过上调Bcl-2、p53、Fas和Bcl-2/Bax,以及下调Bad和FasL的表达,保护卵巢颗粒细胞免于凋亡。