EGFP

摘要： 将增强型绿色荧光蛋白(Enhanced Green Fluorescent Protein,eGFP)免疫羊驼后构建纳米抗体免疫库,固相淘选eGFP纳米抗体;构建E.coli Rosetta表达载体,诱导表达纳米抗体,并鉴定其结合活性及特异性;辣根过氧化物酶(Horseradish peroxidase,HRP)标纳米抗体,确定其工作浓度及稳定性;将纳米抗体与纳米磁珠偶联应用于免疫沉淀B13-EGFP融合蛋白.四免后抗血清滴度超过1.28×106,获得库容量为1.85×108 cfu的抗eGFP纳米抗体噬菌体展示文库;原核表达10种独特基因序列的纳米抗体,均为可溶性表达;采用ForteBio Octet确定出纳米抗体4-28与eGFP的亲和常数(KD)最高,达到9.67×10-11 M;纳米抗体4-28与eGFP、绿色荧光蛋白(Green Fluo-rescent Protein,GFP)特异性结合;HRP标记纳米抗体4-28检测范围是1:10000～1:25000(浓度100～40 ng·mL-1),比市场上现有的检测二抗(稀释范围1:5000～1:20000)灵敏度更高;纳米抗体4-28偶联羧基化纳米磁珠,免疫沉淀B13-eGFP融合蛋白,实现了简单快速分离目的蛋白B13-eGFP.

摘要： RT-PCR获得猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)XZ06a株基因组,在基因组5'末端、3'末端分别添加锤头样核酶、丁型肝炎病毒核酶序列,并插入改造的pCAGEN表达载体中,构建DNA-launched感染性克隆,然后在病毒基因组ORF1b与ORF2间引入ORF6 TRS序列、酶切位点及EGFP基因,转染Marc-145细胞拯救表达EGFP的重组病毒并噬斑克隆纯化,Western blot检测EGFP表达并对获得的表达EGFP的重组病毒进行TCID50测定与分析.结果显示:PRRSV基因组大小为15145 nt,转染后5～7 d即可观察到重组病毒所致特异性病变灶,经过噬斑纯化,能够观察到携带EGFP基因的重组病毒在对应病变灶均有绿色荧光,最终获得稳定表达EGFP的重组病毒,且重组病毒感染16 h时即可检测EGFP表达;与亲本病毒相比,表达EGFP重组病毒致细胞出现病变时间有所延长,增殖滴度有所降低.本研究成功构建了表达EGFP的重组PRRSV,为开展PRRSV病毒复制机制、感染特性、致病机制、疫苗开发等研究奠定了基础.

摘要： 目的 构建以eGFP作为荧光标记的烟曲霉Bem46基因定位菌株,观察其在烟曲霉不同形态中的定位情况,初步明确该基因对极性生长相关基因Bem1、Bud5表达的影响.方法 运用分子生物学方法将烟曲霉Bem46基因克隆入质粒pUCGH,构建荧光定位载体.原生质体法转化烟曲霉获得该基因定位菌株并验证.激光共聚焦显微镜观察绿色荧光在烟曲霉孢子、芽管以及菌丝状态下分布情况.RT-PCR观察对照菌株Ku80和△Bem46中极性生长相关基因Bem1、Bud5的表达量.结果 通过全基因克隆成功获得烟曲霉Bem46基因定位菌株并经PCR验证.激光共聚焦显微镜下绿色荧光在孢子中弥散分布,在孢子即将发芽时荧光在孢子一侧聚集,并随着芽管形成,荧光在极性生长的一侧延伸分布于整个菌丝中,在菌丝形成侧枝膨大处可见荧光明显聚集.RT-PCR结果表明△Bem46中基因Bem1、Bud5表达量均较对照菌株有所下降.结论 烟曲霉Bem46基因可能同孢子发芽、菌丝发生侧枝的极性生长相关;且该基因缺陷可影响极性生长相关基因Bem1、Bud5表达.

摘要： 为了构建并筛选表达16型蓝舌病病毒(BTV-16) VP2蛋白的重组痘苗病毒rVTT-VP2,本研究通过同源重组的方法构建重组痘苗病毒,以TK基因缺失和EGFP绿色荧光为筛选标记,通过噬斑纯化法在BHK-21细胞中纯化10次,并连续传代20次来验证重组痘苗病毒遗传稳定性.PCR鉴定结果显示,VP2基因已整合到重组痘苗病毒基因组中,且未扩增出TK基因.荧光显微镜镜下观察,噬斑处均为表达绿色荧光蛋白的病变细胞.本研究成功构建了表达BTV-16 VP2蛋白重组痘苗病毒rVTT-VP2,为后期疫苗的研究奠定了基础.

摘要： 构建具有EGFP标签的抑癌基因p53表达载体,并验证其对肺癌细胞A549的影响.以质粒pcDNA3.1-p53为模板,设计引物并进行PCR扩增获得目的基因p53,将获得的目的基因克隆至载体pcDNA3.1-EGFP上,用琼脂糖凝胶电泳检测目的条带,双酶切以及测序验证.将克隆好的载体,利用脂质体法转染A549细胞,荧光显微镜下观察,同时用MTT法测不同时间段细胞OD值.结果表明,琼脂糖凝胶电泳结果显示,目的基因扩增成功.双酶切及DNA测序结果均证实,成功构建了载体pcDNA3.1-EGFP-p53.转染A549细胞后,荧光显微镜下观察到绿色荧光.MTT法测定结果表明,目的基因转染的A549细胞组所测得的OD值明显低于对照组(p<0.01).因此,具有EGFP标签的抑癌基因p53表达载体pcDNA3.1-EGFP-p53构建成功,转染A549细胞后,对A549细胞具有一定抑制作用.为后续继续研究p53-MDM2生物发光能量共振转移作用奠定了基础.

摘要： 目的:通过脂质体法转染不同荧光蛋白质粒到多种接种密度细胞的效率差异探讨恶性转化细胞的癌变过程.方法:以16HBE、结晶型NiS诱导的16HBE恶性转化细胞和反式-BPDE诱导的16HBE恶性转化细胞为实验对象,采用不同的细胞接种密度,用脂质体法对它们分别转染两种不同的表达荧光蛋白的质粒,通过荧光显微镜观察细胞的转染情况.结果:无论转染eGFP质粒还是GFP-LC3质粒,在多种细胞密度下,正常细胞16HBE都比恶性转化细胞的转染效率低.结论:恶性转化细胞在癌变过程中可能发生了细胞膜通透性的改变.%Objective: To investigate the carcinogenesis of malignant transformation cells by comparing the difference in transfection efficiency of exogenous plasmids through liposome between normal cells and malignant transfected cells. Methods: Two types of plasmids that express the fluorescent proteins were transfected with liposome into cells such as 16HBE and its malignant transformation cells induced by crystalline nickel sulfide and anti-benzo (a) pyrene separately, and the transfection were observed by fluorescent microscope. Results:In a range of cell density, the transfection effi-ciency of normal cells 16HBE is lower than that of the malignant transfected cells both with the plasmids eGFP and GFP-LC3. Conclusion:Inconsistency in membrane permeability between normal cells and malignant transfected cells leads to inconsistency in transfection efficiency.

摘要： 将扩增得到的PPVSC-1株VP2基因产物插入转移载体质粒pPI-2．EGFP中，得到了转移载体质粒pPI～2．EGFP．VP2。再以含有PCV2SC株全基因组的重组质粒pMD-PCV2为模板扩增PCV2ORF2基因，进一步将其插入pPI-2．EGFP．VP2中，构建含有PPVVP2基因、PCV2ORF2基因及EGFP报告基因的PRV基因缺失转移载体质粒pPI-2．EGFP．VP2．ORF2。通过脂质体介导法将pPI-2．EGFP．VP2．ORF2DNA转染Vero细胞后，通过直接荧光观察，观察到了绿色荧光蛋白的融合表达。

摘要： 将扩增得到的PPVSC-1株VP2基因产物插入转移载体质粒pPI-2．EGFP中，得到了转移载体质粒pPI～2．EGFP．VP2。再以含有PCV2SC株全基因组的重组质粒pMD-PCV2为模板扩增PCV2ORF2基因，进一步将其插入pPI-2．EGFP．VP2中，构建含有PPVVP2基因、PCV2ORF2基因及EGFP报告基因的PRV基因缺失转移载体质粒pPI-2．EGFP．VP2．ORF2。通过脂质体介导法将pPI-2．EGFP．VP2．ORF2DNA转染Vero细胞后，通过直接荧光观察，观察到了绿色荧光蛋白的融合表达。

摘要： 将扩增得到的PPVSC-1株VP2基因产物插入转移载体质粒pPI-2．EGFP中，得到了转移载体质粒pPI～2．EGFP．VP2。再以含有PCV2SC株全基因组的重组质粒pMD-PCV2为模板扩增PCV2ORF2基因，进一步将其插入pPI-2．EGFP．VP2中，构建含有PPVVP2基因、PCV2ORF2基因及EGFP报告基因的PRV基因缺失转移载体质粒pPI-2．EGFP．VP2．ORF2。通过脂质体介导法将pPI-2．EGFP．VP2．ORF2DNA转染Vero细胞后，通过直接荧光观察，观察到了绿色荧光蛋白的融合表达。

摘要： 将扩增得到的PPVSC-1株VP2基因产物插入转移载体质粒pPI-2．EGFP中，得到了转移载体质粒pPI～2．EGFP．VP2。再以含有PCV2SC株全基因组的重组质粒pMD-PCV2为模板扩增PCV2ORF2基因，进一步将其插入pPI-2．EGFP．VP2中，构建含有PPVVP2基因、PCV2ORF2基因及EGFP报告基因的PRV基因缺失转移载体质粒pPI-2．EGFP．VP2．ORF2。通过脂质体介导法将pPI-2．EGFP．VP2．ORF2DNA转染Vero细胞后，通过直接荧光观察，观察到了绿色荧光蛋白的融合表达。

摘要： 将扩增得到的PPVSC-1株VP2基因产物插入转移载体质粒pPI-2．EGFP中，得到了转移载体质粒pPI～2．EGFP．VP2。再以含有PCV2SC株全基因组的重组质粒pMD-PCV2为模板扩增PCV2ORF2基因，进一步将其插入pPI-2．EGFP．VP2中，构建含有PPVVP2基因、PCV2ORF2基因及EGFP报告基因的PRV基因缺失转移载体质粒pPI-2．EGFP．VP2．ORF2。通过脂质体介导法将pPI-2．EGFP．VP2．ORF2DNA转染Vero细胞后，通过直接荧光观察，观察到了绿色荧光蛋白的融合表达。

摘要： 将扩增得到的PPVSC-1株VP2基因产物插入转移载体质粒pPI-2．EGFP中，得到了转移载体质粒pPI～2．EGFP．VP2。再以含有PCV2SC株全基因组的重组质粒pMD-PCV2为模板扩增PCV2ORF2基因，进一步将其插入pPI-2．EGFP．VP2中，构建含有PPVVP2基因、PCV2ORF2基因及EGFP报告基因的PRV基因缺失转移载体质粒pPI-2．EGFP．VP2．ORF2。通过脂质体介导法将pPI-2．EGFP．VP2．ORF2DNA转染Vero细胞后，通过直接荧光观察，观察到了绿色荧光蛋白的融合表达。

摘要： 将扩增得到的PPV SC-1株VP2基因插入转移载体质粒pPI-2.EGFP中,构建了含PPV VP2基因及其EGFP报告基因的PRV基因缺失转移载体质粒pPI-2.EGFP.VP2.采用磷酸钙转染系统,将pPI-2.EGFP.VP2 DNA和PRV DNA共转染Vero细胞后通过直接荧光观察、Dot-blot核酸杂交筛选得到几株重组病毒,将其中一株(命名为SA215-1)用BamH Ⅰ酶切和Southern转印杂交进一步验证重组病毒成功构建,并通过SDS-PAGE电泳和Western免疫印迹检测表明PPV VP2基因在重组病毒内获得表达,产生大小约93kd的融合蛋白,同时融合蛋白中的PPV VP2结构蛋白仍然保持了原有的免疫特性,表明成功构建了含绿色荧光蛋白基因的猪细小病毒病-伪狂犬病重组病毒.

摘要： 将扩增得到的PPV SC-1株VP2基因插入转移载体质粒pPI-2.EGFP中,构建了含PPV VP2基因及其EGFP报告基因的PRV基因缺失转移载体质粒pPI-2.EGFP.VP2.采用磷酸钙转染系统,将pPI-2.EGFP.VP2 DNA和PRV DNA共转染Vero细胞后通过直接荧光观察、Dot-blot核酸杂交筛选得到几株重组病毒,将其中一株(命名为SA215-1)用BamH Ⅰ酶切和Southern转印杂交进一步验证重组病毒成功构建,并通过SDS-PAGE电泳和Western免疫印迹检测表明PPV VP2基因在重组病毒内获得表达,产生大小约93kd的融合蛋白,同时融合蛋白中的PPV VP2结构蛋白仍然保持了原有的免疫特性,表明成功构建了含绿色荧光蛋白基因的猪细小病毒病-伪狂犬病重组病毒.

摘要： 将扩增得到的PPV SC-1株VP2基因插入转移载体质粒pPI-2.EGFP中,构建了含PPV VP2基因及其EGFP报告基因的PRV基因缺失转移载体质粒pPI-2.EGFP.VP2.采用磷酸钙转染系统,将pPI-2.EGFP.VP2 DNA和PRV DNA共转染Vero细胞后通过直接荧光观察、Dot-blot核酸杂交筛选得到几株重组病毒,将其中一株(命名为SA215-1)用BamH Ⅰ酶切和Southern转印杂交进一步验证重组病毒成功构建,并通过SDS-PAGE电泳和Western免疫印迹检测表明PPV VP2基因在重组病毒内获得表达,产生大小约93kd的融合蛋白,同时融合蛋白中的PPV VP2结构蛋白仍然保持了原有的免疫特性,表明成功构建了含绿色荧光蛋白基因的猪细小病毒病-伪狂犬病重组病毒.

摘要： 将扩增得到的PPV SC-1株VP2基因插入转移载体质粒pPI-2.EGFP中,构建了含PPV VP2基因及其EGFP报告基因的PRV基因缺失转移载体质粒pPI-2.EGFP.VP2.采用磷酸钙转染系统,将pPI-2.EGFP.VP2 DNA和PRV DNA共转染Vero细胞后通过直接荧光观察、Dot-blot核酸杂交筛选得到几株重组病毒,将其中一株(命名为SA215-1)用BamH Ⅰ酶切和Southern转印杂交进一步验证重组病毒成功构建,并通过SDS-PAGE电泳和Western免疫印迹检测表明PPV VP2基因在重组病毒内获得表达,产生大小约93kd的融合蛋白,同时融合蛋白中的PPV VP2结构蛋白仍然保持了原有的免疫特性,表明成功构建了含绿色荧光蛋白基因的猪细小病毒病-伪狂犬病重组病毒.

摘要： 本发明公开了鸭瘟病毒gE基因转移载体pUC-ΔgE-EGFP，包含转移载体pUC-ΔgE-EGFP的大肠杆菌种(Escherichia coli)JM109于2012年2月24日保藏于位于中国武汉大学的中国典型培养物保藏中心，其保藏编号为CCTCC NO：M2012033；分类命名为大肠杆菌JM109/pUC-ΔgE-EGFP(Escherichia coli JM109/pUC-ΔgE-EGFP)。该转移载体可通过与鸭瘟病毒同源重组，获得EGFP标记基因的重组鸭瘟病毒，鸭瘟病毒gE缺失重组株DPV-ΔgE-EGFP，于2012年2月23日保藏于位于中国武汉大学的中国典型培养物保藏中心，其保藏编号为CCTCC NO：V201210。该重组病毒将可以发展成为具有筛选标记的有效预防鸭瘟的新型疫苗。

摘要： 本发明公开了一种鸭瘟病毒转移载体pUC-ΔgC-EGFP及鸭瘟病毒gC缺失重组株DPV-ΔgC-EGFP，含所述转移载体pUC-ΔgC-EGFP的大肠杆菌种(Escherichia coli)DH5α于2011年11月30日保藏于位于中国武汉大学的中国典型培养物保藏中心，其保藏号为CCTCC NO：M2011432。该转移载体可通过与鸭瘟病毒同源重组，挑斑纯化后获得EGFP标记的重组病毒DPV-ΔgC-EGFP。实验结果表明，三种剂量重组病毒DPV-ΔgC-EGFP和弱毒疫苗一样能够给强毒攻击后的雏鸭提供100％保护，揭示其有望发展成为一种有效预防鸭瘟病的新型疫苗。

摘要： 本发明涉及生物医学技术领域，尤其涉及EGFP‑Wnt2融合蛋白抗原和Wnt2单克隆抗体以及Wnt2单克隆抗体的应用，EGFP‑Wnt2融合蛋白抗原主要是EGFP与人源Wnt2除信号肽的全长氨基酸序列的融合蛋白，所述EGFP‑Wnt2融合蛋白抗原包括EGFP氨基酸序列、TEV酶切位点和FLAG标签序列、Wnt2除信号肽全长氨基酸序列、6×His标签序列，抗Wnt2单克隆抗体能够用于抑制肿瘤细胞的免疫逃逸和生长。本发明的Wnt2单克隆抗体结合细胞分泌的人Wnt2抗原时，拮抗细胞对肿瘤内抑制性免疫微环境形成的促进，抑制肿瘤细胞的免疫逃逸及生长。本发明提供的Wnt2单克隆抗体能够用于食管鳞癌、胃癌、胰腺癌、直肠结肠癌、肺癌、乳腺癌、胶质细胞瘤、肝癌等实体肿瘤的免疫治疗中。

摘要： 本发明涉及基因工程抗体技术，具体为针对EGFP标签的单域重链抗体，其具有如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列，其核酸序列如SEQ ID NO.2所示。本发明的一种针对EGFP纳米抗体能够良好地特异性结合绿色荧光蛋白，可应用于检测抗体、富集纯化目的蛋白、靶向纳米材料等领域。

摘要： 本发明公开了Keratin 5‑IRES‑eGFP敲入的hESCs细胞系的构建及诱导分化方法。具体方法为：构建sgRNA质粒，根据sgRNA切割位点构建打靶Doner载体，将cas9质粒，sgRNA质粒，打靶Doner载体共电转至hESCs细胞，得到初步阳性单克隆细胞系后电转表达cre酶的质粒，通过PCR跑胶和测序得到最终Keratin 5‑IRES‑eGFP敲入的hESCs细胞系。诱导分化hESCs细胞为角质形成细胞从而得到Keratin 5阳性的基底层角质形成细胞。该细胞系的建立有利于筛选出Keratin 5阳性的基底层角质形成细胞，从而为临床上表皮基底角质形成细胞异常的皮肤病研究提供细胞模型。

摘要： 本发明公开了一种pSFVCs‑EGFP病毒样颗粒及其制备方法，包括：设计与合成引物：构建得到复制子质粒pSFVCs‑sp6‑EGFP；将复制子质粒pSFVCs‑sp6‑EGFP进行体外转录；再将其体外转录的mRNA共电转入BHK细胞中，得到pSFVCs‑EGFP病毒样颗粒。相应的，本发明在pSFVCs‑EGFP病毒样颗粒基础上构建了去除病毒衣壳蛋白结构的复制子质粒pSFV‑sp6‑EGFP，进而制备出病毒样颗粒pSFV‑EGFP。实施本发明，所述病毒样颗粒pSFV‑EGFP增强了EGFP蛋白的表达，成功建立了一种以塞姆利基森林病毒为载体高效表达其它重要外源蛋白的平台，为后续RNA疫苗研制奠定实验基础。

摘要： 本发明公开了鸭瘟病毒gE基因转移载体pUC-ΔgE-EGFP，包含转移载体pUC-ΔgE-EGFP的大肠杆菌种(Escherichia coli)JM109于2012年2月24日保藏于位于中国武汉大学的中国典型培养物保藏中心，其保藏编号为CCTCC M2012033；分类命名为大肠杆菌JM109/pUC-ΔgE-EGFP(Escherichia coli JM109/pUC-ΔgE-EGFP)。该转移载体可通过与鸭瘟病毒同源重组，获得EGFP标记基因的重组鸭瘟病毒，鸭瘟病毒gE缺失重组株DPV-ΔgE-EGFP，于2012年2月23日保藏于位于中国武汉大学的中国典型培养物保藏中心，其保藏编号为CCTCC NO：V201210。该重组病毒将可以发展成为具有筛选标记的有效预防鸭瘟的新型疫苗。

摘要： 本发明公开了一种鸭瘟病毒转移载体pUC-ΔgC-EGFP及鸭瘟病毒gC缺失重组株DPV-ΔgC-EGFP，含所述转移载体pUC-ΔgC-EGFP的大肠杆菌种(Escherichia coli)DH5α于2011年11月30日保藏于位于中国武汉大学的中国典型培养物保藏中心，其保藏号为CCTCC NO：M2011432。该转移载体可通过与鸭瘟病毒同源重组，挑斑纯化后获得EGFP标记的重组病毒DPV-ΔgC-EGFP。实验结果表明，三种剂量重组病毒DPV-ΔgC-EGFP和弱毒疫苗一样能够给强毒攻击后的雏鸭提供100％保护，揭示其有望发展成为一种有效预防鸭瘟病的新型疫苗。

摘要： 本发明公开了一种构建稳定表达绿色荧光蛋白的Huh7‑eGFP细胞株的方法，包括如下步骤：(1)pCEP4‑eGFP重组质粒的构建：将绿色荧光蛋白eGFP连接至高拷贝质粒载体pCEP4上，并转化感受态大肠杆菌；将转化后的大肠杆菌进行质粒提取，获得pCEP4‑eGFP质粒；(2)pCEP4‑eGFP质粒导入Huh7细胞：利用PEI转染试剂将pCEP4‑eGFP质粒转染进Huh7细胞中，然后将转染后的Huh7细胞扩大培养；再利用潮霉素B筛选Huh7细胞，将筛选得到的阳性Huh7细胞经有限稀释法后，获得阳性表达率高的Huh7细胞群；选择绿色荧光表达强的细胞克隆，继续扩大培养，并在倒置荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白表达情况，直至获得稳定表达绿色荧光蛋白的细胞株。该细胞株稳定性强，为下游肝细胞癌的治疗及药物筛选提供了很好的工具。

摘要： 本发明公开了一种用药物莨菪亭建立的转基因鱼(mbp:egfp)脱髓鞘疾病模型的构建方法，所述方法是将转基因鱼(mbp:egfp)置于18.5ug/ml莨菪亭溶液中，3‑6天即完成斑马鱼模型的构建。本发明通过结合基因，环境和老化等多种因素，可快速构建斑马鱼脱髓鞘疾病模型，为脱髓鞘疾病的机制和治疗方法提供基础。