摘要:
采用体外细胞培养的方法,用不同浓度的脱氧胆酸(DCA)处理SHSY-5Y细胞,用MTT法检测细胞存活率;通过AO/EB、Hoechst染色用荧光显微镜进行形态学观察;划痕实验探究DCA对细胞迁移的影响;通过不同荧光染色的流式细胞术来检测DCA作用后细胞周期的分布、活性氧含量和以及细胞凋亡率;通过Western Blot和RT-PCR检测DCA处理后相关蛋白和基因的表达变化情况探讨DCA作用的分子机制. 结果表明,DCA作用能够抑制SHSY-5Y细胞株的增殖,可以促进细胞乳酸脱氢酶的释放,可以使细胞形成克隆能力下降.通过形态学观察,发现细胞呈现出细胞变圆皱缩、细胞核染色质浓缩、细胞核碎裂形成凋亡小体等凋亡特征性的形态学现象.划痕实验表明,DCA作用下,细胞迁移能力降低.流式细胞仪检测细胞周期分布、细胞凋亡率、活性氧含量结果显示,经DCA诱导处理48h后,细胞周期在G2/M期所占比例显著增多,细胞凋亡率明显增大,细胞内活性氧增加,均表现为浓度依赖性.0.8mmol/L DCA处理48h后SHSY-5Y处于G2/M期细胞由10.0%提升到41.5%,细胞凋亡率由1.46%提升至51.81%.Western blot和RT-PCR结果显示,在DCA作用下,p21、p53、Bax等相关抑癌基因表达水平上调,Bcl-2、Akt等相关致癌基因表达水平下调,CDK1、Cylin B1等周期蛋白表达量下降.从而可以得出基本结论,DCA作用下,通过影响p21、p53、CDK1、Cylin B1等相关因子的表达,可以将细胞周期阻滞在G2/M期;通过影响Bcl-2、Bax、Akt等蛋白的表达量进而导致线粒体膜电位下降,膜通透性增加,进而释放Cyt c到胞浆,与胞浆内Apaf1结合,各因子之间级联反应放大凋亡效应,下游凋亡执行者Caspase被激活,引起SHSY-5Y细胞凋亡.综上所述,DCA可以显著抑制神经母瘤细胞SHSY-5Y增殖,并呈浓度依赖关系;DCA处理后,使细胞周期被阻滞在G2/M期,并经线粒体途径诱导细胞凋亡.