克隆和表达

摘要： [目的]将一种可以高选择性水解R-甲霜灵的新脂酶基因,在大肠杆菌中进行克隆和表达,并研究重组脂酶的性质.[方法]根据已知的目标酯酶N端10个氨基酸序列,在已测序的Albibacters sp.zjut528基因组中找到相匹配的一个酯酶基因,它全长969 bp,编码322个氨基酸,将该基因命名为RMest.通过引物扩增得到该基因的DNA片段,将它与表达载体pET-28a(+)连接后,转化大肠杆菌BL21Gold(DE3),构建重组菌,IPTG诱导表达该酯酶,并用Ni2+亲和层析介质进行纯化.[结果]在重组菌RMest-pET-28a(+)-E.coli BL21 Gold (DE3)中成功表达了重组酯酶RMesterase,大小约为46 kDa.用胞内重组酶液催化水解R,S-甲霜灵,底物浓度10 g/L,反应6h,底物转化率为49.8％,产物(甲霜灵酸)的eep为99.3％,对底物的对映体R-构型具有专一(选择)性.该酶最适温度和pH分别为40°C和pH 9.0.该酶的活性受到产物甲醇的抑制.通过Blast+在Uniprot KB数据库中搜寻与酯酶RMest同源的蛋白,采用邻近法构建该酶的蛋白系统发育树,结果显示它与某些Lysophospholipase、AB hydrolase-1 domain-containing protein和Esterase的同源性最高,但是与它们均存在较大的进化距离,表明该酶是一种相对独立进化的新酯酶.[结论]在大肠杆菌中成功克隆和表达了一种新的脂酶基因RMest,重组酯酶RMesterase可以高手性选择性水解R,S-甲霜灵生成R-甲霜灵酸.

摘要： 为了使新普鲁兰酶基因在大肠杆菌中表达并实现高密度发酵生产,采用PCR方法从多粘类芽孢杆菌基因组DNA中扩增出新普鲁兰酶基因Npu,测序结果表明Npu基因全长2106 bp,编码515个氨基酸,与其他多粘类芽孢杆菌新普鲁兰酶基因序相似性高达99％.将Npu基因连接到质粒PMD18T上,构建了PMD18T-Npu vecter重组载体.将该重组裁体转化到大肠杆菌BL21中,该酶基因在大肠杆菌细胞中获得活性表达,并能将酶蛋白分泌到胞外.重组菌株BL21 PGEX 4T-1-Npu具有较好的遗传稳定性,连续传代培养10代,菌株所产酶总酶活性仍保持在715 U;纯化后的酶液于25°C保存6个月酶活性仍保持在5427 U,于4°C保存12个月酶活性仍保持在5390.5 U.这是首次对来源于类芽孢杆菌属(paenibacillus)的普鲁兰酶进行报道,由于Npu具有较好的水解淀粉支链的能力,因此其在淀粉加工业以及洗涤业上应用前景良好.

摘要： 花青素还原酶(ANR)是催化花青素还原形成单体儿茶素的关键酶.油茶(CamelliaoleiferaAbel.)属于山茶科山茶属植物,其花青素还原酶基因尚未被克隆和功能分析.本研究采用RT-PCR技术,克隆获得了两条油茶花青素还原酶基因的全长序列,CoANR1基因全长1441bp,开放阅读框(ORF)长度为1047bp,编码348个氨基酸残基,与茶树ANR1基因的蛋白序列同源性为97％;CoANR2基因全长1413bp,ORF框长度为1014bp,编码337个氨基酸残基,与茶树ANR2基因的蛋白序列同源性为99％.采用大肠杆菌表达方法获得CoANR1和CoANR2重组蛋白,纯化蛋白经体外酶活检测能够催化矢车菊色素合成儿茶素(C)和表儿茶素(EC),催化飞燕草色素合成没食子儿茶素(GC)和没食子表儿茶素(EGC).本研究为进一步研究油茶儿茶素合成的分子机制提供了重要的研究基础和理论依据.

摘要： 目的 利用蛋白检测的快速性优势,研究不同性别在SMCY抗原氨基酸序列的差异,筛选出特异性氨基酸序列,并克隆表达性别特异融合抗原,制备相应抗体,建立一种快速鉴别法医物证性别的方法.方法 通过对人SMCY和SMCX进行序列分析,发现了三段差异片段,采用搭桥PCR方法获得差异片段全长基因,连接入pET-28a载体进行原核表达,用Ni柱纯化后的性别特异融合抗原免疫制备多克隆抗体,用ELISA法和western blot检测SMCY多抗与抗原的反应特异性,制作胶体金试纸条检测样本.结果 筛选出具有性别特异性的氨基酸序列,获得SMCY性别特异融合抗原,成功制备出多克隆抗体及胶体金试纸条.结论 获得SMCY性别特异融合抗原具有很好的抗原活性,制备的多克隆抗体可以与抗原特异性地结合,用于性别鉴定.%Objective with the advantages of rapidity in detection protein, We selected the gender-specific amino acid sequence based on human SMCY and SMCX, cloned and expressed SMCY gender-specific fusion antigens. The rabbits were immunized with purified antigens to obtain the polyclonal antibodies. A new method was established for rapidly sex identification of forensic evidence samples by detecting SMCY antigens with the corresponding polyclonal antibodies. Methods We found three differential fragments by analyzing the sequence of human SMCY and SMCX. Then we cloned this three fragments and ligated as a new recombinant.This SMCY gender-specific fusion antigen gene was sub-cloned into pET-28a and expressed in Escherichia coli. The fusion antigen was purified by Ni-NTA column. The rabbits were immunized with purified antigen to produce the specific polyclonal antibodies.The reactivity of the polyclonal antibody was evaluated by ELISA and Western blotting. We developed a colloidal gold test strip for detecting the gender of human samples. Results We successfully selected gender-specific amino acid sequence, the SMCY gender-specific fusion antigen was expressed by prokaryotic expression and the polyclonal antibody was prepared by immunizing rabbit. The results of colloidal gold strip tests showed that there is a significant difference between male and female serums. Conclusion The results showed that the SMCY gender-specific fusion antigen could be recognized by the polyclonal antibody.The colloidal gold strip tests made by SMCY gender-specific fusion antigens and the corresponding polyclonal antibodies could be used for rapidly determining the gender of forensic evidence samples.

摘要： To improve the enzyme activity of β-glucosidase,twoβ-glucosidase genes from Bacilluspolymyxa were introduced separately (bglAandbglB)and together (bgl)into the pET-28a vector and expressed in Esch-erichiacoliC41 .The three recombinant strains were designated as EA,EB,and co-expression EAB.Strains EA and EB were mixed at ratios of 1:1 ,1:2 ,and 2:1 and their totalβ-glucosidase activity was compared with those of each single enzyme group,the co-expression strain,and mixed expression strains.The results of SDS-PAGE analyses showed that both BglA and BglB were 50 ku,and the size of these proteins in the EA and EB mixed cultures was also 50 ku.The size of Bgl in the co-expression strain EAB was 100 ku.These results indicated that a Bgl complex was able to form in cells,but notinvitro.In an enzyme activity assay,the activi-ty of Bgl from the co-expression strain was not significantly different from that ofbglin B.polymyxa,but it was significantly higher than those of BglA in EA and BglB in EB (P<0.05).The results of Congo red stai-ning also showed that the enzyme activity of Bgl was significantly higher than those of BglA and BglB.This study lays the foundation for the construction of artificial assemblies,and for the integration of biological tech-nologies in cellulose processing.%为了有效地提高β-葡萄糖苷酶的活性,本实验将多粘类芽孢杆菌(Bacilluspolymyxa)β-葡萄糖苷酶bglA、bglB和bgl(bglA和bglB基因)基因分别连接在pET-28a上并在大肠杆菌C41中表达.将这3株重组菌分别命名为EA、EB及共表达菌株EAB,并将构建好的工程菌EA和EB按1:1,1:2,2:1进行混合培养,分别比较单一酶组分、共表达及混合表达菌株的酶活.SDS-PAGE电泳图显示BglA和BglB的大小都为50 ku,EA和EB混合培养的蛋白大小也为50 ku,Bgl大小为100 ku,表明BglA和BglB在体外不能形成蛋白复合物,只有在生物体内才能形成Bgl复合蛋白.酶活测定结果表明共表达Bgl与多粘类芽孢杆菌的酶活差异不显著,但显著高于其他组分酶活(P<0.05).刚果红染色结果也表明Bgl酶活比单一酶组分的酶活明显提高.本实验为纤维素酶多组分人工组装及集成生物工艺菌种的构建奠定实验基础.

摘要： [目的]以毕赤酵母Pichia pastoris X-33为宿主表达猪丹毒丝菌Erysipelothrix rhusiopathiae SpaA基因氨基端的免疫保护区蛋白.[方法]以采集于广东某猪场的猪丹毒丝菌为模板,根据NCBI中已发表的Spa基因cDNA序列设计1对引物,通过PCR扩增得到SpaA-N,并将其连接到表达载体pPICZαC上,得到重组表达质粒pPICZαC-SpaA-N;用Sac I酶将重组表达质粒pPICZαC-SpaA-N线性化后电转化入毕赤酵母X-33,经含博来霉素ZencinTM抗性的YP-DS平板筛选和PCR鉴定的阳性转化子,用含不同浓度博来霉素抗性的YPDS平板筛选出高拷贝子并进行甲醇诱导培养,分别于诱导48、72、96 h后离心收集上清液,立即做SDS-PAGE,并进行SDS-PAGE及Western-blot试验.[结果和结论]成功克隆并表达了SpaA-N基因,构建了重组表达质粒pPICZαC-SpaA-N,并以毕赤酵母X-33为宿主成功表达了猪丹毒丝菌SpaA基因氨基端的免疫保护区蛋白.丹毒丝菌SpaA-N作为免疫保护区在酵母宿主中得以成功表达.

摘要： 根据鸡瘦素受体基因(LEPR)编码区序列(GenBank：NM AB033383)设计并合成2对引物，以鸡肝脏cDNA为模板扩增鸡LEPR胞外域2段cDNA序列。然后将这2段序列克隆到表达载体pRSET-A的BamH I和Hind III酶切位点之间，构建重组表达载体(pR-LEPR1和pR-LEPR2)并转化大肠杆菌E. coli BL21(DE3)。转化菌在IPTG诱导后分别表达了分子量为2.62×104的 LEPR1和分子量为2.86×104的LEPR2重组蛋白质。经凝胶Ni-NTA纯化后的重组蛋白质与矿物油佐剂混合免疫生长鸡，经过3次免疫之后，获得高效价的抗LEPR1和抗LEPR2抗血清。%Two pairs of primers designed based on the chicken leptin receptor gene ( LEPR) mature peptide se-quence (GenBank:NM AB033383) were used to amplify two cDNA sequence fragments of chicken LEPR extracellu-lar domains ( ECD) mature peptides with chicken liver cDNA as the template. The two cDNA sequence fragments were cloned into the BamH I and Hind III sites of the plasmid pRSET-A to generate the expression vector pR-LEPR1 and pR-LEPR2, which were further transformed into bacterium Escherichia coli BL21(DE3). The transformed bacte-ria were induced to produce recombinant proteins LEPR1 and LEPR2 with the expected molecular mass of 2. 62×104 and 2. 86×104 by IPTG. The recombinant LEPR1 and LEPR2 were purified and mixed into mineral oil adjuvant to immunize growing chickens to produce anti-LEPR1 and anti-LEPR2 antibodies. Antisera with high anti-LEPR1 and anti-LEPR2 titers were obtained after three immunizations.

摘要： 用稀释平板法从土壤样品中分离到166株细菌菌株,通过凝胶法初筛和Folk比色法复筛,得到一株产谷氨酰胺转氨酶(transglutaminase,TGase)的菌株,通过形态学、生理生化特征和16S rDNA序列比对证明该菌株是枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis),命名为TGasel318.克隆了该菌株TGase的编码基因tgl,序列长738bp,编码由245个氨基酸组成的蛋白质;TGase的氨基酸序列与NCBI公布的B.subtilis的TGase相似性达94％ ～100％.用B.subtilis表达载体pTZ和E.coli表达载体pET21b分别构建了含tgl的重组质粒,转化B.subtilis WB800和E.coli BL21,tgl基因表达产物在70°C下可催化BSA交联,表明tgl在B.subtilis和E.coli中获得了表达且表现出TGase活性,这为其在食品工业上的开发利用打下基础.

摘要： 本发明提供了无需利用杂交瘤细胞技术的人单克隆抗体的制备方法，采用所述的方法制备的抗体，以及采用该抗体治疗和预防病症(如人类免度缺陷病毒的病原体感染)的方法。

摘要： 本发明提供了鸡ACE2基因的克隆、蛋白的表达和纯化及其多克隆抗体的制备。提供了ACE2蛋白的氨基酸序列和基因序列，构建了ACE2原核表达载体，利用大肠杆菌原核表达系统表达ACE2蛋白，并对蛋白进行纯化。纯化后的蛋白能够制备效价较高的多克隆抗体，并且本发明中的抗原和多克隆抗体可以为进一步开发检测试剂盒奠定基础。ACE2作为RAS系统的负调节分子，通过靶向降解AngII，发挥抗损伤、抗纤维化等机体保护功能；作为急性严重呼吸系统综合征冠状病毒(SARS‑CoV)主要功能性受体，具有保护肺损伤的功能；ACE2协同氨基酸转运载体转运，与氨基酸吸收不良、肠道微生态平衡和胃肠道炎症发挥重要作用。所以本发明无论是从基础研究还是临床运用上的意义都是十分重大的。

摘要： 本发明提供了鸡CR2基因的克隆、蛋白的表达和纯化及其多克隆抗体的制备。提供了ChCR2蛋白的氨基酸序列和基因序列，构建了含有不同标签的ChCR2原核表达载体，利用大肠杆菌原核表达系统表达ChCR2蛋白，并对蛋白进行纯化。纯化后的蛋白能够制备效价较高的多克隆抗体。ChCR2基因，在鸡免疫系统中的作用十分重大。CR2能将先天性补体介导的免疫应答与病原体和外来抗原联系起来，通过与共价附着于靶标的C3d结合而产生的适应性免疫应答，其导致的细胞信号传导现象，能极大程度降低B细胞活化的阈值。B细胞在免疫系统中的位置举足轻重，所以本发明发现的ChCR2无论是从基础研究还是临床运用上的意义都是十分重大的。

摘要： 本发明涉及生物技术领域，特别涉及分子伴侣在促进单克隆抗体的形成和/或提高单克隆抗体的表达量中的应用。本发明以E.coli MG1655为出发菌株，提供了一种在大肠杆菌中表达全长IgG抗体的方法，同时共表达了分子伴侣，促进全长IgG的正确形成，提高IgG抗体的产量，为将来的工业化生产提供理论依据。

摘要： 本发明属于玉米基因克隆技术领域，具体涉及一种玉米Zm‑Prx5克隆、克隆方法及表达方法。Zm‑Prx5基因的克隆方法包括玉米总RNA提取，反转录成cDNA第一链以及基因克隆，表达方法包括融合表达载体的构建，制备农杆菌感受态细胞，pCAMBIA 1304‑Zm‑Prx5‑GFP质粒转化杆菌农杆菌感受态细胞，得到重组质粒转化菌，重组质粒转化菌转化植物体，并使Zm‑Prx5在植物体中表达等步骤。本发明提供的玉米Zm‑Prx5基因的克隆及表达方法，为玉米Zm‑Prx5基因功能的研究奠定了基础。

摘要： 本发明提供了鸡CR2基因的克隆、蛋白的表达和纯化及其多克隆抗体的制备。提供了ChCR2蛋白的氨基酸序列和基因序列，构建了含有不同标签的ChCR2原核表达载体，利用大肠杆菌原核表达系统表达ChCR2蛋白，并对蛋白进行纯化。纯化后的蛋白能够制备效价较高的多克隆抗体。ChCR2基因，在鸡免疫系统中的作用十分重大。CR2能将先天性补体介导的免疫应答与病原体和外来抗原联系起来，通过与共价附着于靶标的C3d结合而产生的适应性免疫应答，其导致的细胞信号传导现象，能极大程度降低B细胞活化的阈值。B细胞在免疫系统中的位置举足轻重，所以本发明发现的ChCR2无论是从基础研究还是临床运用上的意义都是十分重大的。

摘要： 本发明涉及尼罗罗非鱼淋巴细胞抗原75(OnLy75)的克隆、原核表达和抗罗非鱼OnLy75多克隆抗体制备的方法。公开了OnLy75基因全长序列，该序列如序列表中SEQ ID NO.1所示。所述OnLy75的编码序列位于SEQ ID NO.1的5’端第88～5286位脱氧核苷酸，编码1732个氨基酸，氨基酸序列如序列表SEQ ID NO.2所示。公开了用于制备OnLy75多克隆抗体的多肽序列，具体为序列表SEQ ID NO.4所示的序列，以及用于制备所述多克隆抗体的组合物。公开了制备抗罗非鱼OnLy75多克隆抗体的方法、由该方法获得的兔多克隆抗体及其在Western Blot检测中的应用。

摘要： 一种汉坦病毒S基因克隆、表达、单克隆抗体制备方法，包括设计扩增汉坦病毒S基因完整开放阅读框特异性引物，扩增汉坦病毒S基因；将扩增的汉坦病毒S基因克隆到pGM－T载体，转化Ecoli.TOP10感受态细胞，得到TA克隆阳性质粒，克隆到pGEX－6p－2原核表达载体，得到重组质粒pGEX－6P－2/S；将重组质粒pGEX－6P－2/S转化Ecoli.BL21菌体中，经IPTG诱导表达，得到包涵体；包涵体经溶解与复性得到重组蛋白；重组蛋白免疫Balb/c小鼠；小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞融合，选择性培养；阳性克隆筛选；单克隆抗体制备、亚型鉴定及效价检测。同时提供一种汉坦病毒S基因单克隆抗体应用。

摘要： 本发明从金银花中克隆酰基转移酶基因LjHQT，与其他植物HQT的同源性介于42～71％之间。经试验验证，LjHQT在转基因株系中的表达量与绿原酸含量呈正相关，有效提高了植物的抗病性。本发明从金银花中克隆酰基转移酶基因LjHQT，与其他植物HQT的同源性介于42～71％之间。经试验验证，LjHQT对奎尼酸的亲和力更高。在香豆酰辅酶A饱和时，LjHQT对奎尼酸的亲和力(Km＝77±45μmol/L)比莽草酸(Km＝5579±371μmol/L)高70倍。LjHQT能显著提高转基因株系中绿原酸含量，有效提高转基因植株的抗病性。

摘要： 发明涉及protocadherin1(