体外转录

摘要： 为了开发合适的mRNA递送载体,本试验采用体外转录、加帽、加尾修饰及氯化锂(LiCl)纯化的方法获得具有生物活性的绿色荧光蛋白mRNA(mRNA-EGFP),然后用合成的3种细胞穿透肽(RVG、RVG9dR、RVG11dR)进行递送。先通过凝胶阻滞试验确定mRNA与3种细胞穿透肽的最佳包被质量比例;再在293T细胞水平上测试3种细胞穿透肽的细胞毒性、包被mRNA后对RNase A的耐受性,并通过凝胶阻滞试验和细胞荧光试验来测试3种细胞穿透肽对mRNA的包被和递送效力。细胞毒性试验结果显示,3种细胞穿透肽的半抑制浓度(IC_(50))分别是95、90μmol/L和81μmol/L;RNase A保护试验结果显示,3种细胞穿透肽均可保护mRNA不被RNase A降解;凝胶阻滞试验和细胞荧光试验结果显示,3种细胞穿透肽均可成功包被mRNA-EGFP,并把mRNA递送到细胞内进行表达,其中RVG11dR对mRNA的递送效果最好。结果表明,在细胞穿透肽RVG的末端添加一定数量的精氨酸可提高其对mRNA的递送效力。

摘要： [背景]布尼亚病毒目(Bunyavirales)和正黏病毒科(Orthomyxoviridae)病毒从帽子结构下游10-20个碱基处切割寄主mRNA,以5'端切割产物(帽子序列)作为引物起始自身基因组的转录,生成含一段异源帽子序列的病毒mRNA,这一过程称为“抓帽”.水稻条纹病毒(rice stripe tenuivirus,RSV)是一种布尼亚病毒,其“抓帽”机制还不甚清楚.[目的]研究RSV粗提物能否从溶液中的外源mRNA“抓帽”,以建立一种便捷的体外体系,用于解析RSV“抓帽”和转录机制.[方法]以PEG沉淀和超速离心法粗提RSV,利用聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和质谱技术分析粗提物成分.然后取少量粗提液,加入富含珠蛋白(globin)mRNA的兔网织红细胞裂解液(rabbit reticulocyte lysate,RCL)和合适浓度的金属离子配制体外“抓帽”体系.待体外反应结束,提取体系中总RNA,以巢式RT-PCR扩增含珠蛋白-αmRNA帽子序列的RSV mRNA,并对其进行克隆,通过序列分析比较RSV体外“抓帽”与体内“抓帽”的异同.[结果]从1 00 g感染RSV的水稻叶片获得RSV粗提液2 mL.除RSV病毒粒子外,粗提液中还含核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶等多种叶绿体蛋白.取2μL粗提液,加入4 mmol·L-1 MgCl2、2 mmol·L-1 NTP、0.8U·μL-1 RNA酶抑制剂和8μL RCL,配成20 μL反应体系,30°C孵育1.5h后,巢式RT-PCR扩增到了目的条带,表明RSV粗提物能切割溶液中的珠蛋白-αmRNA,并利用其帽子序列合成自身mRNA.在反应体系中加入帽子结构类似物m7G(5')ppp (5')G后进行相同反应,目的条带变淡,且变淡程度与所加入m7G(5')ppp (5')G的浓度成正比,表明识别帽子结构是RSV从溶液中切割利用珠蛋白-α mRNA的前提.对巢式RT-PCR产物克隆和测序后分析发现,与在体内的情况类似,RSV从帽子结构下游的A或C处切割珠蛋白-α mRNA,得到的帽子序列与病毒模板链3'端的U或G配对后引发转录.在利用珠蛋白-αmRNA帽子序列进行转录的过程中,RSV频繁使用引发与重配,且在合成核蛋白基因NP时比在合成主要非核蛋白基因NCP时使用该机制的频率更高.[结论]RSV粗提物能从溶液中的mRNA“抓帽”,且在切取和利用帽子序列的方式上,其表现与细胞内的RSV无明显差别.因而,粗提物可以用来解析RSV的“抓帽”机制,甚至用于研究RSV的转录.

摘要： 近日,上海研制的“新冠病毒体外转录RNA标准物质”被批准为国家级标准物质,能有效评价新冠病毒核酸检测试剂盒的准确性。这是首个由地方研制成功并获国家批准的新冠病毒体外转录RNA标准物质,可供国内外核酸试剂盒生产企业和研发机构使用,研制及审批时间从一年以上缩短至两个月。

摘要： 目的 对多重实时定量PCR(real-time quantitative PCR,qPCR)进行反应体系筛选和方法探索,使其用于G1-G4型轮状病毒VP7基因的快速分型和定量分析.方法 设计G1-G4型轮状病毒VP7基因特异性引物和探针,以特异性体外转录RNA为模板,筛选多重qPCR反应体系,建立多重qPCR方法.采用单因素方差分析和配对样本t检验对多重与单重qPCR检测结果进行比较.结果 经筛选,得到6组三重qPCR反应体系和1组四重qPCR反应体系.所建立的三重和四重qPCR中,除四重qPCR的G1型参数[标准曲线决定系数(R2)为0.982、扩增效率为89.221％]略低于要求外,其余标准曲线R2均＞0.99,扩增效率均在90％至110％之间;检测灵敏度达102拷贝/pl.多重与单重qPCR检测同一样本的相关性较好(R2 ＞0.95).三重与单重qPCR(t值为1.420～25.786)、四重与单重qPCR(t值为2.505～4.851)检测结果间的差异均无统计学意义(P值均＞0.05).结论 建立的多重qPCR可同时对3种以上目的基因进行分型和定量检测,为未来多价轮状病毒疫苗及混合病毒样本中毒株的快速分型和定量检测方法的建立提供了借鉴.

摘要： 为了提高H9N2亚型禽流感病毒核酸检测结果的准确性,同时减少试验操作中的污染,对H9N2亚型禽流感病毒HA全长基因序列进行克隆及体外转录,构建用于检测H9N2亚型禽流感HA基因阳性核酸标准品.采用实时荧光定量RT-PCR方法对转录的RNA片段进行验证.结果表明:HA体外转录产物可以准确提供RNA片段的拷贝数并进行定性和定量分析.H9N2亚型禽流感病毒HA基因体外转录RNA可作为H9N2禽流感病毒核酸检测标准品的候选产物.

摘要： 目的 建立3种用于检测G1、G2和G4型轮状病毒VP7基因的一步法实时逆转录PCR,用于本实验室G1、G2和G4型轮状病毒的快速检测和定量、定性分析.方法 设计G1、G2和G4型轮状病毒VP7基因特异性引物和探针,采用G1、G2和G4型轮状病毒特异性体外转录RNAs,建立实时逆转录PCR,特异性检测G1、G2和G4型轮状病毒VP7基因方法.结果 3种实时逆转录PCR标准曲线R2均大于0.99,扩增效率均在90％～110％之间.不同浓度体外转录RNAs重复性检测结果CV均<5％,且可以对单拷贝RNAs样本进行检测.结论 本检测方法快速、灵敏且重复性好,可以对轮状病毒VP7基因进行特异而有效的检测,为实验室轮状病毒毒株的分型和定量检测提供了特异而有效的检测方法,也为今后多重实时逆转录PCR的建立奠定了试验基础.

摘要： 为探讨脱氧核酶在抑制PRRSV复制研究，利用体外转录方法制备PRRSV GP5基因RNA并用该RNA对其所设计靶脱氧核酶进行初步筛选。通过构建含有T7启动子序列的GP5基因的重组质粒，用RiboMAXTM T7 Express System体外转录试剂盒成功制备了高纯度的GP5基因RNA，经体外剪切筛选出具有体外切割活性的2种脱氧核酶，其中DZ-12具有高效切割活性，为进一步研究脱氧核酶在细胞水平、体内水平剪切GPS基因mRNA,抑制PRRSV GP5基因的蛋白表达奠定了基础，并有望应用于抗病毒药物开发和转基因动物研究。

摘要： 目的：为探讨脱氧核酶在抑制GPMV复制研究，利用体外转录方法制备鹅副黏病毒病NP、L基因RNA并用该RNA对其所设计靶脱氧核酶进行初步筛选。方法：通过RT-PCR方法获得目的基因NP、L，同时针对NP、L基因保守区上游设计T7启动子序列及酶切位点，从而获得带有T7启动子序列的NP、L基因保守区，并将其连接到PUM-T simple克隆载体上，经HindⅢ和Barry H Ⅰ双酶切反应、菌落PCR、以及基因测序鉴定重组质粒。重组质粒T7-NP及T7-L经HindⅢ线性化后作为体外转录反应的模板。结果：经测序鉴定，正确地构建含T7启动子的NP及L基因的重组质粒，按RiboMAXTM T7 Express System体外转录试剂盒说明将线性重组质粒转录出高纯度的GPS基因RNA。结论：为进一步研究脱氧核酶在细胞水平、体内水平剪切NP、L基因mRNA，抑制鹅副黏病毒NP、L基因的蛋白表达奠定了基础，并有望应用于抗病毒药物开发和转基因动物研究。

摘要： 为建立禽呼肠孤病毒实时荧光定量RT-PCR检测方法,将PCR扩增的σC基因片段克隆到pGM-T载体,重组质粒经筛选、鉴定,Sal Ⅰ单酶切得到线性化转录模板DNA,体外转录出RNA,梯度稀释作为阳性模板,用于标准曲线的制定.根据S1基因σC结构蛋白基因保守区域设计一对扩增片断为147bp的特异性引物,以体外转录的RNA作为标准品,应用SYBR Green Ⅰ染料法建立了检测禽呼肠孤病毒的一步法实时荧光定量RT-PCR方法.对禽呼肠孤病毒阳性样品进行了特异性、敏感性和重复性试验,结果表明,制作的标准曲线定量浓度范围宽,比常规的RT-PCR敏感103倍,可检测到每个反应相当于5.2×102个拷贝的标准品RNA,与NDV、IBDV、MG都不反应;从攻毒鸡的关节组织可以检测到病毒,病毒含量在105-107个拷贝/uL之间.建立的实时荧光定量RT-PCR具有特异、敏感、快速、定量、重复性好等优点,可用于临床上鸡感染ARV的检测.

摘要： 对单股正链RNA病毒的研究发现：基因组5’非翻译区(5’UTR)在病毒的复制，转录，翻译过程中发挥了至关重要的作用。对猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒(PRRSV)5'UTR的研究意义重大。因此本研究在PRRSV感染性克隆pCBC2的基础上，通过突变PCR获得了病毒基因组5’UTR系列缺失的全长突变体克隆：pCBCM1，pCBCM3，pCBCM5，7，9，45，69，100，随后将上述突变体体外转录成RNA之后转染MARC-145细胞，进行病毒感染性、复制和转录分析，以鉴定特定的缺失区的调控功能。结果显示：病毒5’UTR起始的第1个碱基是保持病毒感染性非必需的核苷酸；前45个碱基对病毒基因组的复制是非必需的。Northern Blot结果显示pCBCM1亚基因组mRNA可以进行高效率的转录，而其余突变体的亚基因组转录受到严重抑制。由此证明，PRRSV 5’UTR的完整性对病毒意义重大，碱基的少量以及大部分缺失会对病毒产生极大的影响。

摘要： 随着反向遗传学技术兴起和发展,RNA分子体外操作已经成为可能,并且技术日臻完善.反向遗传操作技术的关键就是构建RNA病毒的感染性分子克隆,在DNA分子水平上对其进行体外操作,从而研究病毒结构与功能的方法.本文对感染性克隆的构建方法及感染性体外转录方法作一综述.

摘要： 在一些实施方案中，本文提供了使用变性寡聚‑dT色谱来纯化低盐RNA组合物的方法。

摘要： 本发明的另一个目的可包括一种重组无细胞表达系统，其中，反应混合物包含生物化合物、蛋白、酶、生物仿制药体外生物合成或小分子化学修饰所需的所有无细胞反应组分。

摘要： 本发明提供一种体外转录mRNA的核苷酸分子、呈递细胞及应用，涉及生物技术领域，本发明提供的所述核苷酸分子至少具有SEQ ID NO.3所示的核酸序列；至少转录具有SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列或/和具有SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列的mRNA；所述呈递细胞是负载有体外转录mRNA的核苷酸分子的树突状细胞，所述体外转录mRNA的核苷酸分子可以用于制备mRNA筛选或/和评估模型，或直接用于筛选或/和评估抗原表位或mRNA，本发明提供的体外转录mRNA的核苷酸分子表达的mRNA稳定度更高，持续表达时间增长，成本低，普适性广，解决了目前的肿瘤抗原疫苗只能对单一的抗原进行呈递的技术问题。

摘要： 本发明公开了一种加帽组合物及其制备方法和体外转录反应体系，属于化学及生物工程，本申请发明人是将TRIS应用在生物酶催化体系中，所述组合物主要由加帽类似物与TRIS按照摩尔比为1:(3~7)复配的盐溶液构成，因为TRIS有比较好的生物相容性，针对一些特殊的mRNA序列进行转录时，TRIS与mRNA的生物相容性更加优异，有利于提高mRNA体外转录的效率并且可以明显提高了mRNA的加帽效率。

摘要： 本发明公开了一种细菌转录抑制剂抑制大肠杆菌体外转录活性的检测方法，包括：制备大肠杆菌体外转录pKK450‑DNA模板；以pKK3535质粒为模板，制备荧光分子信标M.B.；制备大肠杆菌体外转录体系，检测大肠杆菌转录抑制剂对体外转录抑制活性。与现有技术相比，本发明可以精确的检测细菌转录抑制剂的活性；另外，由于本发明中采用荧光酶标仪以及96孔板此类高效、快速的检测仪器，因此，可以高通量的检测大量待测样品，对转录抑制类药物的筛选有着重要的应用价值。在此方法基础上可以对抑菌物质的作用机制进行分析，以确定其对细菌转录的影响。

摘要： 本发明提供了一种用于体外转录mRNA的载体及其构建方法和利用载体转录得到mRNA的方法，属于分子克隆以及体外转录技术领域。将5'UTR序列、目的基因序列、3'UTR序列和polyA序列顺次连接到载体中，得到用于体外转录mRNA的载体。本发明提供的载体中含有5'UTR序列、目的基因序列、3'UTR序列和polyA序列，可以有效地进行mRNA的体外转录，避免了帽结构类似物的加入，3'UTR序列延长了翻译蛋白的半衰期并提高翻译效率。

摘要： 本发明涉及基因工程中的基因编辑技术领域，具体涉及一种用于果蝇CRISPR转基因的cas9转录模板DNA及质粒DNA和体外转录方法。该cas9转录模板DNA具有如SEQ ID NO：1所示的碱基序列。本发明围绕CRISPR/Cas9技术在模式动物果蝇中的应用，提供了一种优化的Cas9的表达载体，显著地提高了基因编辑效率，也为其在其他领域的应用奠定了基础。

摘要： 本发明公开了一种加帽组合物及其制备方法和体外转录反应体系，属于化学及生物工程，本申请发明人是将TRIS应用在生物酶催化体系中，所述组合物主要由加帽类似物与TRIS按照摩尔比为1:(3~7)复配的盐溶液构成，因为TRIS有比较好的生物相容性，针对一些特殊的mRNA序列进行转录时，TRIS与mRNA的生物相容性更加优异，有利于提高mRNA体外转录的效率并且可以明显提高了mRNA的加帽效率。

摘要： 本发明提供了用于制备优化的DNA序列作为模板用于mRNA体外转录的方法。优化这些DNA序列以避免RNA聚合酶过早终止转录。本发明还提供了制备优化的DNA序列的方法，所述优化的DNA序列在其3’末端包含一个或多个终止信号，以减少或防止非模板化的失控转录。

摘要： 本发明涉及分子生物学技术领域，尤其涉及甜菜碱在提高DNA体外转录效率中的应用。并且本发明提供了体外转录的试剂和对核酸的检测方法和试剂。本发明研究发现通过添加适量浓度的甜菜碱能够提高DNA的体外转录效率，从而提高对ssRNA的检测体系中靶标RNA的产量，进而可显著提高对ssRNA检测的灵敏度。特别是将本发明所述的DNA体外转录试剂与CRISPR基因编辑技术联用，有助于推动CRISPR‑Cas13a技术应用于体外诊断检测外源核酸。