肝细胞

摘要： 背景:间充质干细胞是治疗肝功能衰竭的重要细胞来源,将其诱导分化为肝细胞后能提高肝功能衰竭的治疗效果.目的:探讨胎盘组织来源间充质干细胞在体外诱导分化为成熟肝细胞的可行性,为其用于肝功能衰竭治疗奠定基础.方法:从人胎盘组织中分离培养人胎盘来源间充质干细胞,采用流式细胞分析、多向诱导分化等方法鉴定.应用多细胞因子将胎盘间充质干细胞向肝细胞诱导分化22 d,采用免疫荧光染色检测肝细胞标志物的表达变化,糖原染色检测细胞的糖原合成能力.结果 与结论:①倒置显微镜下可见分离培养的细胞为梭形或成纤维细胞样细胞,增殖迅速,传10代后细胞形态未见明显变化;②流式细胞分析结果显示CD73、CD90、CD105、CD44、CD166、CD29、CD54、HLA-ABC在胎盘间充质干细胞中阳性率超过95％,而CD34、CD45、CD117、CD14、CD19、CD133、CD31、HLA-DR均为阴性;③经成脂、成骨、成软骨细胞诱导分化后,油红O、茜素红、阿辛蓝染色均为阳性;④向肝细胞诱导分化22 d后,呈圆形或多角形、细胞界限明显的典型肝细胞形态,免疫荧光染色显示大量细胞表达肝细胞表面标志物白蛋白、细胞角蛋白18、HepPar1、CYP7A1,糖原染色为阳性;⑤结果表明,从人胎盘组织分离培养的细胞为间充质干细胞,人胎盘间充质干细胞在体外可诱导分化为成熟肝细胞,有望为肝功能衰竭治疗提供可靠的肝细胞来源.

摘要： 背景:体外人工肝系统已成为临床上非常有效且实用的肝衰竭治疗手段,但仍存在细胞来源有限和获得细胞的功能有限等问题.目的:优化和筛选符合细胞生长需要的明胶-胶原复合凝胶,以复合凝胶为细胞生长的基底材料,探究诱导骨髓间充质干细胞肝向分化的方案.方法:将明胶溶液与胶原溶液按照不同的体积比(1:1、2:1、4:1)混合,分别制备明胶质量浓度为50,100,150,200 g/L的明胶-胶原复合凝胶,通过熔点、微观形貌、吸水率和孔隙率筛选溶液的体积比与明胶的质量浓度,进行后续实验.将大鼠骨髓间充质干细胞接种于复合水凝胶中(实验组),以单独培养的细胞为对照,采用CCK-8法检测细胞增殖;采用两阶段分步诱导方案来诱导两组大鼠骨髓间充质干细胞的肝向分化,于诱导培养的3,7,14,21 d检测上清中白蛋白与尿素的水平.结果 与结论:①对比熔点、微观形貌、吸水率和孔隙率检测结果,当明胶溶液与胶原溶液按照4:1体积比混合、明胶质量浓度为150 g/L时制备的复合凝胶最适宜用于细胞培养.②CCK-8检测显示,实验组培养1,3,5 d的细胞增殖活性低于对照组,此后两组间的差距逐渐减小,至10 d时已无差异.③肝向诱导分化实验显示,随着诱导时间的延长,两组白蛋白合成量逐渐增加,其中实验组14,21 d的白蛋白合成量高于对照组(P0.05).④结果表明,以明胶-胶原复合凝胶为细胞生长的基底材料联合诱导因子可诱导大鼠骨髓间充质干细胞分化为肝样细胞.

摘要： 背景:体外人工肝系统已成为临床上非常有效且实用的肝衰竭治疗手段,但仍存在细胞来源有限和获得细胞的功能有限等问题。目的:优化和筛选符合细胞生长需要的明胶-胶原复合凝胶,以复合凝胶为细胞生长的基底材料,探究诱导骨髓间充质干细胞肝向分化的方案。方法:将明胶溶液与胶原溶液按照不同的体积比(1∶1、2∶1、4∶1)混合,分别制备明胶质量浓度为50,100,150,200 g/L的明胶-胶原复合凝胶,通过熔点、微观形貌、吸水率和孔隙率筛选溶液的体积比与明胶的质量浓度,进行后续实验。将大鼠骨髓间充质干细胞接种于复合水凝胶中(实验组),以单独培养的细胞为对照,采用CCK-8法检测细胞增殖;采用两阶段分步诱导方案来诱导两组大鼠骨髓间充质干细胞的肝向分化,于诱导培养的3,7,14,21 d检测上清中白蛋白与尿素的水平。结果与结论:(1)对比熔点、微观形貌、吸水率和孔隙率检测结果,当明胶溶液与胶原溶液按照4∶1体积比混合、明胶质量浓度为150 g/L时制备的复合凝胶最适宜用于细胞培养。(2)CCK-8检测显示,实验组培养1,3,5 d的细胞增殖活性低于对照组,此后两组间的差距逐渐减小,至10 d时已无差异。(3)肝向诱导分化实验显示,随着诱导时间的延长,两组白蛋白合成量逐渐增加,其中实验组14,21 d的白蛋白合成量高于对照组(P0.05)。(4)结果表明,以明胶-胶原复合凝胶为细胞生长的基底材料联合诱导因子可诱导大鼠骨髓间充质干细胞分化为肝样细胞。

摘要： 背景:如何在体外获得足够数量和质量的肝细胞,是生物人工肝临床应用亟待解决的核心问题.目的:对肝细胞体外3D规模化扩增培养体系的主要研究内容进行综述,总结了当前主要的肝种子细胞来源、3D培养方法、生物反应器系统以及培养过程关键指标实时在线监测的进展和局限,并对自动化、智能化生物反应器系统进一步发展进行展望.方法:由第一作者检索Web of Science核心数据库、ScienceDirect、EI、PubMed以及中国知网数据库,英文检索词为:"hepatocyte,3D culture,proliferate,bioreactor system,monitor and control",中文检索词为:"肝细胞、3D培养、增殖、生物反应器系统、监测和控制".文献检索时间范围为2005年1月至2021年3月,文献的类型包括研究原著、综述和荟萃分析,最终筛选出93篇文献进行综述.结果 与结论:①目前肝种子细胞来源、3D培养方式、生物反应器系统构建以及关键生化指标实时在线监测方法等方面的研究均取得了一定进展,为进一步构建肝细胞体外3D规模化培养体系奠定了坚实的基础.②人肝癌细胞系、永生化肝细胞、干细胞分化及其他来源的肝细胞均能在体外培养增殖并进行肝功能表达,其中干细胞分化和直接重编程得到的肝细胞样细胞具有成熟肝脏细胞类似的细胞形态、功能和基因表达谱特征,在未来有更大的应用前景.③3D悬浮培养在培养密度、传质效率方面表现优异,且具有易于放大、接种和取用方便等优点,是肝细胞体外3D培养方式的主要发展方向.④现有的生物反应器系统虽然能实现肝细胞体外培养扩增,但自动化程度低,且缺乏对关键生化指标进行实时在线检测方法;此外,当前这几方面的研究相互融合程度低,也制约了肝细胞体外3D规模化培养体系的进展.⑤未来的研究重点是结合不同来源的肝种子细胞的生长特性,选择适合培养方式,以建立培养过程中的关键参数实时在线监测方法,从而构建高度自动化和智能化生物反应器系统,最终实现肝细胞体外规模化制备.

摘要： 外基质(特别是胶原)合成增加和降解减少的结果,取决于二者的动态平衡。肝纤维化由肝星状细胞(或Ito细胞)活化启动;肝细胞、血小板细胞以及肝窦内皮细胞的破坏,导致肝枯否细胞中多种细胞因子分泌,参与纤维化形成。肝星状细胞是肝脏细胞外基质的主要来源,其一旦活化,即转分化为肌成纤维细胞,伴细胞外基质合成增加、大量沉积,导致肝纤维化。

摘要： 脂肪肝(fatty liver,FL)是肝细胞内脂肪过度贮集形成的,近来认为,脂滴(lipid droplets,LD)才是它形成的根。随着电镜、探针、高分辨率显微镜、显微分光术及组学检测的发展,在内质网(ER)形成的由脂质和蛋白质构成的LD,是一种高动力性多动能的细胞器。探讨LD的生物学和生化学的改变与FL的关联已是目前研究的热点;。

摘要： 目的:探讨罗汉果皂苷Ⅵ(MⅥ)对脂多糖(LPS)致体外肝细胞损伤的保护作用及其机制。方法:构建LPS诱导的L02细胞损伤模型,采用不同浓度(7.5、15、30μmol/L)MⅥ或30μmol/L MⅥ联合4 mmol/L PGC-1α抑制剂SR-18292处理24 h,MTT检测细胞增殖活性;比色法检测细胞培养上清中丙氨酸氨基转移酶(ALT)和天冬氨酸氨基转移酶(AST)水平,以及细胞中超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)活性和丙二醛(MDA)含量;流式细胞术检测细胞凋亡率;Mito-Tracker Green染色法观察细胞线粒体分裂;qRT-PCR检测线粒体DNA(mtDNA)的拷贝数;qRT-PCR和Western blotting检测细胞中PGC-1α、NRF-1、TFAM的表达水平。结果:与对照组比较,LPS组L02细胞增殖活性及胞内GSH-Px和SOD活性均明显降低(P<0.05);细胞凋亡率,上清液中ALT、AST水平及胞内MDA含量均明显升高(P<0.05);线粒体分裂水平、mtDNA拷贝数及PGC-1α、NRF-1、TFAM的mRNA和蛋白表达水平均明显降低(P<0.05)。与LPS组比较,不同剂量MⅥ处理后,细胞增殖活性及胞内GSHPx和SOD活性均明显升高(P<0.05);细胞凋亡率,上清液中ALT、AST水平及胞内MDA含量均明显降低(P<0.05);线粒体分裂水平、mtDNA拷贝数及PGC-1α、NRF-1、TFAM的mRNA和蛋白表达水平均明显升高(P<0.05)。然而,SR-18292处理可明显抑制MⅥ对细胞损伤的改善效果。结论:MⅥ能有效改善LPS致体外肝细胞损伤,其潜在的分子机制可能是通过增强PGC-1α/NRF-1/TFAM信号通路,进而促进肝细胞线粒体生物合成,降低细胞内氧化应激水平,抑制细胞凋亡。

摘要： 旨在探究牦牛胰岛素样生长因子结合蛋白4(Bos grunniens insulin-like growth factor binding protein 4,BgIGFBP4)在牦牛肝细胞增殖及小鼠生长中的作用。本研究构建了pET-28a-BgIGFBP4原核表达载体,对其进行表达、鉴定,用终浓度为0.002、0.02、0.2、2、20μg·mL^(-1)的BgIGFBP4蛋白处理肝细胞,采用CCK8法、细胞集落形成试验检测BgIGFBP4蛋白对肝细胞增殖能力的影响。再根据试验结果选取浓度蛋白处理肝细胞,检测24、48、72 h时肝细胞活性、肝细胞上清生长类激素和肝细胞PI3K-Akt信号通路的变化。选取30日龄((18±1)g)健康雄性KM小鼠,试验组每2 d灌喂100μL 50μg·mL^(-1) BgIGFBP4蛋白,对照组用等量0.9%的生理盐水进行灌喂,每组40只,共80只。试验前进行饥饿处理12 h,试验周期为28 d,在试验28 d时检测各项生长性能指标、血清生长类激素水平和肝PI3K-Akt信号通路的变化。结果显示,获得大小约28.86 ku的BgIGFBP4蛋白,并纯化鉴定得到该目的蛋白。2μg·mL^(-1) BgIGFBP4蛋白可促进牦牛肝细胞增殖及集落形成。与对照组相比,试验组(2μg·mL^(-1)BgIGFBP4蛋白处理)肝细胞上清GH、VEGF含量显著升高(P<0.05),肝细胞中PI3K-Akt信号通路细胞增殖相关基因ERBB2、IRS1、PIK3R1、AKT1、RAF1、MAPK3转录水平显著升高(P<0.05)。与对照组相比,试验组(100μL 50μg·mL^(-1) BgIGFBP4蛋白处理)小鼠平均日增重显著增加、料重比显著降低,肝、脾、肺、肾、小肠器官指数显著增加(P<0.05)。试验组小鼠血清GH、ISN、VEGF含量显著升高(P<0.05),小鼠肝中PI3K-Akt信号通路相关基因ERBB2、IRS1、PIK3R1、AKT1、RAF1、MAPK3的转录水平显著升高(P<0.05)。综上表明,BgIGFBP4可通过调控PI3K-Akt信号通路促进牦牛肝细胞增殖、并能促进小鼠生长。这为深入研究IGFBP4在牦牛肝生长发育过程中的作用提供了参考。

摘要： 目的采用人源化肝细胞HepG2细胞与3D细胞培养技术在体外建立3D肝细胞模型,用不同的模式化合物分别建立3D肝细胞微核组学试验方法(cytokinesis-block micronucleus cytome,CBMN-cyt)及3D肝细胞彗星试验方法。方法采用无支架培养方式,选取球体外观、球体内部细胞存活率、Ⅰ和Ⅱ相代谢酶基因表达及肝脏特异性生物标志物表达作为检测指标评估球体生长特性,确定3D肝细胞球体最佳培养条件,并探索3D肝细胞模型用于体外微核组学试验和体外彗星试验的适用性。结果3D肝细胞模型的最佳培养条件为5×10^(3)个细胞/20μL/滴接种,培养7 d。采用体内外微核阳性化合物丝裂霉素C(mitomycin C,MMC)初步建立了3D肝细胞微核组学方法,可成功检测出MMC的遗传毒性和细胞毒性;与2D肝细胞模型结果对比,3D肝细胞模型在检测微核和核芽时具有更高的灵敏度。采用已知体内外彗星试验阳性化合物甲基磺酸甲酯(methyl methanesulfonate,MMS)建立了3D肝细胞彗星试验方法,MMS在低细胞毒性下可使3D肝细胞的尾DNA%显著性增加,且3D肝细胞模型对MMS遗传毒性检测灵敏度高于2D细胞。结论建立的3D肝细胞模型操作简单,成本低廉,并在体外微核试验和彗星试验中表现出较好的灵敏度和特异性,提示3D肝细胞遗传毒性试验方法在早期药物的遗传毒性筛选和追加试验研究中具有良好的应用前景。

摘要： 之前看到这样一条新闻:“12岁男孩超重30斤,患脂肪肝”,据医生介绍:孩子平时爱吃油炸食品和肉制品。那么,脂肪肝仅仅是因为吃得太油腻吗?其实,脂肪肝的发生不仅仅是因为吃得太油腻,还与遗传、代谢性疾病、饮酒等许多因素有关。下面我们先从什么是脂肪肝聊起,为大家逐一解答疑问。常见3类型脂肪肝是指由各种原因导致的肝细胞内脂肪过度堆积而引起的肝脏病变。正常人的肝脏中脂肪含量仅占肝脏总重量的3%~5%,如果肝脏内的总脂肪量蓄积太多,超过5%,或肝组织脂肪化达到50%以上时,就是脂肪肝了。

摘要： 目的：研究大黄素对L-02正常肝细胞增殖、周期及凋亡的影响并初探其机制. 方法：以大黄素为研究对象,L-02细胞为体外模型,采用MTT法检测不同浓度(20、40、60μmol/L)的大黄素对细胞增殖的影响;采用Hoechst染色观察L-02细胞形态学变化;采用FITC AnnexinV/PI双染法,检测不同浓度的药物处理后细胞凋亡情况;采用PI/RNase法检测药物对细胞周期的影响;利用流式细胞仪检测大黄素对L-02细胞内活性氧和线粒体膜电位的影响;采用荧光定量PCR技术检测肝细胞中Sirt1的mRNA表达水平,采用Western Blot检测凋亡相关蛋白Sirt1、Bax、Bcl-2、Caspase-3的表达,探讨大黄素细胞毒性的作用机制. 结果：大黄素抑制L-02细胞增殖,且呈浓度相关性;Hoechst染色发现随着药物浓度升高,细胞形态发生明显变化,出现核固缩,呈亮蓝色,形成凋亡小体等;实验结果表明大黄素能使L-02细胞内活性氧升高,线粒体膜电位水平下降,细胞中谷胱甘肽含量降低;与对照组比较,3个大黄素组L-02细胞出现明显的凋亡细胞,且细胞凋亡率随大黄素浓度增大而逐渐升高;40、60μmol/L大黄素组L-02细胞处于G0/G1期的细胞数减少,S期的细胞增多,表明大黄素能将L-02细胞的细胞周期阻滞在S期.PCR结果显示3个大黄素组能够使Sirt1的mRNA表达水平不同程度降低;Western Blot结果显示3个大黄素组可以不同程度地降低Sirt1、Bax、Caspase-3蛋白的表达,同时升高Bcl-2蛋白的表达. 结论：大黄素在体外对L-02肝细胞的增殖具有明显抑制作用,其机制可能是通过降低Sirt1的表达,使线粒体功能受损,增加活性氧的产生,从而引起细胞凋亡.

摘要： 基因治疗作为未来极具前景的人类疾病治疗手段,在很大程度上依赖于其基因运输系统.但是,在基因运输过程中,会遇到重重障碍,比如无靶向性、运输基因无法释放、细胞毒性等等.为了克服这些困难,设计合成高效的多功能靶向运输载体成为了研究热点.本文设计的材料兼具四苯乙烯的AIE性能、1PEI的阳离子性质和pH缓冲能力、半乳糖的细胞靶向性以及二硫键的还原响应性。实验结果证明了材料的肝细胞靶向基因递送能力，同时还原响应的二硫键能促进基因的释放并提高转染效率。另外，材料还显示了很好的血清稳定性，是一种具有潜在应用价值的新型非病毒基因载体。

摘要： 目的：观察“截断逆挽方”对慢加急性肝衰竭(Acute-on-Chronic Liver Failure,ACLF)大鼠肝组织中周期蛋白D1(CyclinD1)、周期蛋白A(CyclinA)、周期蛋白依赖激酶4(CDK4)、转录因子DP1表达的影响.探讨该方预防性干预ACLF大鼠肝细胞增殖途径作用机制. 方法：SPF级Wistar雄性大鼠150只,随机分为正常对照组、模型组和截断逆挽方组,予人血清白蛋白免疫诱导大鼠形成肝硬化模型,再联合D-氨基半乳糖(D-GalN)与脂多糖(LPS)急性攻击,建立ACLF大鼠模型.截断逆挽方组在急性攻击前给予截断逆挽方连续灌胃3天.各组大鼠分别在急性攻击后4、8、12h取材.蛋白质印迹法(Western Blot)法检测DP1蛋白表达量,实时荧光定量qRT(Quantitative Real-Time,qRT)PCR法检测肝组织中CyclinD1、CyclinA、CDK4mRNA的含量. 结果：与正常组相比,模型4h组CyclinD1、CyclinA、CDK4及DP1表达量升高(P＜0.05);8、12h随着时间的推移表达量逐渐降低.与对应时间点模型组相比,截断逆挽方4h组CyclinD1、CyclinA、CDK4及DP1表达量无明显差异,8h CyclinD1、CyclinA、CDK4及DP1表达量有升高趋势,12h组CyclinD1、CyclinA、CDK4及DP1表达量较模型组明显升高(P＜0.01). 结论：截断逆挽方通过调节E2F1信号通路CyclinD1、CyclinA、CDK4及DP1表达量,促进了肝细胞的代偿性增殖,从而改善肝细胞的大面积坏死,抑制肝衰竭.

摘要： 目的:研究黄芪甲苷(AstragalosideⅣ,ASⅣ)对肝细胞放射损伤的防护机制. 方法:以γ-射线辐照L-02细胞建立辐射损伤模型,分为对照组、黄芪甲苷组、辐照组、黄芪甲苷+辐照组.采用流式细胞术检测黄芪甲苷对辐照后L-02细胞早期凋亡率及细胞周期的影响;以罗丹明123荧光探针检测黄芪甲苷对辐照后L-02细胞线粒体膜电位改变的影响;免疫荧光法观察γH2AX焦点数;通过Western Blot检测细胞中Nrf2、HO-1、NQO1的蛋白表达变化. 结果:辐照后细胞凋亡率随着药物浓度的增加而降低,黄芪甲苷能有效的缓解电离辐射引起的细胞G2期阻滞;黄芪甲苷+辐照组细胞线粒体膜电位均高于辐照组;黄芪甲苷+辐照组γH2AX焦点数明显少于辐照组;辐照组细胞内Nrf2、HO-1及NQO1表达升高,黄芪甲苷+辐照组Nrf2、HO-1及NQO1表达则是随着药物浓度增加而降低. 结论:黄芪甲苷对L-02细胞具有辐射防护作用,其机制可能是通过Nrf2途径来减轻电离辐射所致的损伤.

摘要： 目的：骨形成蛋白受体2(Bone morphogenetic protein receptor type2,BMPR2)属于生长因子受体家族,是骨形成蛋白信号通路中的关键受体蛋白.在前期利用全基因组芯片对人肝细胞株进行辐射相关基因的筛选过程中多次发现BMPR2有异常表达,本研究以人肝细胞株为研究对象,以期为辐射对肝细胞早期损伤机制研究提供依据.rn 方法：利用医用钴-60辐照装置对人肝细胞株进行不同剂量照射，并于照后不同时间点提取RNA和蛋白质样品，应用SYBGreen实时荧光定量PCR和Western blot技术对所提取样品的BMPR2进行剂量和时间效应关系分析。rn 结果：照后6h，BMPR2基因经0.1、0.2、1.0、2.OGyγ射线照射后表达下调，经0.5、4.0GY、射线照射后表达上调，在0.2、1.0、2.0Gy照射剂量点与对照组有统计学差异(p<0.05，p<0.01，p<0.05)：BMPR2蛋白表达量经1.0、2.OGyγ射线照射显著增加(p<0.05)。rn 结论：经不同剂量γ射线照射后不同时间，BMPR2基因与蛋白发生差异表达。

摘要： 目的：文献报道大黄具有肝毒性及致癌性,其中蒽醌类化合物为大黄的主要化学成分.本研究利用高内涵检测技术和碱性彗星电泳研究大黄酸(Rhein)、大黄酚(Chrysophanol)、大黄素甲醚(Physcim)和芦荟大黄紊(Aloe-emodin)对正常人源肝细胞HepaRG的潜在的细胞毒性及DNA断裂作用.rn 方法：高内涵法检测细胞毒性：HeDaRG细胞以3.5×104个/mL密度接种于96板，每孔100μL。细胞达到对数生长期后更换含0.5%DMSO, H2O2（25μM）和含不同浓度的大黄蒽醌类化合物的培养基（大黄酸和大黄酚的处理浓度区间在0.2-50μg/mL，芦荟大黄素和大黄素甲醚的处理浓度区间为0.1～25μg/mL，n=8）继续培养24h。DNA损伤分析：细胞经大黄蒽醌类化合物处理24h后制备单细胞悬液。将细胞与0.5%低熔点胶混合后滴片，玻片置2-8°C避光裂解、解旋，以电压0.7 V/cm，电流300mA的条件电泳20min。rn 结果：细胞毒性：各给药组与0.5%DMSO对照组比较，大黄素甲醚25μg/mL组胞内ROS含忧；量显著升高(P<0.05)，且存在剂量相关性趋势；DNA断裂分析：与阴性对照组比较(1.82±0.04)，大黄酸(6.38±0.04)、大黄酚( 5.76±0.04)和芦荟大黄素(5.85±1.93)的tail% DNA均有显著性升高(P<0.05).rn 结论：4种大黄蒽醌类化合物均可不同程度地对肝细胞产生毒性。其中大黄素甲醚对升高活性氧和线粒体损伤的作用较为显著，芦荟大黄素的毒性主要表现为对肝细胞游离Ca2+水平的调控作用。氧化应激损伤可能是致潜在肝细胞毒性和遗传毒性的重要分子机制之一。

摘要： 超顺磁氧化铁纳米颗粒(SPIONs)广泛应用于磁共振成像、热治疗、靶向治疗、基因传递、细胞标记等方面,但在提高诊断和治疗效率的同时,其生物安全性也日益受到关注.炎症反应是引起纳米材料不良反应的重要原因之一,其中炎症小体在炎症反应中起到关键作用.在本研究中，利用基因芯片发现SPIONs能诱导肝L02细胞中IL-1β、IL-18等相关炎性分子的表达，且30nm SPIONs诱导表达的水平最高，80nm SPIONs次之，120nm SPIONs几乎不诱导。本研究表明小粒径SPIONs能诱导肝细胞和巨噬细胞炎症小体反应，且小粒径SPIONs诱导炎症小体反应同入胞后诱导产生ROS、损伤溶酶体有关。

摘要： 目的：转录因子环磷酸腺苷反应元件结合蛋白(CREB)与下游糖异生靶基因葡萄糖-6-磷酸酶(G6Pase)和磷酸烯醇丙酮酸羧激酶(PEPCK)的作用是决定肝糖异生的关键环节之一.CREB的活性受CREB共激活因子2(CRTC2)激活,CRTC2在细胞核与CREB形成复合体,使CREB活化;活化的CREB在肝脏激活G6Pase和PEPCK,促进糖异生.CRTC2S171磷酸化状态与CRTC2的活性及其在细胞核与细胞质之间穿梭密切相关.在肝细胞,盐诱导激酶1(SIK1)直接磷酸化CRTC2的S171位点并使其转运出核、被隔离在细胞质中,处于未激活状态,不能与细胞核中的CREB相结合,从而有效抑制下游糖异生基因的表达.虽然动物实验表明SIK1调节肝糖代谢,但是,尚未有高糖环境下SIK1基因参与肝细胞糖异生调控的相关报道.因此,本实验采用体外培养的HepG2细胞,构建人SIK1基因的真核表达载体,从细胞和分子水平,对高糖环境下HepG2细胞内SIK1的表达变化、对CRTC2及其下游糖异生通路的调控进行研究.rn 方法：采用人肝癌(HepG2)细胞,高糖组细胞用高糖(培养基中含25mmol/L glucose)培养,设立正常糖组,培养基中含正常浓度的糖(5mmol/L glucose),细胞培养24h后收集细胞,进行后续检测.同时,构建了携带SIK1基因的重组质粒pGV230-SIK1,以及空质粒、即Vector.采用阳离子脂质体转染法转染肝细胞后加入完全培养基培养48h,之后,分别加入正常糖和高糖培养基培养24h,收集细胞,进行后续检测.主要检测指标：RT-PCR检测细胞SIK1mRNA的表达,Western Blot检测SIK1信号通路相关基因的蛋白表达及磷酸化水平;细胞免疫荧光法观察高糖刺激下细胞内生性及转染SIK1的分布及核质转移的情况;免疫化学检测高糖对HepG2细胞内糖异生基因的表达;检测细胞培养液中葡萄糖含量.rn 结果：与正常组相比,高糖6、12、241组SIK1的mRNA表达水平逐渐降低(P＜0.05);SIK1蛋白表达水平和pT182-SIK1磷酸化水平也逐渐降低(P＜0.05);CRTC2蛋白表达水平逐渐增加(P＜0.05);pS171-CRTC2磷酸化水平逐渐下降(P＜0.05);G6Pase和PEPCK蛋白表达水平均增加(P＜0.05);高表达SIK1后,相对于正常细胞对照组和pGV230空载质粒对照组,pGV230-SIK1质粒转染组pS171-CRTC2磷酸化水平增加(P＜0.05);CRTC2蛋白表达水平降低(P＜0.05);G6Pase和PEPCK蛋白表达水平均降低(P＜0.05).rn 结论：①高糖刺激能够抑制SIK1的活性,肝细胞糖异生的通路激活,导致肝细胞糖异生增多;②增加SIK1的表达可减少肝细胞过多的糖异生;③高糖环境SIK1由细胞质向细胞核转移,虽然SIK1进入细胞核,但由于其蛋白表达和反映其活性的pT182SIK1磷酸化水平降到极低,在核内无能调控生糖基因;而高表达SIK1后,SIK1向细胞核转移,入核可磷酸化目的基因,可见pS171CRTC2磷酸化水平明显上调.

摘要： 目的：本实验采用体外培养的HepG2细胞,构建人SIK1基因的真核表达载体,从细胞和分子水平,对高糖环境下HepG2细胞内SIK1的表达变化、对CRTC2及其下游糖异生通路的调控进行研究.rn 方法：采用人肝癌(HepG2)细胞,高糖组细胞用高糖(培养基中含25mmol/L glucose)培养,设立正常糖组,培养基中含正常浓度的糖(5mmol/L glucose),细胞培养24h后收集细胞,进行后续检测.同时,构建了携带SIK1基因的重组质粒pGV230-SIK1,以及空质粒、即Vector.采用阳离子脂质体转染法转染肝细胞后加入完全培养基培养48h,之后,分别加入正常糖和高糖培养基培养24h,收集细胞,进行后续检测.主要检测指标：RT-PCR检测细胞SIK1mRNA的表达,Western Blot检测SIK1信号通路相关基因的蛋白表达及磷酸化水平;细胞免疫荧光法观察高糖刺激下细胞内生性及转染SIK1的分布及核质转移的情况;免疫化学检测高糖对HepG2细胞内糖异生基因的表达;检测细胞培养液中葡萄糖含量.rn 结果：高糖培养HepG2细胞24h，与正常糖组相比，高糖组细胞的SIK1蛋白表达水平降低了77.6%;pT182-SIK1磷酸化水平降低66.3%；高糖组细胞的PEPCK表达明显增高细胞内的SIKI阳性信号明显从细胞质转移到细胞核，且信号表达明显减弱，高糖组细胞培养液中葡萄糖和细胞TG含量显著升高。rn 结论：①高糖刺激能够抑制SIK1的活性,肝细胞糖异生的通路激活,导致肝细胞糖异生增多;②增加SIK1的表达可减少肝细胞过多的糖异生;③高糖环境SIK1由细胞质向细胞核转移,虽然SIK1进入细胞核,但由于其蛋白表达和反映其活性的pT182SIK1磷酸化水平降到极低,在核内无能调控生糖基因;而高表达SIK1后,SIK1向细胞核转移,入核可磷酸化目的基因,可见pS171CRTC2磷酸化水平明显上调.

摘要： 随着生活水平的提高和饮食结构的改变,非酒精性脂肪肝(non-alcoholic fatty liverdisease,NAFLD)已成为仅次于病毒性肝炎的第二大肝病,其是向脂肪性肝炎、肝纤维化、肝硬化等疾病发展中的重要一环.研究发展,在非酒精性脂肪肝中细胞凋亡数量明显增多.通常情况下,受机体内严格调控的凋亡过程,可以维持整个生命过程中机体器官的内在稳定性.但当细胞凋亡调控失衡时,就会导致病变的加速.细胞凋亡是一把双刃剑,这些细胞过度凋亡发生的机制、如何应用这些机制及如何进行抗凋亡治疗,未来都会给非酒精性脂肪肝病的临床诊治带来全新的契机和途径.

摘要： 本发明公开了一种原代肝细胞冻存液、肝细胞冻存的方法及肝细胞复苏的方法，属于原代肝细胞冻存与复苏领域。所述原代肝细胞冻存液，由如下体积百分数的组分组成：45％溶液A、10％‑45％胎牛血清、10％二甲基亚砜和0％‑35％水，所述溶液A由如下组分组成：D‑葡萄糖、羟乙基淀粉、乳糖酸、聚乙烯吡咯烷酮、五水D‑棉子糖、氢氧化钾、磷酸二氢钾、七水硫酸镁、腺苷、还原性谷胱甘肽、别嘌醇、牛磺熊去氧胆酸和甘草酸二氨。本发明还公开了一种肝细胞冻存的方法及肝细胞复苏的方法。本发明的原代肝细胞冻存液可以降低原代肝细胞在冻存过程中的损伤、提高解冻后原代肝细胞活力与贴壁效率，可广泛用于肝脏基础研究与新药研发过程中。

摘要： 本发明涉及一种诱导性多能干细胞定向诱导分化为肝细胞的方法及肝细胞。该方法通过在定向诱导分化的不同阶段加入不同的培养基进行诱导性多能干细胞的定向诱导分化。该方法在操作过程中可以随时观察细胞形态的变化，确保诱导的正常进行，可以快捷且高效地诱导出所需的肝脏前体细胞。该诱导性多能干细胞定向诱导分化为肝细胞的方法采用无饲养层细胞的培养体系，仅通过加入相应阶段的诱导培养基就能获得肝细胞，且经过检测，纯度较高。通过使用上述诱导性多能干细胞定向诱导分化为肝细胞的方法，诱导周期较短、效率高，且得到的肝细胞性能稳定，功能成熟，不存在基质细胞污染的问题。

摘要： 本发明公开了一种原代肝细胞冻存液、肝细胞冻存的方法及肝细胞复苏的方法，属于原代肝细胞冻存与复苏领域。所述原代肝细胞冻存液，由如下体积百分数的组分组成：45％溶液A、10％‑45％胎牛血清、10％二甲基亚砜和0％‑35％水，所述溶液A由如下组分组成：D‑葡萄糖、羟乙基淀粉、乳糖酸、聚乙烯吡咯烷酮、五水D‑棉子糖、氢氧化钾、磷酸二氢钾、七水硫酸镁、腺苷、还原性谷胱甘肽、别嘌醇、牛磺熊去氧胆酸和甘草酸二氨。本发明还公开了一种肝细胞冻存的方法及肝细胞复苏的方法。本发明的原代肝细胞冻存液可以降低原代肝细胞在冻存过程中的损伤、提高解冻后原代肝细胞活力与贴壁效率，可广泛用于肝脏基础研究与新药研发过程中。

摘要： 本发明提供特异性识别形成集落的同时增殖的人肝细胞的单克隆抗体、用该抗体分离人肝细胞的方法、将分离的增殖性人肝细胞分化诱导为功能性人肝细胞的方法。另外本申请的方法提供通过上述方法获得的增殖性人肝细胞和功能性肝细胞，以及含有该细胞的细胞试剂盒以及杂合型人工肝脏。

摘要： 本申请发明提供特异性识别形成集落的同时增殖的人肝细胞的单克隆抗体、用该抗体分离人肝细胞的方法、将分离的增殖性人肝细胞分化诱导为功能性人肝细胞的方法。另外本申请的方法提供通过上述方法获得的增殖性人肝细胞和功能性肝细胞，以及含有该细胞的细胞试剂盒以及杂合型人工肝脏。

摘要： 本发明涉及衍生自HBS细胞的新型肝细胞样细胞群体以及此类肝细胞样细胞在例如药物治疗、药物筛选和毒性测试中的潜在用途。此外，本发明涉及可以具有合适的特征的成肝细胞样细胞，从而使得它们可以用于与肝细胞样细胞相同的应用，且进一步可以用于肝发生例如早期肝发生或肝再生病症的体外研究。根据本发明的肝细胞样细胞和成肝细胞样细胞在基因或蛋白质表达水平上表达药物转运蛋白和/或药物代谢特征。

摘要： 本发明公开了冬眠动物多能干细胞分化为肝细胞的方法，该方法采用ActivinA和CHIR99021分别激活TGFβ和Wnt信号通路，将多能干细胞诱导分化成内胚层细胞,随后以肝细胞生长因子使其向肝样细胞分化，最后以含制瘤素M及地塞米松的培养液促进其成熟。该方法能够有效缩短多能干细胞分化成肝样细胞的时间，提高诱导分化效率，并能够实现冻存复苏，可持续传代，为研究冬眠模式动物冷适应‑复温、缺氧‑复氧等实验模型中的代谢调控机制提供了工具基础。本发明还提供一种利用上述肝细胞筛选为体外冷保存人体细胞提供保护的代谢产物的方法。

摘要： 通过本发明的肝细胞分化诱导方法，效果在于，可有效地获得比现有技术多的数量的肝细胞。为此，尤其提出了一种来源于人类干细胞的肝细胞分化方法，其特征在于，作为肝细胞分化诱导前步骤包括:A步骤，通过三步骤用TrypLE

摘要： 本发明涉及一种诱导性多能干细胞定向诱导分化为肝细胞的方法及肝细胞。该方法通过在定向诱导分化的不同阶段加入不同的培养基进行诱导性多能干细胞的定向诱导分化。该方法在操作过程中可以随时观察细胞形态的变化，确保诱导的正常进行，可以快捷且高效地诱导出所需的肝脏前体细胞。该诱导性多能干细胞定向诱导分化为肝细胞的方法采用无饲养层细胞的培养体系，仅通过加入相应阶段的诱导培养基就能获得肝细胞，且经过检测，纯度较高。通过使用上述诱导性多能干细胞定向诱导分化为肝细胞的方法，诱导周期较短、效率高，且得到的肝细胞性能稳定，功能成熟，不存在基质细胞污染的问题。

摘要： 本发明提供由胚胎干细胞向肝细胞的分化诱导方法，其特征在于为了获得功能完整的且可大量提供的安全的肝细胞，在dHGF的存在下培养胚胎干细胞。而且，还提供由胚胎干细胞向肝细胞的分化诱导方法，其包括：(a)形成胚胎干细胞的胚状体的步骤，和(b)在缺失型肝细胞增殖因子的存在下培养所获得的胚状体的步骤。